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7 - LES FACTEURS ANTI-BACTERIENS

STERILISATION - DESINFECTION - CHIMIOTHERAPIE.

7.1. Notions Préliminaires

7.1.1. Mort Bactérienne

Comme pour les organismes supérieurs, la mort est une réalité dont la définition est variable selon les critères interrogés. En effet, toutes les manifestations vitales ne cessent pas simultanément chez les bactéries ; comme toute cellule, la bactérie meurt par degrés, l'altération ou l'arrêt d'une fonction ou d'une chaîne enzymatique entraînant progressivement celle des autres. Il est évident qu' une cellule bactérienne dont la structure et l'équilibre biochimique ont été profondément altérés, aura perdu toute capacité de manifestation vitale tant métabolique que reproductive. Mais on parle aussi de "mort" bactérienne lorsque des bactéries, physiquement intactes, sont devenues incapables de se multiplier bien que conservant un certain taux d'activités métaboliques. Cet état est estimé de façon empirique par l'ensemencement de ces bactéries sur un milieu de culture solide elles ne doivent pas donner naissance à des colonies. Mais le résultat obtenu, positif ou négatif, dépend du choix du milieu et des conditions

a) une culture peut paraître "morte" à 99 % sur un milieu (c'est-à-dire que seule une

bactérie pour cent formera colonie) et "vivante" à 100 % sur un autre milieu lui convenant mieux.

b) l'inoculum peut contenir une substance inhibitrice s'opposant à la multiplication

bactérienne des survivants. C'est le cas fréquemment des produits pathologiques prélevés chez des sujets traités par des antibiotiques. Par dilution, on pourra souvent estomper cette

inhibition.

c) des bactéries irradiées par U.V. et ensemencées immédiatement sur un milieu,

paraîtront mortes à 99,99 %. Mais si on les incube préalablement pendant 20 minutes dans

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un tampon adéquat, leur mort se limitera à 10 % des individus. Les 90 % de bactéries

"revivifiées" auront eu le temps de réparer les lésions provoquées par l'irradiation U.V.

d) Les conditions d'incubation sont aussi à prendre en considération, et notamment

sa durée : une culture peut posséder des bactéries dans un état de paresse métabolique telle

qu'il sera nécessaire d'attendre un temps assez long pour lui permettre de donner naissance

à de nouvelles générations. On ne doit donc pas décider trop tôt de la non-viabilité de ces

germes. C'est le cas des contrôles effectués sur du matériel soumis à l'effet de radiations

ionisantes.

7.1.2.

Stérilité.

L'état de stérilité consiste en l'absence de tout micro-organisme vivant (virus,

bactéries, champignons et leurs spores), pathogènes ou non a stérilité est donc un état

absolu. Un matériel ne peut pas être "relativement" stérile : il l'est ou il ne l'est pas.

Toutefois, l'absence de manifestations reproductrices de la part des micro-organismes suffit

pour engendrer la stérilité du matériel; cela n'implique donc pas que ce matériel ne puisse

encore contenir des bactéries douées de certaines activités métaboliques.

Quel que soit le procédé utilisé pour stériliser, (chaleur - irradiations - substances

chimiques), la survie des bactéries décroît, au cours du temps d'exposition à un facteur anti-

bactérien, selon une courbe (courbe d'inactivation) qui transposée en coord. semi-

logarithmiques, se résout en une droite dont la pente est caractéristique du facteur utilisé.

Ex. : dans le graphique ci-contre

on peut dire que

- après 60 min., il subsiste 1 bact./ml

- après 70 min., il subsiste 10-1 - 1 bact./IO ml

- après 80 min., il subsiste 10-2 - 1 bact./IOO ml

- par extrapolation, après 120 min., il subsiste 10-6 - 1 bact./l.000 1.

30

&O

Dès lors, quand pourra-t-on parler de stérilité ?

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Le contrôle des produits dits "stériles" devra en tout cas comporter l'examen d'un échantillon suffisamment large et représentatif. Il faudra donc tenir compte de l'importance de la population bactérienne dans le matériel à stériliser, et pour une même densité de population par unité de volume, augmenter le temps d'application de l'agent stérilisant en fonction du volume à stériliser. On ne stérilise pas dans les mêmes conditions 10 ml ou 5 litres de milieu. La pente obtenue s'appelle le "taux de mortalité" d'une bactérie donnée et caractérise sa sensibilité à l'agent stérilisant. Elle n'est valable que pour cette bactérie. Pour déterminer les conditions de stérilisation d'un substrat, il faut donc connaître non seulement l'importance de la population initiale, mais aussi le "taux de mortalité" de sa composante la plus résistante. En pratique, on table sur la présence des spores les plus résistantes et on emploie comme conditions de stérilisation, celles qui assurent leur destruction.

7.1-3. Effet bactéricide ou Bactériostatique

1° Un facteur anti-bactérien est dit bactériostatique lorsqu'il crée un état d'inhibition momentanée de la multiplication bactérienne. La capacité de multiplication n'est pas disparue et peut se manifester à nouveau lorsque les bactéries sont soustraites à l'action de ce facteur. Ces bactéries sont dites revivifiables.

2° Un agent bactéricide est celui qui a la propriété de tuer les bactéries (au sens défini plus haut) de façon irréversible. Dans certains cas, il provoque la lyse bactérienne, mais certains bactéricides laissent les bactérie! physiquement intactes et même capables d'un reliquat d'activité métabolique à l'exclusion de celle qui conduit à leur multiplication. Les effets bactériostatiques et bactéricides sont souvent des étapes graduées de l'activité antibactérienne d'un même facteur selon l'intensité de son action (dose, durée d'action, etc.).

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7.2. Modes d'action des agents anti-bactériens

La disparition des bactéries d'un milieu peut s'obtenir par soustraction des corps bactériens eux-mêmes ou par leur destruction plus ou moins prononcée.

7.2.1.

Procédés de soustraction des corps bactériens

Filtration stérilisante

La filtration, qui n'est pas bactéricide par elle-même, est largement utilisée pour la stérilisation de liquides thermolabiles. Par ce procédé, les microorganismes sont retirés du milieu qui est rendu stérile; en outre, des exotoxines bactériennes (ex. : toxine tétanique) peuvent de cette manière être séparées des bactéries qui les ont produites.

Deux types de filtres sont utilisés :

a) les"filtres-tamis", dont les pores sont de calibre régulier et de dimensions telles

que les bactéries soient retenues. Les plus connus sont les filtres Millipore, faits d'un ester

de cellulose. Les porosités stérilisantes sont celles de 0,22 et de 0,4 . Les porosités supérieures à 0,4 servent de filtres clarifiants, destinés à retirer les particules en suspension, mais ne sont pas stérilisantes.

b) les "filtres-matelas" ou "en profondeur", qui sont de différentes compositions

- filtres Seitz, composés par un assemblage de filtres d'asbeste et de cellulose liées par un ciment

- verres frités, faits de granulations de verre fondues en masse

- bougies de Kieselguhr, réalisées par une compression et liaison de corps de diatomées.

Ces filtres-matelas forment des anfractuosités de calibre non-contrôlé, le plus souvent supérieur au diamètre des bactéries. Celles-ci y sont principalement retenues par

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adsorption au cours de leur passage dans l'épaisseur du filtre. En effet, la surface pariétale des bactéries est porteuse de charges négatives, tandis que les surfaces inertes, (et les fibres de ces tamis) sont chargées positivement. La valeur stérilisante de ces filtres sera donc limitée et dépendra de la vitesse de passage des bactéries (danger de filtrer un liquide sous une pression excessive) et de leur saturation (efficacité annulée en cas de trop forte charge bactérienne du liquide filtré).

2° - Réduction du nombre de bactéries par centrifugation

De nombreux liquides biologiques, tels que le lait, se conservent peu de temps à cause de la pullulation bactérienne dont ils sont l'objet. Une amélioration de leur conservation peut s'obtenir en les soumettant à une centrifugation ménagée, qui sans en altérer la composition, en retirent un certain nombre de bactéries et abaissent leur niveau de contamination. Un compromis doit être opéré entre la vitesse de centrifugation maximale nécessaire pour en retirer le maximum de bactéries et celle minimale à ne pas dépasser afin de ne pas débarrasser le lait de ses globules graisseux ni de ses micelles de caséine. Un lait ainsi traité est dit "bactofugé".

7.2.2. Altération de l'intégrité physique ou métabolique des bactéries

De

nombreux

agents

physiques

bactérienne à différents niveaux

a) Coagulation des protéines

ou

chimiques

peuvent

agir

sur

la

viabilité

Les protéines de la cellule bactérienne existent dans le cytoplasme à l'état colloïdal dispersé. Si elles sont altérées, elles peuvent s'insolubiliser et coaguler. Les enzymes, de nature protéique, sont dès lors non-fonctionnelles.

b) Altération de la membrane cytoplasmique ou de la paroi

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La membrane est une barrière sélective ; si elle est perturbée, le contenu cellulaire va être modifié de façon importante par entrées et sorties anormales. Une dénaturation ou une altération des protéines et lipides de la membrane cytoplasmique est létale pour la bactérie. De même, la désorganisation de la structure pariétale, qui est le corset de la bactérie, entraîne la lyse osmotique de celle-ci (effet du lysozyme).

c) Oxydations et blocage des groupements sulfhyfryles libres

Souvent des enzymes ne sont actives que sous leur forme réduite leur oxydation correspond à un arrêt de leur fonction. C'est en particulier le cas des enzymes oxydo- réductrices de la chaîne respiratoire : un agent oxydant qui augmente le potentiel redox du milieu cellulaire, les maintiendra dans leur forme oxydée et ne permettra plus leur accès à

la forme réduite, arrêtant de ce fait le transport d ' hydrogène ; ainsi, le Fer des cytochromes demeurera bloqué dans sa forme Fe + De même, de nombreux enzymes possèdent des -SH (cystéine) qui doivent demeurer libres et réduits pour l'activité enzymatique. Les agents oxydants, qui transforment ces -SH en -S-S-, et les métaux lourds, qui se combinent à ces -SH, seront des inhibiteurs de la fonction enzymatique, (sans compter que souvent, ils coaguleront les protéines par formation de -SS- intercaténaires)

R-SH

+

HgCl 2

R-S

Hg

+ 2 HCl

R-SH

R-S

d) Inhibition de certaines enzymes

1. Effet sur l'holoenzyme

L'agent antagoniste peut être une substance qui possède une affinité pour un site essentiel d'un holoenzyme. En s'y combinant, il l'empêche de si attacher à son substrat ; ce sera le cas de substances qui modifient la conformation allostérique de l'enzyme en se liant à son site inhibiteur.

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Certaines substances se combinent avidement à l'ion métallique qui réunit de nombreux apoenzymes à leurs coenzymes, empêchant de la sorte la constitution de l'enzyme intacte. Ou bien elles se combineront à l'ion métallique qui fait partie de certaines coenzymes et bloqueront l'activité de celles-ci. Ainsi : le CO et les cyanures (-C=-N) suppriment la fonction respiratoire des cytochromes en se combinant au Fer des porphyrines.

e) Antagonisme chimique

Certaines substances sont des analogues d'ac. aminés ou de nucléotides, et conduisent à la formation de protéines ou d'ac. nucléiques anormaux et fonctionnellement déficients.

F Lésions des acides nucléiques

Les radiations ionisantes altèrent le DNA de façon irréversible pour autant que leur intensité et leur durée dl application soient suffisantes. Il en est de même des radiations ultraviolettes et de certaines radiations de la lumière visible, surtout si une substance photosensibilisatrice (dérivés d'acridine) s'est liée au DNA.

7.3. Les Facteurs antibactériens de nature Physique

Ne seront envisagés dans ce chapitre que les facteurs physiques auxquels on a d'habitude recours pour la stérilisation, en négligeant les facteurs physiques qui sont capables d'atteindre l'intégrité bactérienne, mais dont les effets sont irréguliers et difficiles à prévoir avec certitude, tels le froid et la dessiccation qui ont été mentionnés au chapitre traitant de la conservation bactérienne.

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La chaleur est nettement bactéricide; son effet s'accuse progressivement au delà de l'optimum thermique de la bactérie. Les hautes températures appliquées suffisamment longtemps, provoquent indubitablement la coagulation des bactéries et la destruction de leurs membrane et paroi. Mais les températures plus basses, qui ne détruisent que les germes les plus sensibles, ne les détruisent pas tous. Certains sont revivifiables si on les place en tampon additionné d'ac. citrique ou pyruvique. Ce qui laisse penser que la chaleur agit, dans ces conditions, de façon réversible sur quelque réaction métabolique clef. L'action bactéricide de la chaleur est conditionnée par certaines influences :

a) La durée d'action

Beaucoup de bactéries surtout parmi les pathogènes sont tuées au BM

à 56° au bout de 1 heure

à 60° au bout de 10 minutes

à 70° au bout de 5 minutes

à 80° au bout de une minute

Ainsi, la pasteurisation du lait est obtenue soit par chauffage pendant 30 minutes à 63° - 66° C (ancienne méthode), soit pendant 20 secondes à 72° C (méthode "flash"). Cette pasteurisation détruit la plupart des bactéries pathogènes non-sporulantes, pour autant qu'elles ne soient pas trop nombreuses dans le lait.

b) L'humidité

La chaleur humide (vapeur d'eau saturée) est un agent stérilisant beaucoup plus efficace que l'air chauffé. La raison en est que la conduction de la chaleur est moins rapide dans l'air que dans la vapeur, et donc que les bactéries en état de dessiccation pourront plus facilement survivre à la chaleur sèche qu'à la chaleur humide. Lorsque la vapeur atteint une surface sèche du matériel, elle s'y condense et libère sa chaleur latente ; cette condensation se poursuit jusqu'à ce que le matériel ait atteint une température égale à celle de la vapeur d'eau. En outre, la vapeur pénètre plus facilement que l'air chaud au travers des pores du matériel : bouchons d'ouate, tampon de papier, etc.

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C'est pourquoi il faut veiller à avoir une ambiance de vapeur pure, sans présence de poches d'air qui inhiberait cette pénétration. Lorsque la vapeur d'eau est portée à une pression supérieure à la pression atmosphérique, elle atteint une température supérieure à I00°C : ces conditions sont remplies dans un Autoclave. Les milieux qui ne s'altèrent pas par chauffage sont autoclaves d'ordinaire à 121° C. Les milieux qui supportent difficilement la chaleur, (milieux sucrés, etc. ) sont autoclavés à 110°C, ou 115°C, en augmentant proportionnellement le temps d'autoclavage. Les instruments et récipients secs seront stérilisés soit par autoclavage, soit par chaleur sèche dans un four (180° C pendant 30' à 1 h.). Mais des solutions ou des récipients mouillés ne seront jamais placés dans un four. Conditions de stérilisation comparées dans four et autoclave

c) La répétition

C'est le procédé de la tyndallisation ; il consiste à exposer le matériel à stériliser pendant 20 à 30 minutes à une température de 100° C au cours de trois jours consécutifs. Son succès dépend de la germination des spores qui sont choquées et germent suite au premier chauffage ; c'est pourquoi il n'est applicable qu'aux milieux de culture, qui offrent aux spores des conditions propices à leur reviviscence, mais non aux solutions sucrées ou salines simples. Il a l'avantage de ne pas détruire les substances qui ne supportent pas les températures élevées.

7.3.2. Les radiations

1°) Radiations ultraviolettes

Les radiations qui traversent la cellule ne seront capables de produire des modifications chimiques que pour autant quelles soient absorbées. La lumière visible (longueur d'onde 4000 - 7500 A) n'est absorbée que par peu de composants cellulaires, excepté chez les photosynthétiques, et a donc peu d'effet. Il en va de même des radiations U.V. de 4000 à 3300 A. Mais les U.V. de plus courtes longueurs d'onde sont fortement

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absorbés par les protéines et les ac. nucléiques ; leur pouvoir bactéricide augmente tandis que leur longueur d'onde diminue. 2.900 Å = radiation la plus active du spectre solaire 2.400 Å - 2.800 Å = radiations émises par les lampes "germicides".

C'est par sa composante ultra violette que la lumière solaire est nuisible pour les bactéries. Cette nocivité est démontrée par l'expérience de Buckner :

L'effet germicide de la lumière solaire sera donc fonction de sa richesse en U.V. de courtes longueurs d'onde ; c'est pourquoi elle sera maximale en certaines localisations (mer, montagne). Le mode d'action des U.V. est encore imprécisé. a) il est certain qu'ils agissent surtout au niveau des ac. nucléiques, en réalisant des dimères de pyrimidine. Rappelons que les bactéries possèdent des systèmes de réparation de cette lésion, et qu'un de ces systèmes est activé par la lumière visible (photoréactivation). Par conséquent, l'action antibactérienne d'une lampe germicide sera plus intense dans l'obscurité que pendant le jour.

b) les U.V. pourraient aussi agir sur le milieu de culture (production d'ozone, d'H 2 O 2 , etc.). C'est pour éviter cet effet qu'il faut maintenir à l'abri de la lumière la réserve de milieux prêts à l'emploi les recouvrir d'un écran en papier suffit à les protéger.

2°)

Radiations ionisantes

Elles comprennent des ondes électromagnétiques de très courtes longueurs d'ondes et de haute énergie : rayons X et rayons et des particules sub-atomiques de grande vitesse : électrons, protons, neutrons. Par leur effet ionisant sur les constituants cellulaires qu'elles rencontrent, ces radiations entraînent des perturbations des fonctions vitales Seuls les rayons sont utilisés pour la stérilisation industrielle de matériel "à usage unique" (seringues, sondes, etc.) en vertu de leur grand pouvoir pénétrant et de l'absence de production de radiations secondaires dans les matières traitées. Ils sont le plus souvent émis par une source de cobalt radioactif.

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La sensibilité des cellules à ces radiations ionisantes est très variable. LD50 est :

pour les mammifères E. coli Micrococcus radiodurans

< 1.000 roentgens 10.000 " "

750.000

Ainsi, la

On la soumet au bombardement en même

temps que les objets à stériliser. L'inactivation de cette bactérie garantit la stérilité du matériel soumis aux rayons

Cette bactérie est la plus résistante.

7.3.3. Ondes sonores et ultra-sons

Produisent une succession rapide de compressions et de décompressions du liquide de suspension, entraînement l'éclatement des bactéries. Leur mise en application existe pour le nettoyage de verrerie infectée et pour la préparation d'extraits bactériens.

7.4. Les agents antibactériens de nature chimique

7.4.1. Désinfection, antisepsie et chimiothérapie

Si la stérilisation consiste en une disparition complète de toute bactérie capable de multiplication dans le milieu "stérilisé", la désinfection ne représente que la disparition des formes végétatives des bactéries pathogènes, avec simple réduction du nombre des autres bactéries saprophytes et, le plus souvent, conservation des formes sporulées. D'ordinaire, la désinfection est pratiquée au moyen d'agents chimiques et est appliquée à des objets médicaux (ex. : thermomètres) ou des locaux (ex. : salles, étables) en vue d'enrayer la dissémination de bactéries pathogènes. Les substances capables d'activité bactéricide sur les bactéries pathogènes, sont dénommées :

antiseptiques, si leur usage est toléré au contact des tissus de l'organisme. Elles sont appliquées sur la peau et les muqueuses sans produire d'effets toxiques.

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désinfectants, si elles sont trop toxiques pour !être appliquées directement sur les tissus. Leur usage est limité à l'extérieur. Une même substance sera désinfectante ou antiseptique selon la concentration utilisée. On dénomme "agents chimiothérapeutiques" une substance qui possède une toxicité suffisamment basse que pour pouvoir être utilisée par voie générale pour le traitement des maladies infectieuses. Ce groupe comprend principalement les antibiotiques. La plupart des chimiothérapeutiques sont des bactériostatiques, qui inhibent la multiplication de l'agent infectieux et permettent aux défenses (tant non spécifiques que spécifiques) de l'organisme de ne pas être débordées par lui et de l'éliminer.

7.4.2. Facteurs conditionnant le Pouvoir Antibactérien

l°) L'action d'un désinfectant est, avant tout, fonction simultanée de deux facteurs :

sa concentration et sa durée d'action selon la formule

C n x t = K

C = concentration t = temps nécessaire pour inhiber une fraction donnée du nombre de bactéries n et K = constantes caractéristiques de

Cela signifie que, pour le cas d'un antiseptique pour lequel n = 5 (ex : phénol), le doublement de sa concentration réduit à 1/32 le temps nécessaire pour un même taux d'inactivation des bactéries.

p. ex.

1 5 x 60 min. = 2 5 x X

c

n

1

x t 1 = c

n

2

x t 2

X =

1 5 x 60

2 5

=

60

32

2°) Facteurs dépendant des bactéries

a) les diverses espèces accusent de grandes différences de sensibilité

Ex.

azide de sodium = inhibe les Gram - mais pas les streptocoques.

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cristal de violet = inhibe les Gram + mais pas les Gram - .

b) le nombre de bactéries : plus il est élevé, plus il faudra du temps pour les inhiber totalement

Ex.

: pour une destruction de 90 % par minutes,

on aura après

1

2

3

4

5 min.

au départ de 100.000 au départ de 10.000

10.000

1.000

100

10

1

1.000

100

10

1

c) L'état biologique des bactéries.

La résistance d'une même espèce bactérienne varie en fonction de son âge, des conditions de culture, etc. Des bactéries peuvent même devenir résistantes à des ?? qui devront dès lors être utilisés à concentration de plus en plus fortes. Pareille résistance adaptative peut être provoquée par différents moyens

- réduction de la perméabilité de la membrane

- formation accrue du métabolite avec lequel l'antiseptique est en compétition

- mise en place d'une chaîne métabolique de remplacement, etc.

3°) Facteurs dépendant de l'environnement

a) Protection par des protéines ou des fragments tissulaires

Les bactéries présentes dans le pus, le lait, le sang, les fèces, sont nettement protégées contre l'action des désinfectants, notamment par la formation d'une couche insoluble formée par la coagulation des protéines. Des détergents, pour leur action pénétrante, sont souvent associés aux désinfectants. Dans la mesure du possible, les surfaces à désinfecter doivent être préalablement nettoyées.

b) la chaleur

Elle renforce l'action des antiseptiques sans doute en activant le métabolisme des

bactéries, ce qui rend celles-ci plus vulnérables. Ex. : phénol 3 % tue Vibrion cholérique

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en 24 h

à 25°C

en 6 à 8 h.

à 36°C

c) Le pH est un facteur influençant l'action de certains désinfectants. De même que la dureté de l'eau. L'influence de ces facteurs environnementaux est la raison pour laquelle il y a fréquemment discordance entre la valeur antibactérienne d'une substance chimique, déterminée par des tests de laboratoire, et son efficacité réelle sur le terrain, dans certaines circonstances. Notamment, l'efficacité in vivo d'un antiseptique est sans rapport avec les études faites in vitro.

7.4.3. Détermination pratique de l'activité antibactérienne

a) Étalonnage in vitro d'un désinfectant

La méthode le plus couramment utilisée est celle de Ridéal et Walker, qui détermine le coefficient phénol, c'est-à-dire l'activité par rapport à celle d'une solution phénolique étalon.

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Exemple :

Substance testée

Dilution

Durée de contact in vitro

 

5 min.

10 min.

 

1/300

+

+

1/400

0

+

1/500

0

0

Phénol

1/50

+

+

1/100

0

+

1/200

0

0

L'activité de cette substance à la dilution 1/400 est équivalente à celle du phénol dilué 1/100. Le coefficient phénol dans ce cas sera : 400 : 100 - 4 Ce coefficient phénol n'est toutefois valable que pour les bactéries utilisées dans le test et dans les conditions du test; aucune généralisation n'est autorisée à partir de ce test.

b) Détermination in vivo du pouvoir antiseptique

L'activité pratique d'un antiseptique peut !être estimée de la façon suivante :

la peau d'animaux de laboratoire est épilée puis recouverte d'une suspension de bactéries pathogènes; elle est ensuite traitée par l'antiseptique à tester. Des prélèvements cutanés sont alors effectués après un temps donné et inclus dans le péritoine d'autres animaux, dont le taux de mortalité sera déterminé par rapport à des témoins recevant des prélèvements infectés et non traités. Outre son efficacité, il faut s'assurer de l'absence d'action toxique et pharmacodynamique de l'antiseptique. La détermination du degré d'absorption et de toxicité systémique et locale est indispensable; ces essais portent sur des cultures de tissus ou des peaux épilées. Souvent, l'activité antiseptique va de pair avec l'agressivité pour la peau, entraînant facilement sa destruction, le tissu mort constituant un milieu de culture favorable au développement bactérien.

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7.4.4. Principaux agents désinfectants et antiseptiques

a) Les solvants des lipides

Il s'agit principalement des alcools. Les deux alcools les plus couramment utilisés tant pour la désinfection que pour l'antisepsie sont les alcools éthylique et isopropylique : ils ne sont pas toxiques en application externe. Quant à l'alcool méthylique, il est extrêmement dangereux et ne devrait jamais entrer en contact avec la peau. L'alcool éthylique a une action très complexe : il réduit la tension superficielle, dissout les lipides et coagule les protéines, autant de propriétés qui contribuent à son action antimicrobienne. Toutefois, c'est également un puissant déshydratant, effet qui tend à neutraliser l'efficacité des précédents; c'est pourquoi on l'utilise en solution aqueuse à 70 %, les solutions plus concentrées et l'alcool "absolu" étant moins actifs. Toutefois, il faut savoir que l'alcool n'a pas d'action sporicide, et qu'il n'est donc pas indiqué pour la stérilisation d'instruments ou de matériel de suture (danger dl infections clostridiennes). Les autres solvants des lipides sont rarement utilisés, car ils sont peu efficaces et trop volatiles : acétone, éther, chloroforme.

b) Le Phénol et ses dérivés

Le phénol fut l'antiseptique utilisé par Lister dans sa bataille pour l'antisepsie en chirurgie; cette substance a dès lors occupé une place historiquement prépondérante parmi les désinfectants. Certains des nouveaux désinfectants modernes sont encore des dérivés de phénol. Ils agissent principalement sur les membranes, dont ils perturbent l'ordonnance par leur radicaux benzéniques hydrophobes mais ce n'est pas là leur seul mode d'action ; en effet, à concentration plus faible, leur action doit être différente puisqu'elle est réversible par adjonction d'extrait de levure.

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Le phénol et ses dérivés sont bactéricides à forte concentration, et bactériostatiques à concentration plus faible, mais ils ne sont pas sporicides, quelle que soit leur concentration. Il est à prendre en considération que certaines bactéries (ex:Staph. aureus) peuvent devenir résistantes à l'action des phénoliques. Depuis Lister, le phénol est utilisé comme antiseptique à la concentration de 1 à 2 %. Il est aussi employé en conjonction avec la chaleur (B.M. 60°C) pour la préparation des vaccins tués (Stockvaccins et Autovaccins). Certaines préparations commerciales possèdent un mélange d'antiseptiques, parmi lesquelles du phénol (ex. : Tercinol). Les dérivés phénoliques sont rarement utilisés comme antiseptiques; leur emploi est surtout réservé à la désinfection. En effet, ils sont souvent toxiques pour les tissus. De plus, le fait qu'ils sont d'ordinaire mélangés à des détergents leur apporte des propriétés tensioactives; ce sont des surfactants : ils maintiennent un film sur les surfaces inertes, laissant après usage une "désinfection résiduelle" plus ou moins durable (quelques heures) que ne réalisent pas les désinfectants volatiles tels les halogènes ou les alcools ; cette qualité est surtout appréciée pour la désinfection chirurgicale. Les dérivés phénoliques sont de deux types :

- les crésols, qui forment des suspensions colloïdales dans l'eau (créoline) - les chloro-phénols, ils sont moins toxiques, et moins irritants que le phénol, mais également moins actifs et plus facilement inactivés par les matières organiques. (ex. : la chlorhexidine (Hibitane®, Sterilon®) Certains sont des bis-phénols chlorés, tels l'hexachlorophène, qui est incorporé dans les savons, les talcs, les cosmétiques. D'autres sont des chloroxylénols , tels le Dettol®, largement utilisé en désinfection et antisepsie.

c) Les métaux lourds et leurs dérivés

Des traces de certains métaux lourds (Zinc, Fer, Cuivre, etc.) sont indispensables pour la croissance bactérienne de nombreuses bactéries; ils ont un effet OLIGODYNAMIQUE qui peut se démontrer en plaçant un petit disque de métal en question sur la surface d'un milieu exempt de ce métal et fraîchement inoculé avant d'être coulé en boite de Pétri : la diffusion de traces du métal dans le milieu crée un gradient dont

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la concentration aux abords immédiats du disque, quoique faible, est cependant bactériostatique (pas de colonies dans une zone autour du disque), mais cette zone inhibitrice est entourée d'une bordure où les traces de métal sont optimales, et où les colonies bactériennes sont beaucoup plus denses et plus grandes que sur le reste du milieu.

L'effet antimicrobien des métaux lourds à partir de certaines concentrations semble dû à leur effet inactivateur des enzymes, par liaison à certains radicaux protéiques, en particulier les radicaux SH. A plus forte concentration, les métaux lourds entraînent de ce fait une précipitation des protéines, par modification de leur charges ionisées. Toutefois, l'action désinfectante du Cuivre, Fer, Zinc, Argent, est relativement faible et est remplacée par d'autres agents actuellement. D'autres métaux lourds (mercure, Arsenic) sont trop toxiques pour être utilisés comme antiseptiques, à moins d'être sous forme de composés organiques qui en limitent la toxicité.

Arsenic: a été utilisé sous forme d'arsphénamine pour le traitement de la syphilis, avant l'avènement des antibiotiques Mercure: Protéine-SH + Hg Prot.-S - Hg - S - Prot. Le mercure inorganique est toxique et irritant pour les tissus; en outre, il est facilement inactivé par les matières organiques, d'où perte de l'activité antibactérienne au contact du sang, sérum, etc.; dès lors, il n'est utilisé que comme désinfectant sous forme de Sublimé Corrosif (HgCl 2 ) à la concentration de 1/1000 à 1/5000. Toutefois, il forme alors facilement un coagulum à la surface des particules de mucus, de fèces, de tissus excisés, à l'intérieur desquelles les bactéries sont protégées de son action. Certains dérivés mercuriels organiques, moins toxiques et irritants sont encore couramment utilisés comme antiseptiques:

- le mercurochrome, antiseptique et désinfectant cutané de faible efficacité, de toxicité non négligeable et responsable de sensibilisations.

- le merthiolate, ou thiomersal utilisé comme antiseptique dans les produits biologiques tels que sérums et vaccins. - le Merfen®, borate de phénylmercure.

7-19

d) Les Halogènes (chlore et iode) et leurs dérivés

1) Chlore et Hypochlorites

Le chlore est un désinfectant puissant, actif à concentration appropriée contre la plupart des micro-organismes, y compris les spores et les virus. Le chlore gazeux (Cl 2 ) est dangereux en inhalation. Il est uniquement employé pour chlorer les eaux de boisson, de bassin de natation ou les effluents de station d'épuration. Il s'agira selon le cas de chlore CL 2 ou . d'hypochlorites de soude ou de calcium. La réaction de ces substances avec l'eau sera:

Cl 2 + H 2 O HClO + H + + Cl -

NaClO + H 2 O HCLO + Na + + OH-

(1)

(2)

Dans les deux cas, l'acide hypochloreux se dissociera en ion hydrogène et ion hypochlorite

HClO CIO - + H +

(3)

L'action désinfectante du chlore dans une eau sera fonction de son aptitude à fournir de l'oxygène (par l'intermédiaire de HClO et CIO - ) aux substances réductrices, bloquant ainsi le métabolisme bactérien; de plus, le Cl - se fixera sur les groupements cationiques des protéines membranaires et annulera leur fonction biologique. La prédominance de l'une ou l'autre des réactions (1) ou (2) ou (3) dépend du pH de

l'eau.

Une partie du chlore actif libre réagit avec les matières organiques et avec l'ammoniaque du milieu, pour former des chloramines :

R - NH 2

NH 4 OH

+ HClO R - NHCl

R - NCl 2

+ HClO NH 2 Cl NHCl 2 NCl 3

monochloramine di

tri

7-20

Le chlore actif ainsi combiné est appelé "chlore actif combiné" dont le pouvoir oxydant utilisable est diminué. La proportion de chlore combiné varie selon les conditions :(voir graphique en annexe)

a) Pour de faibles quantités de chlore ajoutées à une eau riche en ammoniaque et en

matières organiques, la totalité du chlore se combine d'abord avec les composés minéraux réducteurs et certaines matières organiques (zone 1); il n'y a pas de chlore actif dans l'eau et celle-ci n'est pas stérilisée

b) pour des quantités de chlore plus importantes, il y a formation de chloramines

conservant un certain pouvoir oxydant; on détecte du chlore actif combiné et l'eau possède une faible protection (zone 2).

Cependant , les chloramines formées ont une odeur désagréable.

c) Si on augmente encore la quantité de chlore introduite, on constate que la teneur

en Chlore actif combiné passe par un maximum et que des ajouts supplémentaires de chlore provoquent une diminution de la teneur en Chlore actif combiné (zone 3). Ce phénomène rend compte de la saturation de plus en plus poussée des chloramines en chlore, et de leur complète destruction sous l'action d'un excès d'ac. hypochloreux, d'où la baisse du Chlore actif combiné

d) A partir de cette quantité de chlore ajoutée, toute addition supplémentaire demeurera sous forme de chlore résiduel libre; le point à partir duquel le chlore actif reste libre est appelé le "break point" ou point critique C'est à partir de ce point que l'activité chimique est maximale. Une chloration de l'eau devra y laisser un taux de chlore résiduel libre de l'ordre de 0,2 mg/litre. La stérilisation de l'eau ne sera toutefois effective que si le temps de contact avec le chlore est au minimum de 10 à 15 minutes. L'action stérilisante du chlore ne sera réelle que si le pH de l'eau permet sa transformation en HClO et ClO - , c'est-à-dire à pH situé entre 6 et 8. Il est évident que selon la situation, la chloration excessive de l'effluent ne permettra pas son rejet dans certains environnements (danger pour les poissons).

7-21

L'hypochlorite de soude est aussi largement utilisé comme désinfectant ménager et hospitalier, sous forme d'Eau de Javel qui consiste en un mélange d'hypochlorite et de NaCI. Une eau de Javel est caractérisée par son titre chlorométrique, c-à-d. par le nombre de litre de Cl 2 qu'elle peut libérer kg. (ex; titre 10 = 10 litres Cl 2 livérable par kg). Une solution d'eau de Javel de titre 0.5 - 0.6 peut parfaitement servir comme antiseptique.

2) Dérivés organiques chlorés : les Chloramines

Des chloramines sont des composés aminés dont le NH 2 a été substitué par du chlore. Selon que 1 ou 2 CI sont présents, il s'agit de mono- ou de dichloramines. Elles se décomposent lentement en libérant le chlore lié. Leur activité antibactérienne est donc plus lente que celle des hypochlorites, mais elles sont nettement plus stables et ont une efficacité plus durable. Elles sont aussi moins toxiques et moins irritantes pour les tissus, d'où leur usage en désinfection des plaies. En pratique, les chloramines utilisées sont des dérivés de sulfamides:

- chloramine T : sodium p.toluène sulfone chloramide

- dichloramine T : p.toluène sulfone dichloramide

- halazone : p.carboxy-N, N-dichlorobenzene sulfonamide

3) Iode et Iodophores

L'Iode (I - ) a une activité antibactérienne très large; par exemple, il est un des rares agents actifs contre le bacille tuberculeux; par contre, son activité sporicide est faible. Son activité antibactérienne provient beaucoup moins de son pouvoir oxydant:

I 2 + H 2 0 2HI + 0 -

que de sa faculté de se fixer sur les charges positives des protéines. Cette iodination altère celles-ci fonctionnellement. L'iode est peu soluble dans l'eau; c'est pourquoi il est dissout dans une solution hydro-alcoolique. Sa solubilité est augmentée par la présence d'iodure de potassium, comme dans la teinture d'iode

Iode 65

Iodure de K 25

alcool 90°

910

7-22

Il se forme dans cette teinture dl iode du tri-iodure ( I 3 dénué lui-même de pouvoir

bactéricide, mais libérant lentement l'Iode.

Iodophores : produits dans lesquels des agents tensio-actifs agissent comme support et comme agents solubilisants de l'iode. Ils sont non-irritants, ne tachent pas et sont très actifs. Ex. : Iosan®, Iso Betadine® (polyvinyl pyrrolidone iode) Leur intérêt pratique réside dans le fait que la grande efficacité de l'iode n'est pas réduite par une coagulation des matières organiques, et que l'activité du produit dans la solution est attestée par la teinte brunâtre de celle-ci ; la libération totale de l'iode correspondant à un épuisement de l'activité antibactérienne, est visible à la disparition de cette teinte. Ces iodophores sont largement utilisés à la ferme et dans l'industrie laitière.

e) Les Agents Oxydants

Leur efficacité repose sur leur pouvoir d'oxyder différents groupements sur les protéines, notamment les -SH et -OH . Ils sont particulièrement indiqués contre les anaérobies.

1) Peroxyde d'hydrogène H 2 O 2 : activité très variable selon les bactéries. Celles qui sont catalase positives y sont relativement insensibles. Les solutions d'eau oxygénée sont utilisées pour la toilette des plaies car la catalase tissulaire la désintègre rapidement en H 2 O et 0 2 , cette réaction provoquant un dégagement gazeux qui nettoie mécaniquement les tissus lésés : par exemple, une solution d'eau oxygénée diluée au 1/4 convient très bien pour épurer le conduit auditif du chien de ses dépôts purulents.

2. L'ozone (O 3 ) utilisé pour la désinfection des eaux, lors du traitement des eaux de surface en vue de les rendre potables (ex :Tailfer) Après instillation dans l'eau, l'ozone se désintègre rapidement et a l'avantage de ne laisser aucun résidu. Il agit aussi sur les matières organiques présentes dans l'eau, ce qui réduit son activité sur les bactéries et virus.

7-23

3. Acide peracétique (CH3-CO-O-OH) employé en solution extemporanée pour

pulvérisation dans les sas des enceintes stériles (ex : isolateurs pour animaux germ-free). Il

se désintègre rapidement en acide acétique et permet l'introduction dans l'isolateur du matériel ou des aliments placés dans le sas sans persistance de son effet oxydant

f) Les Agents Alkylants.

Un agent alkylant est un agent bifonctionnel, capable de se lier de manière covalente à deux groupements nucléophiles (NH 2 , OH, COOH, SH) dont il remplace les H labiles de façon à former un pont. Ils modifient ainsi profondément la structure et la fonction des protéines et des acides nucléiques : ce sont des agents antibactériens, mais aussi antiviraux, ils font de plus partie des rares substances actives sur les spores.

1. Formaldéhyde (HCOH) : Gaz soluble dans l'eau et l'alcool, utilisé comme

désinfectant soit à l'état gazeux (fumigations) soit en solution. Il a tendance à se polymériser en perdant son activité alkylante

H 2 C = O + H 2 C = O + H 2 C = O H 2 C - C - C = O

C'est pour éviter cet inconvénient qu'il est d'ordinaire présenté en solution à 37% dans l'eau additionnée de 10 à 15% de méthanol pour prévenir sa dégradation. Sous cette forme, il constitue le formol commercial ou formaline, employé comme désinfectant en solutions de 1 à 8% de formaldéhyde.

2. Glutaraldéhyde (O = CH-(CH 2 ) 3 - CH = O) : plus efficace et moins irritant,

surtout utilisé en sol 2% pour la désinfection d'instruments qui ne peuvent être stérilisés par autoclavage (cytoscopes, thermomètres).

3. Alkylants volatiles : utilisés à l'état gazeux pour la stérilisation d'enceintes closes ou d'instruments

7-24

Cette substance, dont le point d'ébullition est 10°8 C, est utilisée pour la désinfection gazeuse des surfaces sèches, en mélange avec du CO 2 , dans des containers étanches.

antimicrobien très actif, utilisé pour stériliser des produits biologiques qui ne peuvent l'être par d'autres méthodes : vaccin antirabique à base de tissu nerveux, greffons, plasma, etc.

g)

Détergents

Composés qui ont la propriété de se concentrer aux interfaces. L'interface entre la membrane cytoplasmique contenant des lipides et l'eau du milieu extérieur attire les composés qui possèdent à la fois un groupement soluble dans les graisses et un groupement soluble dans l'eau. Les longues chaînes hydrocarbonées ionisées à une extrémité possèdent ces deux caractéristiques.

On connaît deux types de détergents :

a. Anioniques = la charge terminale est négative. Elle est saturée par du Na, mais en solution, cela donne l'ionisation suivante :

Ex.

SAVON ORDINAIRE

débarrasse la peau de la flore de passage

DETERGENTS SYNTHETIQUES

ex. sulfate de lauryle sodique

Le groupe carboxylique y est remplacé par un groupe ac. sulfonique. Associé à d'autres antiseptiques, il permet leur pénétration cutanée

SELS BILIAIRES

b. Cationiques = la partie soluble dans les graisses est chargée positivement par combinaison à un ammonium quaternaire.

7-25

ex. benzalkonium chloride

(Zéphiran®)

Ce sont les détergents les plus actifs en tant que désinfectants, utilisés aussi comme antiseptiques (mais inactifs sur les spores) (Cetavlon® - Roccal®).

h. Substances colorantes

L'action inhibitrice sur le développement microbien fut reconnue à de nombreuses substances colorantes dès les débuts de la microbiologie. Ces colorants se combinent aux bases pyrimidiques des ac. nucléiques et y causent des lésions dues à l'action de la lumière (effet photodynamique). A certaines concentrations, leur action inhibitrice est sélective ; à ce titre, ces colorants sont incorporés dans les milieux de cultures pour l'isolement des bactéries qui sont insensibles à leur présence :

Ex. : Vert brillant, vert malachite : (inhibent les colibacilles, mais non les Salmonella) Bleu de Méthylène, éosine : incorporés dans le milieu EMB pour l'isolement des entérobactéries. Certaines de ces substances ont reçu des applications cliniques :

Ex. Collutoire au bleu de méthylène désinfection cutanée à l'acridine, au violet de gentiane (intertrigo) etc.

i)

Divers

Certaines substances, ne rentrant dans aucune des catégories répertoriées ci-avant sont douées de certaines propriétés bactéricides. Ainsi :

- l'azide sodium (NaN 3 ), employé comme agent préservatif dans des préparations biologiques. Il inhibe la cytochrome-oxydase. Trop toxique pour être employé comme antiseptique.

- des amidines, (Hexomédine®), antiseptiques locaux puissants et bien tolérés. La

forme transcutanée de l'Hexomédine est une solution dans un excipient mouillant et pénétrant.

7-26

-

La

muqueuses

chlorhexidine

(Hibitane®)

un

des

rares

antiseptiques

utilisable

sur

les

NIVEAU D'ACTION BACTERICIDE des DIVERS GROUPES DE DESINFECTANTS

Bactéries

Végétatives

Bacille

Tuberculeux

Spores

Alcools

++

O

Phénoliques

++

+

O

Mercuriels

+/-

O

O

Chlorés

++

+

+

Iode - alcool

++

+++

+/-

Iodophores

++

+

+/-

Formaldéhyde

++

+++

++

Glutaraldéhyde

+++

++

+++

Formol-alcool

+++

+++

+++

Oxyde d'éthylène

+++

+++

+++

Ammonium quaternaire

++

O

O

7.5 Les Agents Chimiques à Usage Chimiothérapique

Par définition, la chimiothérapie anti-infectieuse consiste en l'emploi d'agents

chimiques pour inhiber la multiplication de micro-organismes envahissant l'hôte, sans

causer de dommages à ce dernier. Selon le cas, les bactéries pathogènes à atteindre soit se

multiplient au sein des tissus (infections à localisations organiques, septicémies) soit

demeurent localisées dans des cavités naturelles où leur présence est anormale et nosogène

(tractus digestif, urinaire, utérus, peau).

Les substances utilisables par voie générale pour atteindre des bactéries au sein des

tissus doivent y inhiber la prolifération bactérienne à des concentrations parfaitement

tolérées par l'hôte. Les sulfamidés et les antibiotiques répondent à cet impératif ; ils sont

pour cela devenus synonymes d'agents chimiothérapeutiques, quoique cette synonymie soit

abusive ? En effet, d'autres substances trop toxiques pour être administrées par voie

7-27

générale, servent aussi à des fins thérapeutiques au niveau de plaies, de l'intestin, du tractus urinaire et peuvent de ce fait être aussi appelées agents chimiothérapeutiques; elles appartiennent plutôt au groupe des antiseptiques, et nous les qualifierons d'antiseptiques cutanés, urinaires et intestinaux.

7. 5. 1 Agents réservés à un usage local.

De nombreuses infections locales, de la peau ou d'un organe creux (intestin, tractus urinaire) sont traitables par des antiseptiques. Nous ne donnerons ici que quelques considérations générales à leur propos.

A. Chimiothérapie des infections digestives

L'étiologie des diarrhées aiguës est très variée : elle sera selon le cas d'origine bactérienne (E. coli entéropathogènes, Sh×igella, Salmonella, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, etc.) ou parasitaire (Eutamoeba, histolytica, Lamblia) ou virale (Rotavirus). Le rôle prédominant revient aux E. coli entéropathogènes et aux rotavirus ; il faut dès lors savoir qu'un diagnostic étiologique est préalable à tout traitement chimiothérapeutique, qui ne peut être envisagé que pour les diarrhées d'origines bactériennes ou parasitaires, à l'exclusion des étiologies virales. Certes, les antibiotiques et les sulfamides sont très utilisés en pratique; particulièrement les sulfamides à faible taux de résorption intestinale (sulfaguanidine). Un certain nombre d' "antiseptiques intestinaux" sont aussi d'emploi usuel; leurs caractéristiques générales sont d'être très peu solubles (donc non absorbés d'où peu d'effets secondaires) et d'être actifs sur des bactéries pathogènes, surtout Gram - , et sans action sur la flore colique normale. Les plus utilisés se répartissent en deux groupes

1. Les dérivés insolubles des nitrofuranes Il s'agit de composés synthétiques de nitrofuraldéhyde, fortement bactéricides in vitro pour de nombreuses bactéries tant Gram + que Gram - . Ils ont un effet inhibiteur sur les synthèses protéiques des bactéries;

7-28

La plupart sont insolubles dans l'eau. Ils se fixent sur les protéines, ce qui les rend inactifs, sinon toxiques, après usage ou injection. Ils sont utilisés en usage oral, pour la désinfection intestinale : nitrofuraldéhyde semi-carbazone (Furacin, Furoxone). Toutefois, la nitrofurantoïne (Furadantin) est résorbée par voie intestinale et éliminée et concentrée dans l'urine : c'est un bon antiseptique urinaire après administration orale (voir plus loin).

2. Les dérivés de la quinoléine L'hydroxyquinoléine est un antiseptique moderne, à large spectre antibactérien et fungistatique (ex. : quinosol = sulfate d'oxyquinoléine). Il a cependant l'inconvénient d'induire une coloration tégumentaire gênante et peut être responsable de sensibilisations. Des dérivés halogénés sont utilisés comme antiseptiques intestinaux excepté chez les carnivores chez lesquels ils produisent des hémorragies intestinales (ex. : Entero- Vioform - iodochlorhydroxy- quinoléine).

B .

Chimiothérapie des infections urinaires

Les infections urinaires, surtout les infections basses (cystites) sont causées par la multiplication de bactéries ascendantes provenant du périnée ou du vagin (entérobactéries, entérocoques, staphylocoques). La chimiothérapie de ces infections fait appel à trois groupes de substances :

1) Les sulfamides à tropisme urinaire et à élimination précoce. Après absorption orale, ils sont peu métabolisés et éliminés par les urines où ils se concentrent de façon importante. Parmi les plus utilisés, citons : la sulfafurazol (Gantrisin) et le sulfaméthoxazole (Gantanol). Il est à rappeler que les sulfamides ne seront actifs ni sur des bactéries ayant acquis une résistance ni sur celles qui ne synthétisent pas l'acide folique comme c'est le cas des entérocoques.

2) Les antibactériens chimiques - Les quinolones : ils constituent une famille d'agents antibactériens, utilisés surtout pour le traitement des infections urinaires.

7-29

Le mécanisme de l'action antibactérienne de ces substances consiste en une inhibition de la synthèse des ac. nucléiques, aussi bien ADN que ARN messagers. Il s'en suit une inhibition parallèle de la synthèse des protéines. La résistance à l'ac. nalidixique est de nature mutationnelle; aucune résistance plasmidique n'a, jusqu'ici, été décrite.

- les dérivés solubles de nitrofuranes (ex. : Nitrofurantaïne) - un dérivé de l'hydroxyquinoléine : la nitroxoline (ex. : Nibiol)

3) des "antiseptiques urinaires", dont le plus connu est l'hexaméthylène tétramne (utilisé sous forme de mandélate). Un pH acide (5,5) est nécessaire au développement de son activité antiseptique, qui résulte de son hydrolyse en ammoniaque et formaldéhyde. D'où l'intérêt de prescrire en même temps des acidifiants urinaires (acide phosphorique, chlorure d'ammonium).

C .

Antiseptiques à usage externe

Les antiseptiques externes sont moins efficaces que les traitements à usage interne

(antibiotiques, sulfamidés, actifs au lieu de l'infection lorsque la circulation sanguine peut les y apporter. L'intérêt curatif des antiseptiques a donc considérablement diminué; leur valeur cependant persiste dans les circonstances suivantes

1. Infections cutanées dues à des bactéries résistantes aux traitements généraux, soit

par résistance aux antibiotiques soit par infection d'une plaie ou ulcère à irrigation déficiente.

2. Infections superficielles d'étendue limitée, pour le traitement desquelles l'usage

d'antibiotiques en topique est efficace, sans doute, mais souvent responsable de sensibilisations.

3. Prévention de surinfections cutanées, lors de tout traitement sous occlusion (pour

prévenir les folliculites), lors de dermatoses étendues, de décollements cutanés, lors de traitements chirurgicaux, lors de corticothérapie locale.

7-30

7.5.2.

Agents actifs par voie générale

7.5.2.1.

Principes généraux

La condition sine qua non pour qu'une substance puisse servir à la lutte anti- infectieuse par voie générale, est qu'elle exerce son activité anti-bactérienne à des concentrations qui ne produisent aucun effet toxique pour l'organisme. La toxicité différentielle de ces substances pour les bactéries est basée sur l'existence chez celles-ci de particularités structurales et métaboliques qui peuvent être atteintes de manière spécifique. C'est pourquoi la plupart des agents chimiothérapeutiques systémiques n exercent leur effet que sur des bactéries en phase de croissance active, car ils interfèrent au niveau d'étapes métaboliques variables dont l'arrêt ou la viciation ne peut être néfaste que pour des bactéries métaboliquement actives. C'est cette particularité qui permet à la pénicilline de sélectionner les mutants auxotrophes cultivés sur un milieu où seuls les prototrophes peuvent se multiplier. Ces agents sont donc, pour la même raison, beaucoup plus souvent bactériostatiques que bactéricides ; ils laissent subsister des bactéries en état métaboliquement stationnaire, mais revivifiable lors de la disparition de ces agents. Puisque ces agents chimiothérapeutiques ont des activités sélectives sur des endroits variables du métabolisme bactérien, on use fréquemment de leurs associations pour inhiber plus sûrement le développement bactérien, ou pour avoir une action bactériostatique sur les divers agents d'infections mixtes polybactériennes qui ne sont pas tous atteints par l'inhibition d'une même chaîne métabolique.

7.5.2.2. Principales substances utilisées en chimiothérapie anti-infectieuse

L'appellation d'agent chimiothérapeutique, au sens défini ci-dessus, ne peut être appliqué qu'à de rares substances chimiques de synthèse et à certains antibiotiques.

A. Substances chimiques

1°) Les Sulfamides

7-31

Les sulfamides actuels sont le fruit d'un long cheminement de recherches chimiques. C'est Domagk qui en 1935, amorça ce cheminement. Au cours de son étude de colorants aminés en vue d'en découvrir les propriétés anti-bactériennes, il découvrit un composé, le Prontosil, qui possédait une activité curative sur les infections staphylococciques, alors que son activité in vitro était nulle. Il fut reconnu que cette situation résultait de la métabolisation de ce composé dans l'organisme en sulfanilamide, qui était le véritable agent antibactérien. Cette molécule de sulfanilamide subit par la suite de nombreuses substitutions en vue d'en réduire la toxicité et d'en accroître les propriétés antibactériennes. Cela donna naissance à toute une série de composés appelés les sulfonamides ou Sulfamides.

2°) LeTriméthoprim, toujours associé aux sulfamides (voir page 7.31)

3°) Le Métronidazole actif contre les anaérobies (1-éthanol, 2-méthyl, 5-nitro-imidazole)

Les anaérobies sont une cause fréquente d'infections après chirurgie gastro- intestinale et gynécologique ou après perforation d'un organe creux. Les anaérobies sont également responsables de nombreuses infections, notamment de la bouche et des tissus mous (ulcères cutanés, abcès des poumons et du cerveau, septicémies). Quand une infection par anaérobies survient au départ de l'intestin, il s'agit généralement de Bactéroïdes fragilis, résistant à la plupart des pénicillines et céphalosporines. Son traitement est possible par d'autres antibiotiques à large spectre (tétracyclines, macrolides); toutefois leur emploi prolongé entraîne fréquemment des colites pseudo-membraneuses, dues à la prolifération de germes anaérobies de la flore digestive sous-dominante (souvent Clostridium difficile). C'est ici que se manifeste l'utilité du Métronidazole, substance active contre la plupart des bactéries anaérobies strictes (à l'exception des Actinomyces) et contre un grand nombre de protozoaires (Trichomonas, Entamoeba, Giardia, etc.). Son action antimicrobienne repose sur sa transformation dans l'organisme en un métabolite actif sur ces bactéries anaérobies, par interférence sur leur métabolisme énergétique anaérobie. Le métronidazole est par contre dépourvu de toute activité sur les aérobies. Le risque de colite ulcéreuse est beaucoup moindre après emploi de cette substance que d'antibiotiques à large spectre.

7-32

B. Les antibiotiques

Les antibiotiques sont par contre des molécules naturelles élaborées par certains micro-organismes et produisant sur d'autres des effets antagonistes souvent spécifiques et à faible dose. Leur découverte fut aussi le fruit d'un long cheminement, qui peut se résumer ainsi :

Dès 1877, Pasteur observe que l'infection par Bacillus anthracis est entravée par la présence de certaines bactéries. Au début du 20ème siècle, il fut reconnu que Pseudomonas aeruginosa inhibait la croissance de nombreuses bactéries grâce à une pyocine trop toxique pour servir comme agent chimiothérapeutique. En 1929, Fleming rapporte qu'une colonie de Penicillium notatum, contaminant occasionnel d'une culture de staphylocoque, lysait les colonies bactériennes adjacentes mais l'agent lytique se montrait instable. Ce n'est qu'en 1939, que Chain et Florey purifient l'agent lytique produit par Penicillium notatum, qui se montre dès lors stable; il est inhibiteur de certaines bactéries et inoffensif pour les mammifères il servira rapidement au traitement de certaines infections; ils l'appelleront pénicilline. Vers 1940 Dubos et Hotchkiss préparent à partir de Bacillus brevis, deux substances de nature peptidique, la thyrocidine et la gramicidine, actives sur de nombreuses bactéries pathogènes quoique trop toxiques pour servir au traitement des infections chez les mammifères. A partir de ce moment, les succès spectaculaires résultant de l'emploi de la pénicilline furent le stimulant à une grande efflorescence de recherches. L'idée directrice en était que la production d'agents inhibiteurs par des micro-organismes (moisissures ou bactéries) pourrait être responsable de la pauvreté de certains sols en bactéries. Des prélèvements de terre, en provenance du monde entier, furent examinés en vue d'y déceler la présence de tels agents producteurs d'antibiotiques. Le premier résultat fut la découverte de la streptomycine, produite par un Streptomyces. En 25 ans, 4 à 5.000 antibiotiques furent ainsi répertoriés, dont une cinquantaine environ connaissent ou ont connu une application pratique. Les producteurs d'antibiotiques se répartissent en trois catégories de micro- organismes :

7-33

a) Les Actinomycétales du genre Streptomyces sont de loin le groupe le plus

important des producteurs d'antibiotiques, dont la gamme est très variée :

chloramphénicols, streptomycine, tétracyclines, kanamycine, érythromycine, rifamycine,

néomycine, novobiocine, vancomycine en sont des exemples parmi les plus courants.

Citons à titre documentaire

Streptomyces

griseus

" auréofaciens

" venezuelae

" rimosus

" fradiae

" ambofaciens

" erythreus

" virginiae

" kanamyceticus

" halstedii

" antibioticus

" niveus

" puniceus

Streptomycine (Waksman 1944) Aureomycine Chloromycétine Terramycine Tylosine - Néomycine Spiramycine Erythromycine Staphylomycine Kanamycine Magnamycine Oléandomycine Novobiocine Viomycine

b) Les champignons regroupent un certain nombre de producteurs d'antibiotiques

largement utilisés en pratique ; ils appartiennent aux Aspergillales et produisent les

pénicillines, céphalosporines et acide fusidique.

Ex. :

Penicillium notatum Penicillium griseofuIvium différents Cépholasporium

pénicilline (Fleming 1929) Griséofulvine (Oxford 1939) Céphalosporines

c) Certaines bactéries synthétisent des substances inhibitrices pour d'autres bactéries

(bactériocines : voir plus loin) mais seuls des antibiotiques produits par le genre Bacillus

sont utilisés comme agents chimiothérapeutiques. Il s'agit de polypeptides fortement

liposolubles, dont le retentissement sur les structures lipidiques membranaires des cellules

eucaryotes empêche l'usage par voie générale (ils sont toxiques pour le rein après injection)

et limite leur usage à des traitements locaux.

Ex. :

Bacillus licheniformis

Bacitracine

polymyxa

Polymyxines

Après leur découverte, la formule de nombreux antibiotiques put être précisée et

l'industrie entreprit d'effectuer la synthèse de quelques uns, comme le chloramphénicol qui

7-34

est actuellement produit par syn thèse chimique. D'autres antibiotiques naturels subirent diverses manipulations et substitutions, en vue d'en améliorer les performances thérapeutiques : élargissement du spectre d'activité, résistance aux enzymes et inhibiteurs, réduction de toxicité, etc. Ce sont les antibiotiques semi-synthétiques, dont les pénicillines ont donné le plus d'exemples. Les principaux antibiotiques de l'arsenal thérapeutique sont regroupés en quelques familles :

1. Les béta-lactamines, qui réunissent les pénicillines naturelles et semi-synthétiques

et les céphalosporines. Elles possèdent un noyau béta-lactame.

2. Les aminosides. Ils comprennent des antibiotiques dont la molécule est constituée de sucres simples et de sucres aminés divers. Parmi eux, les plus utilisés sont la Streptomycine, la Néomycine, la Kanamycine, la Gentamycine.

3. Les phénicoles, centres sur le Chloramphénicol

4. Les tétracyclines, groupe d'antibiotiques caractérisés par 4 cycles carbonés différemment hydroxylés et branchés selon les cas. On y distingue :

- des tétracyclines naturelles : tétracycline base, oxytétracycline (Terramycine), chlortétracycline (Auréomycine)

des tétracyclines semi-synthétiques : Ledermycine, Rondomycine, Vibramycine,

etc.

-

Les polypeptides. Ce sont les seuls antibiotiques provenant de bactéries du genre

Bacillus. Les plus connus sont les Polymyxines, produites par Bacillus polymyxa; citons aussi la Bacitracine, la Tyrocidine, la Gramicidine. Il s'agit de petits polypeptides cycliques, constitués d'un cycle de 7 ac. aminés

auquel est attaché une courte chaîne terminée par un ac. gras branché. Ces polypeptides contiennent surtout des ac. aminés à radicaux hydrophobes, parmi lesquels l'acide di- amino-butyrique (DAB).

5.

6. Les macrolides. 0n regroupe sous ce nom une série de molécules très hétérogènes

et à mode d'action antibactérienne très variée. Elles sont produites par diverses espèces de

7-35

Streptomyces et sont caractérisées par une longue chaîne carbonée fermée au niveau d'une

lactone.

Ils comprennent:

- des macrolides vrais, parmi lesquels l'Erythromycine - des macrolides apparentés, dérivés semi-synthétiques des rifamycines (Lincomycine, Staphylomycine, etc.

7.5.2.3. Mode d'action des agents chimiothérapeutiques.

A. Antagonisme compétitif.

1) l'exemple typique de cette action est donné par les sulfamides : chez de nombreuses bactéries, l'ac. para-aminobenzoïque est un métabolite essentiel dans la synthèse de l'ac. folique, indispensable pour la synthèse des purines. Les sulfamides possèdent une analogie de structure avec cet ac. Para- aminobenzoïque : ils vont pouvoir le remplacer dans la chaîne réactionnelle de l'ac. folique, avec pour résultat la formation d'un analogue non fonctionnel de celui-ci.

Les cellules animales ne synthétisent pas l'ac. folique, elles doivent le recevoir d'une source extérieure; certaines bactéries sont dans le même cas. Le unes et les autres ne seront pas inhibées par les sulfamides. D'un autre côté, dans la même chaîne réactionnelle, les sulfamides ne sont pas inhibiteurs chez les bacilles tuberculeux, mais le PAS (ac. para-amino-salicylique) l'est, sans doute à cause d'une structure différente de l'enzyme catabolisant l'ac. para

aminobenzoïque.

2) Le diamino-triméthoxy-benzyl-pyrimidine (Trimethopyim) inhibe la conversion de l'ac. dihydro-folique ac. tétrahydrofolique (étape de la synthèse des purines et DNA) Sulfamides et triméthoprim agissent donc sur deux points différents de la même séquence réactionnelle et sont utilement administrés en conjonction.

B. Inhibition de la synthèse de la paroi bactérienne

7-36

Puisque le peptidoglycane basal de la paroi est propre aux bactéries, tout inhibiteur de sa synthèse atteindra sélectivement celles-ci. L'absence de formation de muréine normale en présence de certains antibiotiques entraînera un éclatement de la membrane cytoplasmique, cessant d'être soutenue par la paroi rigide, et provoquera la lyse bactérienne. Les antibiotiques inhibiteurs de la synthèse pariétale sont donc de véritables bactériolytiques. L'altération de la muréine peut se situer à différents endroits de sa synthèse. (voir p.

4.85)

1°) la synthèse intracytoplasmique du petit peptide associé à l'acide N.acétyl muranique. La cyclosérine agit à ce niveau. Elle est produite par Steptomyces orchidaceus et a été synthétisée chimiquement. Son action est liée à son analogie structurale à la D.alanine dont elle inhibe l'incorporation dans le pentapeptide en voie de formation. Son activité antibactérienne a surtout été mise à profit contre Mycocbacterium tuberculosis.

(M)-(G) 2°) la formation d'unités (peptide) et leur transfert transmembranaire Ce transfert se fait par liaison momentanée à un transporteur soluble dans les lipides membranaires. L'activation de ce transporteur est entravée par un groupe d'antibiotiques de nature polypeptidiques produits par Bacillus licheniformis, et appelés Bacitracines (A,B,C). Ces bacitracines sont actives sur les bactéries Gram + . Leur usage est limité aux traitements externes, car elles sont toxiques en injection.

traitements externes, car elles sont toxiques en injection. (M)-(G) 3°) La polymérisation linéaire de ces unités
traitements externes, car elles sont toxiques en injection. (M)-(G) 3°) La polymérisation linéaire de ces unités

(M)-(G) 3°) La polymérisation linéaire de ces unités (peptide) Celle-ci est entravée par la Vancomycine, obtenue à partir de Streptomyces orientalis et active contre les Gram + et les spirochètes, et par la Ristocétine, antibiotique produit par une Nocardia (genre voisin des Streptomyces) et actif contre les Gram + et les mycobactéries.

4°) Le cross-linkage des chaînes polymérisées.

7-37

Cette dernière étape de la formation de la muréine est spécifiquement entravée par

des antibiotiques très importants en pratique : les pénicillines et les Céphalosporines

1. les pénicillines

Elles ont la formule générale suivante :

Elles sont synthétisées sous forme de sels de Na ou de K par Penicillium notatum.

Elles sont bâties autour d'un noyau -lactame. L'ouverture de ce cycle abolit leurs

propriétés antibiotiques en les transformant en acide pénicilloïque dont le caractère

allergisant est responsable des sensibilisations à la pénicilline.

La plupart des pénicillines naturelles ne sont actives que sur les bactéries Gram

positives. Aux fortes doses de pénicillines, la formation de la paroi est entravée et la

bactérie ne peut survivre ou se transforme en forme L si elle est placée en milieu

hypertonique (sucrose 20%) empêchant la pression osmotique interne de faire éclater la

cellule. Aux faibles doses de pénicillines, seule la paroi septale de division n'est pas

synthétisée et la bactérie devient énorme, car la synthèse des protéines et ac. nucléiques

n'est pas inhibée et la bactérie peut continuer à s'accroître.

Les pénicillines ont la propriété de se lier à des protéines à fonction enzymatique

dans l'espace périplasmique; parmi ces protéines sensibles aux pénicillines, il y a

principalement les transpeptidases et carboxypeptidases de la face externe de la membrane,

ces enzymes assurent le pontage des chaînes polymérisées (N.ac.Mur-N;a;Glu)n peptide

Les pénicillines sont inactivées par des enzymes (pénicillinases) dont les plus

importantes sont les -lactamases, qui ouvrent le noyau( -lactame, et d'autres (amino-

peptidases) hydrolysent la liaison peptidique. Diverses bactéries pathogènes (Pseudomonas

aeruginosa, Staphylococcus aureus) synthétisent de la pénicillinase; cette synthèse peut

aussi être induite chez des bactéries sensibles suite à leur contact avec des doses sub-

léthales de pénicilline.

D'autre part, la pénicilline est rapidement détruite par les acides. D'où l'inefficacité

de l'emploi de la pénicilline par ingestion.

En greffant sur cette molécule des substituts du radical - R, on a pu obtenir des

pénicillines dont les qualités sont améliorées : ce sont les pénicillines semi-synthétiques :

- certaines sont acido-stables et peuvent être administrées per os

Ex. : pénicilline V - phénoxyméthyl-pénicilline

7-38

- d'autres sont pénicillinase-résistantes et possèdent un spectre d'activité plus large, agissant sur des Gram - autant que sur des Gram + Ex. : ampicilline

2. les Céphalosporines Elles sont produites par une autre espèce de champignon, un Céphalosporium, et ont une formule générale très semblable à celle des pénicillines. Leur activité antibactérienne est identique à celle des pénicillines, mais leur spectre d'activité est plus large et s'étend aux Gram négatives. En outre, elles sont plus résistantes aux -lactamases et sont très utiles pour le traitement per os d'infections par bactéries productrices de pénicillinase. Exemple : Staphylocoque doré.

3. Inhibiteurs des -Lactamases. L'importance des -lactamases en tant qu'inhibiteurs de l'activité des -lactames in vivo, a amené à présenter les pénicillines et céphalosporines en mélange avec des molécules à noyau -lactames, inactives comme antibiotiques mais capables de se lier aux -lactamases et ainsi d'en réduire l'activité contrariante.

Un de ces inhibiteurs de -lactamase est l'acide clavulonique, -lactame produit naturellement par certains Streptomyces; d'autres acides clavuloniques sont produits par synthèse.

C. Atteinte de l'intégrité de la membrane cytoplasmique

Certains Bacillus produisent des petits peptides cycliques hydrophobes, qui se combinent aux constituants membranaires et perturbent la fonction semi-perméable de la membrane, permettant la fuite de composants cytoplasmiques et découplant la phosphorylation oxydative

Leur activité est surtout dirigée contre les Gram - , ce qui les rend très utiles théoriquement contre des bactéries peu sensibles à d'autres antibiotiques, telles les Pseudomonas. Toutefois, le fait qu'ils se fixent également sur les phospholipides des membranes tissulaires les rend trop toxiques pour permettre leur usage par voie générale.

7-39

Le choix se portera sur eux pour un traitement local, afin d'éviter l'emploi à ce niveau d'antibiotiques systémiques et la création inutile de résistance bactérienne à ces derniers.

D. Inhibition de la synthèse des protéines.

Le mécanisme de la synthèse protéique est identique chez toutes les cellules et est basé sur la fonction ribosomiale. Cependant, les ribosomes d'eucaryotes et de procaryotes diffèrent par la taille. Des antibiotiques altèrent la fonction du ribosome en se fixant sur certains de ses constituants. Certains antibiotiques (chloramphénicol, aminosides ne sont actifs que contre les petits ribosomes bactériens. D'autres atteignent également les ribosomes des mammifères mais dans une mesure beaucoup moindre que ceux des bactéries (tétracyclines). Ces divers agents sont donc largement utilisés pour la chimiothérapie antibactérienne.

1) les Aminosides (amino-glycosides) Leur spectre d'activité est principalement orienté vers les bactéries Gram + Ces aminosides se lient à la petite sous-unité 30S des ribosomes bactériens. La fixation de l'antibiotique à ce niveau provoque une distorsion suffisante de cette sous-unité pour empêcher l'interaction normale entre le codon du mRNA et l'anticodon du tRNA avec pour conséquence, des erreurs de lecture et la production de protéines nonsense.

2) le Chloramphénicol (ou Chloromycétine) Antibiotique synthétisé par Streptomyces venezueliae Cet antibiotique à large spectre est un antibiotique naturel qui a été ensuite produit par voie de synthèse chimique. Il se fixe sur la grosse sous-unité 50S et inhibe la formation du pont peptidique entre l'ac. aminé amené par un tRNA et la chaîne peptidique en voie d'élongation.

3) les Tétracyclines Ce sont des antibiotiques à très large spectre d'activité actifs aussi bien contre les Gram + et les Gram - que contre les spirochètes, les rickettsies ou les mycoplasmes. Leur mode d'action sur le ribosome n'est pas parfaitement élucidé : il consiste en un empêchement du positionnement du tRNA sur son site accepteur sur le ribosome, ce qui entraîne un arrêt des synthèses protéiques. Cet effet est obtenu aussi bien sur des

7-40

ribosomes isolés d'eucaryotes que sur des ribosomes bactériens. Toutefois, les tétracyclines possèdent une activité sélectivement dirigée vers les bactéries parce que celles-ci disposent d'un système membranaire de transfert qui accumule ces antibiotiques dans le cytoplasme bactérien, alors que les membranes eucaryotes sont imperméables au passage actif de ces substances.

4) Les macrolides L'antibiotique de ce groupe le mieux connu est l'Erythromycine, à côté de l'Oléandomycine, la Spriramycine. Les macrolides se fixent sur l'unité 50S des ribosomes, où leur action consiste en un blocage de l'élongation protéique, mais on ignore si ce blocage résulte d'un arrêt de la formation du lien peptidique ou de la translocation.

E. Inhibition des acides nucléiques.

1) les Rifamycines Elles forment un groupe d'antibiotiques apparentés aux macrolides; elles sont produites par Streptomyces mediterranei et sont actives contre les Gram + et Mycobacterium tuberculosis. La Rifampicine est un dérivé semisynthétique de la rifamycine B. Son activité antibactérienne est de loin supérieure à celle des rifamycines naturelles. Le pouvoir de ces antibiotiques résulte de leur capacité de liaison très ferme avec la RNA polymérase bactérienne, bloquant de ce fait la transcription du DNA en RNA. Mais les RNA polymérases d'eucaryotes y sont insensibles.

2) Malgré l'activité antibactérienne de nombreux antibiotiques sur la synthèse ou la fonction des acides nucléiques, ils ne sont pas utilisés comme agents anti-infectieux à cause de leur action indiscriminée sur les acides nucléiques tant des eucaryotes que des procaryotes. Leur action sur les cellules de mammifères en a d'ailleurs fait utiliser certains d'entre eux comme agents anticancéreux. Parmi ceux-ci, citons certains antibiotiques produits par des streptomyces :

- l'azasérine. Son analogie avec la glutamine fait penser qu'elle entre en compétition avec elle pour la liaison à un enzyme impliqué dans la synthèse de nucléotides.

7-41

- la mitomycine C. Elle réalise des liaisons covalentes entre des bases appartenant

aux deux chaînes du DNA, entravant de la sorte sa fonction et sa réplication.

- l'actinomycine. Elle se lie aux résidus guanosine du DNA et perturbe l'ordonnance de la double hélice.

7.5.2.4. Sélectivité d'action des agents chimiothérapeutiques

A. Sélectivité entre hôte et bactérie

Comme déjà signalé dans l'introduction à ce chapitre (7.5.2.1), un agent chimiothérapeutique antibactérien doit agir sélectivement sur les bactéries responsables d'une infection, en ne provoquant qu'un minimum de perturbation chez l'hôte. Cette sélectivité peut résulter de diverses causes:

a) Absence de la cible chez l'hôte

La cible structurale ou biochimique sur laquelle la drogue agit, peut être inexistante chez l'hôte; par exemple, la paroi bactérienne est spécifique du monde bactérien et les enzymes impliquées dans sa synthèse ne se retrouvent que chez les bactéries. Tout antibiotique actif sur ces enzymes, n'aura en principe aucun effet sur les cellules de l'hôte.

b) Cible à propriétés particulières

La cible chez les bactéries, bien qu'ayant sa correspondance chez les cellules de l'hôte, peut avoir des propriétés particulières qui la rendent plus - sinon seule - sensible à

certains antibiotiques. Par exemple:

- la synthèse protéique est commune à toute cellule vivante; toutefois des différences existent entre espèces. En particulier, entre les bactéries et les eucaryotes, les différences majeures se situent au niveau des ribosomes : les propriétés différentes des protéines ribosomales font que certains antibiotiques ne se fixent que sur les ribosomes bactériens.

- bien que les mammifères et les bactéries voient tous deux l'activité de l'acide

folique dépendre de sa réduction en acide tétra-hydrofolique, les enzymes assurant cette réduction ont une sensibilité très différente à l'action inhibitrice du Triméthoprim; ce qui

7-42

rend cette drogue utilisable sans inconvénient chez l'homme et les animaux. On a pu déterminer que la dïhydrofolate-réductase du foie des mammifères était 52.000 fois plus résistante à cette inhibition que la même enzyme chez E.coli.

c) Différences de perméabilité membranaire

L'effet sélectif peut résulter du fait qu'une même cible est accessible à l'agent chimiothérapeutique chez les bactéries alors qu'elle l'est moins chez les cellules des mammifères, par défaut de perméabilité membranaire à cette substance. Par exemple:

- Le cas du chloramphénicol est typique à cet égard; il se fixe sur les ribosomes 70S bactériens et y inhibe la synthèse protéique. Mais il n'altère pas la synthèse protéique des ribosomes 80S du cytoplasme des cellules eucaryotes, sur lesquels il ne se fixe pas. Par contre, les ribosomes 70S des mitochondries des cellules eucaryotes sont chloramphénicol- sensibles et voient leur synthèse protéique inhibée lorsqu'ils sont mis en présence de l'antibiotique après désintégration des mitochondries. Mais dans les mitochondries normales, l'antibiotique n'a pas accès, car la membrane mitochondriale ne lui est pas perméable. Il n'empêche que le fait que ces ribosomes mitochondriaux soient sensibles au chloramphénicol et que les ribosomes cytoplasmiques ne le soient pas, est un argument renforçant l'hypothèse de l'origine bactérienne ancestrale des mitochondries. - La chlortétracycline pénètre plus facilement dans les cellules bactériennes que dans les cellules des mammifères; les cellules bactériennes auraient même un processus actif d'accumulation de cette substance. D'où sa fixation efficace sur les ribosomes bactériens, tandis que son action anti-protéique est limitée chez l'hôte. Il n'empêche qu'il faut parfois tenir compte de cette inhibition partielle des synthèse protéiques de l'hôte, en cas d'état débilitant.

d) Autres causes.

De nombreuses autres causes de sélectivité d'action sont encore possibles : elles tiennent souvent à l'existence chez I'hôte de voies métaboliques collatérales qui suppléent

la voie commune bloquée chez lui comme chez les bactéries.

B. Sélectivité pour certaines bactéries seulement

C'est le cas notamment pour les antibiotiques du groupes des -lactames. La résistance à ceux-ci de nombreuses bactéries Gram négatives est bien connue. Elle est due

7-43

à 2 caractéristiques qui se conjuguent différemment selon les espèces bactériennes et selon les antibiotiques envisagés.

a) Constitution de la paroi, organisée chez les Gram - sous forme d'une couche externe hydrophobe (Outer membrane) qui constitue une barrière contre la pénétration de ces substances hydrophiles que sont les pénicillines, dans l'espace périplasmique où leur action doit s'exercer

b) Présence de -lactamases dans cet espace périplasmique. Les Gram - possèdent souvent des pénicillinases qui sont diversement actives contre des types différents de pénicillines. De telle sorte que, si les pénicillines en général sont réputées inactives sur les Gram - , la modification chimique limitée de celles-ci (pénicill. semi- synthétiques) peut les rendre à la fois plus aisément transportables au niveau des pores de la couche externe de la paroi et moins sensibles à l'action de -lactamases de certaines Gram - ; ce qui élargit le spectre d'activité de ces pénicillines à certaines bactéries Gram négatives;

7.5.2.5. Estimation du pouvoir antibactérien des agents Chimiothérapeutiques

Du point de vue clinique, le choix d'un antibiotique pour traiter une infection dépendra en premier lieu de l'activité de cet antibiotique sur la bactérie infectante. Mais d'autres paramètres sont à prendre en considération, notamment le caractère diffusible de la substance dans certains territoires ou dans les cellules, la persistance de sa concentration sanguine après une administration, etc

A. Recherche de la sensibilité d'une bactérie à un antibiotique.

L'acte préalable sera évidemment l'isolement de la bactérie en cause. Sa sensibilité

à un antibiotique peut se faire de 2 façons :

1°) Méthode des dilutions. C'est la méthode la plus précise, mais elle est inadaptée à l'usage clinique, où la facilité d'usage est un impératif. Cette méthode servira par contre aux producteurs

7-44

d'antibiotiques pour en tester l'efficacité sur diversesbactéries-tests. Cette méthode peut se pratiquer :

- sur boite = sur une culture en nappe de bactéries, on place des cylindres de porcelaine contenant une série de dilutions de l'antibiotique. La zone d'inhibition autour de chaque cylindre sera inversement proportionnelle à la dilution qu'il contient. On établit une courbe qui rapporte le diamètre de la zone d'inhibition à la concentration de l'antibiotique. - en tubes dans une série de tubes, on place une série de dilutions de l'antibiotique. On ajoute à chaque tube un volume égal d'un milieu ensemencé avec la bactérie; ce milieu doit contenir un indicateur du développement bactérien indicateur de pH pour les bactéries fermentantes. La dilution limite qui bloque le développement bactérien est visible au virage de l'indicateur. Cette méthode des dilutions est applicable au titrage d'un antibiotique dans une dilution : sang de malade, extrait d'organe d'animal de boucherie, etc. (Dans ce dernier cas toutefois, on se contente souvent de vérifier la présence d'antibiotique dans la carcasse en déposant un cube de viande ou d'organe (rein, foie) sur un milieu de culture ensemencé.) La détermination de la concentration de l'antibiotique se fait par rapport à une série de tests-témoins, faits avec des dilutions connues.

2°) Méthode de l'antibiogramme En pratique médicale, on préfère se servir de la méthode de diffusion en agar pour caractériser l'antibiotique le plus adapté au traitement de l'infection dont on a pu isoler le germe. Des milieux solides en boite de Pétri sont abondamment ensemencés en tapis avec le micro-organisme isolé et des échantillons de diverses substances, supportés par des disques de papier filtre ou autre, sont déposés sur l'agar. Les concentrations d'antibiotiques diffusent à partir des disques, reproduisent dans le milieu les concentrations obtenues dans les tissus lors du traitement clinique. Si une substance inhibe la croissance de la bactérie ensemencée, une zone claire sans développement microbien va apparaître autour du disque imbibé par elle : le diamètre de la zone claire apporte une indication sur le taux de sensibilité de la bactérie à cette substance. Mais cette indication est quelque peu équivoque, car le diamètre de la zone d'inhibition est influencé par divers facteurs - pouvoir de diffusion de la substance dans l'agar - vitesse de croissance du micro-organisme ensemencé.

7-45

Aussi, en pratique, ne se règle-t-on pas uniquement sur le diamètre de la zone d'inhibition pour choisir l'antibiotique à utiliser chez le patient; d'autres considérations d'ordre pharmacologique entreront en ligne de compte pour ce choix.

Ex.

B. Étude de la cinétique de l'activité antibiotique.

Elle est déterminée par mesure turbidimétrique d'une culture à des moments différents après addition de l'agent étudié. L'allure de la courbe de croissance obtenue dans ces conditions reflète le mode

d'action de cet agent:

Ainsi dans le graphique donné comme exemple, une inhibition par la sulfanilamide n'apparaît qu'après un délai couvrant plusieurs générations. En effet , l'action antagoniste du PAB ne peut être effective dès son introduction dans la culture, l'ac. folique des bactéries continuant à jouer son rôle normal jusqu'à ce que son taux baisse en dessous du taux suffisant dans les descendants, qui héritent de la moitié du pool parental. Par contre, les agents bloquant les synthèses protéiques seront actifs dès le moment de leur introduction. Ex. chloramphénicol, streptomycine. La pénicilline provoque une lyse bactérienne, indiquée par une chute brutale de la

turbidité.

C. Vérification de l'effet Bactéricide ou Bactériostatique Concentration minimale inhibitrice (CMI) et minimale bactéricide(CMB)

Dans le cas de la pénicilline, l'effet lytique constaté par simple mesure de la turbidité suffit à prouver son action bactéricide. Mais pour les substances qui entraînent la mort bactérienne sans modifier la morphologie, la mesure de la densité optique des cultures n'apporte aucun renseignement sur la réalité de cette mort. Il faut dans ce cas recourir à la recherche de viabilité sur des échantillons de culture prélevés à différents intervalles et ensemencés de façon appropriée, en les diluant suffisamment pour éliminer l'action possible de l'agent inhibiteur. On pourra ainsi reconnaître à l'antibiotique une action bactéricide ou bactériostatique. P ex, dans le graphique ci-dessous, la pénicilline et la

7-46

streptomycine démontrent une action bactéricide, tandis que le chloramphénicol et la terramycine n'ont qu'une activité bactériostatique. En pratique thérapeutique, il est contre-indiqué d'utiliser en association un antibiotique bactéricide et un antibiotique bactériostatique. En effet, un antibiotique n'agit en principe que sur des bactéries en phase métabolique active; la bactériostase provoquée par un des antibiotiques s'opposera dès lors à l'efficience de l'autre agent bactéricide. Mais il est permis d'associer deux antibiotiques bactéricides dont les modes d'action sont différents et se complètent : ainsi, l'association pénicilline + streptomycine est d'usage courant. Il faut toutefois signaler que la distinction entre action bactéricide et bactériostatique n'est pas rigoureuse, la limite entre les deux effets pouvant varier avec la concentration de l'agent inhibiteur, la bactérie, des facteurs intercurrents tels que la température, l'association d'agents, etc Certains produits sont donc bactériostatiques à faible dose, bactéricides à concentration plus élevée. Il y a simplement un écart entre la "concentration minimale inhibitrice" CMI et la "concentration minimale bactéricide" CMB. En pratique, il est important de connaître la concentration minimale inhibitrice (CMI) d'un antibiotique, afin de la reproduire en permanence au cours d'un traitement. La mesure de la CMI pour la bactérie isolée du malade peut se faire par la méthode des dilutions en tubes de milieu liquide : le tube contenant la plus faible concentration de l'antibiotique inhibant la croissance bactérienne donne la CMI (voir p. 7.40) Une autre méthode plus simple est basée sur la capacité de l'antibiotique à diffuser dans un milieu gélosé. On réalise dans un 1er temps un gradient de l'antibiotique en coulant successivement du milieu gélosé contenant l'antibiotique, laissé se refroidir dans une boite de forme carrée non horizontalement posée et, après durcissement, une quantité égale de milieu sans antibiotique dans la boite posée horizontalement. La boite est ensuite ensemencée en stries longitudinales avec les bactéries à tester et une souche bactérienne de sensibilité connue. Les longueurs des stries après culture indiquent les sensibilités relatives des bactéries à cet antibiotique.

Mesure de la CMI : technique du gradient en boite

La question peut se poser de savoir pourquoi utiliser un simple bactériostatique pour traiter une infection, dès lors que des bactéries revivifiables pourraient subsister et donner

7-47

naissance à une reprise de l'infection après la cessation du traitement ? La pertinence de ce choix tient à deux raisons qui ont rapport avec les défenses de l'organisme :

a) d'un côté, les défenses naturelles (phagocytose, voie alterne du complément, réaction inflammatoire) peuvent dominer une invasion bactérienne de relativement faible amplitude, mais seront débordées par la multiplication rapide des bactéries. Inhiber celle- ci permet donc la victoire des moyens de défenses naturels.

b) entre-temps, les défenses spécifiques de l'immunité acquise (anticorps, lymphocytes cytotoxiques, macrophages activés, etc.) pourront se mettre en place, grâce au stimulus antigénique des bactéries, inhibées sans doute, mais toujours présentes. De sorte que la terminaison de l'infection, et surtout la protection à plus ou moins longue échéance, seront assurées.

7.5.2.6. Résistance aux antibiotiques

A. Résistance naturelle

Des bactéries démontrent une résistance intrinsèque aux effets inhibiteurs ou létaux de certains antibiotiques particuliers. Cette résistance naturelle sera le plus souvent due aux causes suivantes:

- absence de la cible structurale ou biochimique sur laquelle cet antibiotique agit. par exemple:

les Mycoplasmes, chez lesquels la paroi fait défaut, seront insensibles aux -lactames les bactéries qui ne synthétisent pas elles-mêmes l'ac. folique, ne seront pas inhibées par les sulfamides

- inaccessibilité de la cible parce que la paroi ou la membrane fait obstacle à l'introduction de l'antibiotique par exemple :

différence entre les bactéries Gram positives et négatives quant à leur sensibilité à de nombreux antibiotiques

7-48

- synthèse par la bactérie résistante d'un métabolque inhibiteur de l'antibiotique. Il

s'agit le plus souvent d'une enzyme inductible en réponse à la présence de l'antibiotique, qui

est pour cet enzyme un substrat qu'elle inactive. par exemple :

des -lactamases présentes dans l'espace périplasmique de nombreuses Gram négatives

- induction de voies métaboliques de rechange suite au blocage de la voie principale bloquée par un antibiotique.

B. Résistance acquise

Des espèces bactériennes qui sont normalement sensibles à l'inhibition par un antibiotique, peuvent voir apparaître dans leur population des souche qui y sont résistantes. Cette résistance s'exerce d'ordinaire contre tous les antibiotiques d'un même groupe chimique; par ex: les pénicillines, les tétracyclines, les sulfamides. (résistance croisée) Ces résistances acquises trouvent leur origine soit dans une mutation du génome bactérien lui-même soit dans l'acquisition de matériel génétique exogène qui se recombine avec le matériel génomique bactérien (épisome) ou qui existe à l'état de plasmide indépendant.

1°) Résistance après mutation La résistance d'une bactérie à un antibiotique peut survenir suite à une mutation engendrant une modification d'un élément biochimique indispensable pour sa sensibilité ou la néo-synthèse d'un enzyme altérant l'antibiotique. Ces mutations chromosomiques n'engendrent d'ordinaire que la résistance à un seul antibiotique (ou famille d'antibiotiques); il est en effet exceptionnel que des mutations associées créent une résistance à 2 antibiotiques, et il est pratiquement exclu qu'un état de multirésistance provienne de mutations concomitantes. La résistance ainsi créée peut s'installer d'emblée vis-à-vis de doses fortes de l'antibiotique. C'est la résistance dite "à 1 étage" telle que celle dirigée contre la streptomycine. (voir p 6.10). D'autres types de mutants peuvent apparaître, dont la résistance est progressivement accrue à l'antibiotique. Au début, les premiers mutants ne sont résistants qu'à de faibles doses d'antibiotiques, mais chez les descendants de ces mutants, la résistance s'installe à

7-49

des doses de plus en plus fortes. C'est la résistance à plusieurs étages, elle celle mise en place par la pénicilline.

2°) Transfert de matériel génétique portant des gènes de résistance (R) Une fois qu'une résistance est apparue chez des mutants au sein d'une population bactérienne, la résistance peut se transmettre à des bactéries sensibles par les mécanismes de la transformation, de la transduction ou de la conjugaison, selon que l'un ou l'autre de ces mécanismes est possible dans l'espèce bactérienne considérée. La transmission de résistance liée à du matériel chromosomique est probablement peu fréquente dans la Nature. Par contre, la résistance liée à la présence de matériel génétique extra- chromosomique (épisomes ou plasmides) est aisément transmissible à l'intérieur de l'espèce bactérienne et vers des espèces apparentées. D'autre part, les mécanismes de la résistance plasmidique sont en général différents de la résistance par mutation :

par exemple : la résistance mutationnelle à la Streptomycine siège au niveau des ribosomes qui deviennent insensibles à cet agent, tandis que la résistance plasmidique est le fait d'enzymes, codés par le plasmide, qui inactivent l'antibiotique. Les exemples les mieux connus de pareille résistance plasmidique sont ceux des facteurs R transmettant la résistance dont ils sont le support génique, par conjugaison des entéro-bactéries gram-négatives certains de ces facteurs R sont ainsi le support de multiples rêsistances simultanées. Un état de multirésistance signe donc une origine plasmidique. D'autres plasmides contrôlent la production de pénicillinase par les staphylocoques, parmi lesquels ils se transmettent par transduction bactériophagique. L'envahissement d'une espèce bactérienne par des facteurs R entraîne un accroissement de son importance clinique; c'est ainsi que la pathologie infectieuse, qui était dominée par les Streptocoques fut par après (et encore de nos jours) principalement déterminée par des Entérobactéries, intrinsèquement moins pathogènes mais fréquents porteurs de facteurs R.

C. Sélection des souches résistantes

Dans toute population bactérienne, des individus existent et apparaissent constamment qui possèdent des propriétés s'écartant de la normale. Pour autant que leur nouveau caractère leur soit plus favorable dans le milieu tel qu'il se présente, ces individus

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seront sélectionnés (voir p.6.7) Ce sera le cas pour les bactéries résistantes à un antibiotique lorsque la population sera soumise à l'action de cette substance. Si la résistante résulte de l'induction par l'antibiotique d'une enzyme inhibitrice, l'apparition de résistance sera évitée par l'administration d'emblée et le maintien pendant un temps suffisant de doses suffisamment élevées de l'antibiotique. Il faut toutefois se méfier de voir alors apparaître un phénomène d'Herxheimer, qui consiste en la lyse brutale par un antibiotique de bactéries Gram négatives, entraînant la libération massive d'antigènes et d'endotoxines bactériennes. D'autre part, les autres formes de résistance sont évitées par l'utilisation conjointe de divers antibiotiques choisis en fonction de leurs spectres d'activité, de leur mode d'action, etc