UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIS ESCOLA DE AGRONOMIA E ENGENHARIA DE ALIMENTOS BIOQUMICA DE ALIMENTOS

CAROLINE SCHUSTER JOAQUIM FARIA MARGNUM RESENDE WILLIAN GUIMARES

ESCURECIMENTO ENZIMTICO

Trabalho apresentado ao Programa de Graduao em Engenharia de Alimentos da Escola de Agronomia e Engenharia de Alimentos da Universidade Federal de Gois, como parte das exigncias da disciplina de Qumica e Bioqumica de Alimentos. Professora: Dr Clarissa Damiani

Goinia - GO

2012 SUMRIO
INTRODUO..................................................................................................3 RESULTADOS E DISCUSSO............................................................................4 Teste da inativao da polifenoloxidase.......................................................4 Efeito do bissulfito de sdio na atividade da polifenoloxidase de frutas e vegetais.......................................................................................................5 Efeito do cido ascrbico, cido ctrico, bissulfito de sdio, cloreto de sdio e cido oxlico na atividade da polifenoloxidase de berinjela.......................6 CONCLUSO....................................................................................................8 BIBLIOGRAFIA............................................................................................... 10

INTRODUO
O escurecimento enzimtico de vegetais inicia-se em resposta a injrias fsicas e fisiolgicas (impactos, abrases, chilling, excesso de CO2) como resultado da oxidao de compostos fenlicos. As leses provocadas durante o processamento mnimo levam ao colapso celular e conseqente descompartimentao dessas clulas, promovendo o contato dos compostos fenlicos com enzimas associadas ao escurecimento (PORTE e MAIA, 2001; VILAS BOAS, 2002). De acordo com TOMS-BARBERN e SPN (2001), duas enzimas so relevantes na degradao oxidativa dos compostos fenlicos por causarem a produo de polmeros de colorao marrom (melaninas): a polifenoloxidase (PPO) e a peroxidase (POD). ARAJO (1999) acrescentou que no tecido vegetal intacto de frutas e hortalias tambm pode ocorrer escurecimento. Citou como exemplo as situaes de inibio da respirao durante o armazenamento em atmosfera controlada, o uso de embalagem imprpria, a deficincia de cido ascrbico no tecido vegetal, o armazenamento a frio e a radiao ionizante. WHITAKER e LEE (1995) acreditam que mais de 50% das perdas em frutas ocorrem como resultado do escurecimento enzimtico. MARSHALL, HIM e WEI (2000) indicaram que a alface e outros vegetais verdes folhosos, a batata e fontes de amido (como a batata-doce, fruta-po, inhame, cogumelos e bananas), alm de diversas frutas e hortalias tropicais e subtropicais so susceptveis ao escurecimento enzimtico, causando perdas econmicas para os agricultores. O controle do escurecimento, portanto, torna-se crtico para a diminuio das perdas comerciais do agricultor e para a indstria de transformao. As polifenoloxidases (PPO) (1,2 benzenodiol: oxignio xido-redutase) so denominadas frequentemente de tirosinase, polifenolase, fenolase, catecol oxidase, creolase ou catecolase, dependendo dos substratos utilizados na reao de escurecimento dos tecidos vegetais. As PPO so encontradas nas plantas, nos animais e em alguns microrganismos, especialmente nos fungos, sendo glicoprotenas com massa molecular variando entre 57 a 62 kDa, exceo da PPO do cogumelo, com valor de 128 kDa (ARAJO, 1999). So trs as reaes catalisadas pela PPO na presena do oxignio molecular: a hidroxilao de monofenis a o-difenis (atividade monoxigenase, E.C. 1.14.18.1), a oxidao de o-difenis a oquinonas (atividade difenoloxidase, E.C. 1.10.3.1), e a oxidao de p-difenis a p-quinonas (atividade lacase, E.C. 1.10.3.2) (ZAWISTOWSKI, BILIADERIS e ESKIN, 1991). O mecanismo de ao detalhado da PPO foi descrito por BELITZ e GROSCH (1997). No centro ativo da enzima existem dois ons Cu+, cujos campos de ligao contm dois resduos de histidina cada um. Seguindo mecanismo ordenado, a enzima liga primeiro o oxignio e depois o monofenol, com participao dos intermedirios. Ento, a mudana de valncia dos ons cobre (Cu+ Cu2+) provoca a formao de complexo enzima-substrato, no qual a ligao O O fica to polarizada que ocorre a hidroxilao, seguida da formao de um o-difenol. A oxidao do o-difenol a o-quinona termina o ciclo. As quinonas so compostos amarelados, instveis e reativos que podem: reagir entre si formando polmeros com alta massa molecular de cor escura, denominados melaninas; formar complexos com aminocidos ou protenas; e oxidar compostos com baixo potencial de oxidoreduo (NICOLAS et al., 1994).

RESULTADOS E DISCUSSO
O resultado obtido nos 3 diferentes experimentos podem ser observados no quadro logo abaixo: Quadro 2.1. Fotografias dos experimentos realizados Amostras Resultados

Teste da inativao da Polifenoloxidase

Efeito da concentrao de bissulfito na atividade da polifenoloxidase

Teste da inativao da polifenoloxidase

Foi feita a comparao entre as amostras e observada a colorao, sendo que quanto mais incolor a amostra, melhor a inativao da amostra. Dessa maneira o mtodo de inativao se mostrou efetivo, como observado no quadro 2.1, pois foi possvel notar a 4

diferena entre as amostras com a enzima polifenoloxidase ativa (tubo da direita) e as amostras com a enzima inativa (tubo da esquerda). Porm a comparao visual, como foi feito em sala, no o mtodo mais adequado, pois segundo Neves (2003) a leitura deveria ser feita em espectofotmetro na mesma temperatura de incubao. A soluo tampo (pH=6) utilizada para testar a inativao da polifenoloxidase tambm se mostrou efetiva pois segundo Fennema (2000) o pH tem papel fundamental na maioria das enzimas, no mesmo trabalho Fennema (2000) encontrou que o pH timo para a atividade da polifenoloxidase de 6,0. A frao temperatura/tempo utilizada foi a de 40C por 30 minutos e de acordo com Concellon et al (2004) esta considerada a faixa tima de temperatura para a PPO extrada da maioria dos frutos, o que justifica a utilizao dessa temperatura para testar a inativao da enzima.

Efeito do bissulfito de sdio na atividade da polifenoloxidase de frutas e vegetais

O efeito da mudana de cor ocasionada pela polifenoloxidase pode ser observada no quadro 2.1. No primeiro tubo da esquerda para a direita tem-se a concentrao de 0,01% de bissulfito de sdio, no segundo tubo a concentrao de 0,02% de bissulfito de sdio e no ltimo a concentrao de 0,05% de bissulfito de sdio, sendo est a maior utilizada. Pode-se perceber que com a diminuio da concentrao de bissulfito de sdio a ao da polifenoloxidase mais intensa e com isso a mudana de cor tambm, mas que apenas no primeiro tubo, o qual apresentava menor concentrao de bissulfito houve grande variao e que nos outros dois no houve diferena visual perceptvel ao olho nu, permitindo afirmar ento que as concentraes de 0,02 e 0,05% obtiveram o mesmo efeito. Essa observao de grande importncia na indstria, pois ao se escolher qual dessas concentraes seria a melhor para aplicao em algum vegetal que se deseja inibir o escurecimento, o melhor seria a concentrao de 0,02% e no a de 0,05%, j que na primeira concentrao utilizou-se menor quantidade de reagente do que na segunda e obteve-se o mesmo efeito, o que causaria reduo de custos de produo. Essa inibio constatada devido a ao do bissulfito de sdio no grupo prosttico (Figura 1) da polifenoloxidase.

Figura 1. Grupo prosttico da polifenoloxidase. (Cobre) Com isso esta enzima perde a capacidade de hidroxilao dos fenis, comprometendo assim o escurecimento enzimtico. O bissulfito de sdio tambm tem a capacidade de reverter essa hidroxilao dos fenis, com isso se o escurecimento enzimtico j tiver ocorrido esta substncia pode reverter o processo. Na maioria dos casos os sulfitos no inibem o escurecimento enzimtico irreversivelmente, pois eles so consumidos nas reaes. Por essa razo a concentrao requerida dos sulfitos depende do tempo que o escurecimento da fruta precisa ser inibido. (VLASTA, 1998) Outros estudos demonstram que o bissulfito de sdio eficiente em inibir a ao das polifenoloxidases. Em um estudo feito por Cardoso (2007) utilizando um colormetro porttil de marca MINOLTA na escala CIELAB foi encontrado resultados semelhantes. Em 0mg/Kg o valor mdio de L* foi de 55,0A, em 50mg/kg foi encontrado 65,7 A, em 100 mg/kg 76,2A e em 200 mg/kg 79,9A. Observando que o valor de L* significa o nvel da cor branca no alimento.

Efeito do cido ascrbico, cido ctrico, bissulfito de sdio, cloreto de sdio e cido oxlico na atividade da polifenoloxidase de berinjela
Os sulfitos e seus derivados, como o bissulfito de sdio (NaHSO3) utilizado em aula, podem agir diretamente na polifenoloxidase pela diminuio do nmero de pontes dissulfeto no centro cataltico (SAYAVEDRA-SOTO & MONTGOMERY, 1988; WALKER & FERRAR, 1998), ou nos compostos de reao, formando sulfonatos sem colorao, ou reduzindo-os aos fenis precursores (WONG, 1995; ARAJO, 1999). Nesses ltimos casos, a preveno perante ao escurecimento apenas temporria, uma vez que h o consumo do agente qumico (SAPERS, 1993), mostrando assim que esse agente utilizado teve um timo desempenho no escurecimento, mas resultado esse que pode ser falso, j que o tempo que o bissulfito ficou em contato com a berinjela foi curto, o qual no foi suficiente para consumo do reagente. 6

E apesar da eficincia do NaHSO3 ao evitar o escurecimento da berinjela, ele causou alta descolorao na casca do vegetal, o que o torna contra indicado para a inibio da enzima, caso a berinjela seja comercializada com a casca. Mas, tal efeito ocorreu devido a interao do composto sulfurado como pigmento da casca, onde se deu uma reao de adio, no qual, a dupla ligao quinoidal do corante, sofreu uma ciso e incorporou a espcie inorgnica atravs da ligao com o tomo de enxofre no carbono central do pigmento, provocando sua descolorao (VOGEL, 1981; DASGUPTA, DECESARE & ULLREY, 1980) Alm dele, tambm se empregou o cido ascrbico, ou vitamina C, com o intuito de prevenir o escurecimento e outras reaes oxidativas, por duas maneiras: agindo diretamente na enzima, complexando o cobre do grupo prosttico da PPO, causando sua inibio ou reduzindo as quinonas a sua forma anterior de fenis, impedindo a formao dos pigmentos escuros (SAPERS & MILLER, 1998). A reduo das quinonas aos seus precursores fenlicos leva oxidao irreversvel do cido ascrbico (que preferencialmente oxidado em relao aos compostos fenlicos) e formao de cido dehidro ascrbico sem atividade inibitria (MARSHALL, KIM & WEI, 2000). Isso explica a eficincia desse cido na inibio da enzima, j que se notou pequeno escurecimento, mas ainda alguns autores relatam que a eficincia do cido ascrbico pode ser potencializada combinando-o com outros agentes como cloreto de clcio e cistena (SAPERS & MILLER, 1998; REIS et al., 2004; MELO & VILAS BOAS, 2006). Mas assim como o cido ascrbico, o ctrico e o oxlico, permitiram baixo escurecimento das fatias de berinjela, j que todos so usados para manter o pH do meio abaixo do timo para a ao cataltica da enzima em alimentos, no caso a berinjela (ZEMEL et al., 1990). De acordo com Richardson e Hyslop (2000), os grupos ionizveis da estrutura protica da polifenoloxidase so afetados pelo pH do meio. Esses grupos devem permanecer na forma inica apropriada para manter a conformao do stio ativo da enzima, reconhecer os substratos e catalisar a reao. Mudanas no grau de ionizao das enzimas so geralmente reversveis, exceto em condies extremas de mudana de pH, o que pode afetar tambm a estabilidade dos substratos. Mas, importante ressaltar que o pH timo da PPO varia conforme a fonte e o substrato disponvel (VAROQUAX & WILEY, 1997; LAURILA, KERVINEN & AHVENAINER, 1998; EVANGELISTA, 2001). Um estudo feito por Paschoalino et al. (1993), mostrou que a combinao dos cidos ctrico e ascrbico, ambos a 0,3%, e embalagem com baixa permeabilidade de oxignio para conservao de batatas minimamente embaladas, favoreceu a conservao do produto sem escurecimento e com boa textura por 17 dias. A imerso do tecido vegetal em gua aps injria mecnica ou corte faz com que a reao de escurecimento enzimtico no ocorra, pois necessrio alm da enzima polifenoloxidase se ligar ao seu substrato, o oxignio. Na gua a concentrao do O2 muito limitada quando comparada com a concentrao do ar, por esse motivo na gua a reao de escurecimento enzimtica mais lenta, no entanto ela ainda ocorre. (SILVA, MEDEIROS & LOPES, 2010). Esta foi a amostra utilizada como controle, visto que as outras amostras estavam em meio aquoso, resultando na colorao mais intensa do estudo. O NaCl no apresentou um bom resultado para o bloqueio da reao de escurecimento enzimtico visto que a colorao ficou muito prxima ao controle. Segundo Silva et al. (2010), em seu estudo, uma concentrao de 0,05% foi responsvel pela colorao do lquido que circundava a berinjela classificada como marrom de intensidade forte e a concentrao 0,1% gerou uma colorao marrom de 7

intensidade muito forte. Assim, considera-se que o NaCl tem uma ao fraca para o bloqueio desta reao.

CONCLUSO
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Os diferentes experimentos realizados permitiram averiguar o efeito da ao da enzima polifenoloxidase, mostrando que ela causa escurecimento, o qual pode ser inibido por diferentes reagentes e em distintas concentraes para se obter o efeito inibitrio desejado, como verificou-se na colorao da berinjela.

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