Universidad Nacional Jose Faustino Sanchez Carrion

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA E.A.P. MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA: BIOLOGIA GENERAL, MOLECULAR Y CELULAR CICLO DOCENTE TEMA ALUMNO : : : : I SEGAMI SALAZAR DANIEL HUGO REACCIN EN CADENA POLIMERASA REGALADO PANANA ROGER ESTEBAN

HUACHO 2012

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I.

INTRODUCCIN

Reaccin en cadena de la polimerasa (RCP), tcnica de biologa molecular mediante la cual un pequeo fragmento de cido desoxirribonucleico (ADN) se clona o duplica varias veces para obtener copias mltiples. La RCP puede utilizarse para identificar individuos a partir de cantidades mnimas de tejidos o sangre, para diagnosticar enfermedades genticas y para investigar la evolucin. La RCP fue ideada por el bioqumico estadounidense Kary B. Mullis en 1983 y desarrollada posteriormente por Mullis y su colaborador Fred A. Faloona en laCetus Corporation de Emeryville, California. Aunque la utilidad de esta tcnicano se reconoci inmediatamente, en 1991 su uso ya se haba generalizado. En1993 Mullis obtuvo el Premio Nobel de Qumica por este trabajo. La RCP opera en forma de ciclos. Cada ciclo duplica la cantidad de ADN, por lo que permite obtener hasta mil millones de copias de un solo fragmento en unas pocas horas. La tcnica es sencilla y pueden utilizarla cientficos sin demasiada formacin en biologa molecular. Los elementos necesarios para llevarla a cabo se comercializan en forma de juego, y se utilizan en medios muy variados, desde la investigacin forense hasta el diagnstico clnico

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II. REACCIN EN CADENA POLIMERASA

El mtodo se basa en las caractersticas de la estructura qumica del DNA y su replicacin semiconservativa. Es decir, de acuerdo con el modelo de Watson y Crick, el DNA es un polmero formado por dos cadenas complementarias (cadenas antiparalelas), constituido por unidades de desoxirribonucletido de cuatro bases nitrogenadas adenina, guanina, citosina y timina unidas al azcar desoxirribosa. La parte que no vara en la molcula del DNA consiste en la desoxirribosas unidas por grupos fosfato. Especficamente el hidroxilo 3 del azcar de un desoxirribonucletido se une al hidroxilo 5 del siguiente azcar a travs del puente fosfodiester. Para duplicarse, el DNA se separa en sus dos cadenas complementarias; as, cada una de ellas sirve de molde o plantilla. Al final del proceso se obtendrn dos molculas de DNA, cada una de ellas formada por una cadena original y una cadena complementaria que ha sido sintetizada de novo La enzima que realiza este proceso se denomina DNA polimerasa. Esta enzima aade los nucletidos en el hidroxilo 3 terminal de la cadena de DNA paterna. En otras palabras, se requiere una cadena con un grupo 3 OH disponible, el cul es el iniciador, para formar el enlace covalente fosfodiester 3 5. La reaccin de alargamiento, catalizada por el DNA polimerasa, consiste en un ataque nucleoflico del tomo de fsforo del desoxirribonucletido (dNTP) al 3 OH del iniciador, para formar la unin covalente fosfodiester.

El aspecto ms importante de la doble hlice de DNA es la especificidad de apareamiento de las bases modelo de Watson y Crick, quienes dedujeron que la adenina debe aparearse con la timina, y la guanina con la citosina, debido a las uniones hidrgeno que se establecen entre las bases y a la restriccin esfrica que se produce. Las dos cadenas de DNA se separan fcilmente cuando las uniones hidrogeno de las bases se rompen. Esto se realiza cuando una solucin de DNA es calentada entre 77 y 100C. Las bases complementarias se reasocian espontneamente para formar la doble hlice puede separarse y reasociarse es crucial para las funciones biolgicas del DNA. El mtodo RCP (Reaccin en cadena de la polimerasa) emplea ciclos repetidos de sntesis in vitro del DNA dirigida por un oligonucletido iniciador. Las secuencias de los oligonucletidos iniciadores se determinan en base a una parte conocida de la
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secuencia del DNA molde, ya que deben ser complementarias a cada una de las cadenas del DNA, dejando libres los lados opuestos para poder ser amplificados. Dichos oligonucletidos sirven como iniciadores para la sntesis in vitro del DNA, la cual es catalizada por la enzima DNA polimerasa, y ellos tambin determinan los extremos del fragmento del DNA final que se obtiene. La distancia entre los oligonucletidos iniciadores es determinada empricamente y depende de muchos factores. La longitud entre los oligonucletidos iniciadores para ensayos de diagnstico puede ser entre 50 y 1500 bases de nucletidos.

FUNCIONAMIENTO
La reaccin en cadena de la polimerasa imita el fenmeno de replicacin o reproduccin del ADN que ocurre de forma natural en las clulas vivas. La mayor parte del ADN es de doble cadena (es decir, cada cadena de ADN est apareada con otra complementaria). Durante la replicacin las dos cadenas se separan y una enzima (una protena que inicia reacciones qumicas) especializada llamada polimerasa hace una copia de cada una de las cadenas, utilizando la original como plantilla o modelo. Normalmente este proceso de copia tiene lugar cuando la clula se divide y da lugar a la formacin de un par de cadenas hijas por cada una de las cadenas parentales. La polimerasa necesita otros dos ingredientes para copiar ADN. El primero es una reserva de los cuatro bloques bsicos que constituyen la molcula de ADN, llamados nucletidos o bases. El segundo es una fibra corta de ADN copiado, que se llama cebador oligonucleotdico; est formado por varios nucletidos que inician la replicacin. La RCP utiliza estos mismos ingredientes para copiar ADN en una ampolla. La reaccin tiene lugar en tres fases. Durante la primera fase o desnaturalizacin la plantilla o fragmento original de ADN se calienta hasta una temperatura de 90a 95C durante 30 segundos; esto provoca la separacin de las dos cadenas En la segunda fase, llamada templado, la temperatura de la mezcla se rebaja hasta 55C durante 20 segundos para que los cebadores oligonucleotdicos se enlacen con el ADN escindido. En la tercera fase o de polimerizacin, la temperatura de la mezcla se eleva hasta 75 C para que la polimerasa copie rpidamente la molcula de ADN. Estas tres fases tienen lugar en la misma ampolla y constituyen un ciclo completo de RCP, que se realiza en menos de dos minutos. Tericamente, el ciclo de RCP se puede repetir sin lmite, pero la polimerasa, los nucletidos y los cebadores suelen renovarse al cabo de unos 30 ciclos. Estos 30 ciclos, que duran menos de tres horas, bastan para producir mil millones de copias de ADN. La polimerasa utilizada en los primeros experimentos de RCP resultaba fcilmente destruida por el calor, lo que obligaba a aadir ms enzima en cada ciclo para sustituir a la inactivada por las elevadas temperaturas de la primera fase. Pero en las versiones modernas de la RCP se utiliza una polimerasa termoestable llamada Taq. Inicialmente se extraa de Thermus aquaticus, una bacteria termfila que
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vive en los manantiales de agua caliente del Parque nacional de Yellowstone (Estados Unidos). Como la polimerasa Taq no resulta destruida por las elevadas temperaturas a las que transcurre la RCP, basta con aadirla una vez, al principio de la reaccin. La polimerasa Taq se fabrica ahora con bacterias modificadas genticamente. El uso de la RCP exige mucho cuidado. Lo ms importante es evitar la contaminacin de la mezcla reactiva. Es tan sensible, que permite multiplicar accidentalmente cantidades mnimas de ADN contaminante. Se utilizan procedimientos especiales para evitar la contaminacin

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ANALISIS POR LA REACCIN EN CADENA POLIMERASA

La reaccin en cadena de la polimerasa (conocida como PCR por sus siglas en ingls, Polymerase Chain Reaction) p e r m i t e a m p l i f i c a r m s d e u n m i l l n d e veces un ADN obtenido a partir de una regin seleccionada del genoma, siempre y cuando se conozca una parte de su secuencia de nucletidos. Esta tcnica fue ideada en 1989 por Kary B. Mullis que obtuvo el premio Nobel de Qumica en 1993 por dicho invento. Para la PCR se utilizan dos oligonucletidos sintticos de unos 15-20 nucletidos que son complementarios a las zonas flanqueantes de la regin que se quiere amplificar. Estos oligonucletidos (habitualmente conocidos por su nombre en ingls, "primers") actan como cebadores para la sntesis in vitro de ADN la cual est habitualmente catalizada por una enzima llamada Taq polimerasa. Dicha enzima se asla de una bacteria termfila, denominada Thermus Aquticus, que es capaz de crecer a temperaturas elevadas ( 79 85C). A esta temperatura dicha enzima es capaz de mantener una media de extensin de ms de 60nucletidos por segundo en regiones ricas en uniones G-C. La temperatura optima a la que acta la Taq polimerasa permite el uso de elevadas temperaturas para la unin de los primers y para la extensin, de esta manera se aumenta el nivel de exigencia de la reaccin y se reduce la extensin de los primers unidos inespecficamente al ADN. La reaccin se lleva a cabo en una serie de ciclos cada uno de los cuales incluye tres fases o pasos: DESNATURALIZACIN: Para que comience la reaccin es necesario que el ADN molde se encuentre en forma de cadena sencilla. Esto se consigue aplicando temperaturas de 90 a 95C que producen la rotura de los puentes de hidrgeno intercatenarios y por lo tanto la separacin de ambas cadenas. Para conseguir la completa separacin de las hebras de toda la muestra esta temperatura debe mantenerse unos minutos. Si el ADN solo se desnaturaliza parcialmente ste tender a renaturalizarse rpidamente, evitando as una eficiente hibridacin delos primers y una posterior extensin HIBRIDACIN: Esta fase se denomina tambin fase de annealing o de e m p a r e j a m i e n t o . U n a v e z q u e e l A D N e s t d e s n a t u r a l i z a d o s e d i s m i n u ye l a temperatura hasta un rango comprendido entre los 40 y los 60C para que se pueda producir la unin de los primers a las secuencias flanqueantes del fragmento que se va a amplificar. La temperatura de fusin o annealing (Tm, melting temperature) depende de varios factores y es relativamente especfica para cada primer. La longitud de los primers y la secuencia son crticas en la designacin de los parmetros de una amplificacin, una frmula simple para calcular Tm se utiliza lo siguiente la siguiente:
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Tm = 4(G+C) + 2 (A+T). No obstante, cada primer exige una serie de estudios experimentales para determinar su temperatura de annealing especfica y a q u e s i l a temperatura es muy baja la unin se har de forma inespecfica y si es muy alta no se producir una unin completa

EXTENSIN: Durante este paso la Taq polimerasa incorpora nucletidos en el extremo 3' del primer utilizando como molde la cadena de ADN previamente desnaturalizada. La temperatura a la que se lleva a cabo este paso suele ser de 72C ya que es la temperatura a la que la Taq polimerasa alcanza su mxima actividad. Normalmente una extensin de 20 segundos es suficiente para fragmentos menores de 500 pb, y 40 segundos para fragmentos por encima de1.2Kb.Un factor importante en el transcurso de las diferentes fases es el tiempo de rampa. Este se define como el tiempo invertido en pasar de una temperatura a otra y depende del diseo y de las caractersticas del aparato donde se realiza automticamente este proceso, el termociclador. En las nuevas generaciones de termocicladores este factor se ha ido optimizando para hacerlo mnimo

COMPONENTES
BUFFER DE AMPLIFICAC IN Los buffer de PCR que se utilizan normalmente contienen KCl, Tris y MgCl2. El MgCl2 es el componente que ms influye en la especificidad y rendimiento de la reaccin ya que los iones Mg+2 son n e c e s a r i o s p a r a l a a c t i v i d a d d e l a Taq polimerasa, es decir, actan como cofactores de la polimerasa. L a c o n c e n t r a c i n p t i m a d e M g C l 2 est en torno a 1.5 mM si se emplean concentraciones de 200 mM de cada uno de los dNTPs. No obstante, a veces es necesario probar con diferentes cantidades de Mg ya que un exceso del mismo origina una
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acumulacin de productos inespecficos y una cantidad insuficiente hace que disminuya el rendimiento de la amplificacin PRIMERS A la hora de elegir unos primers para amplificar un determinado fragmento de ADN hay una serie de reglas a seguir: La longitud de cada uno de los primers debe estar comprendida entre 18 y 24 bases ya que se ha comprobado que primers de mayor longitud (30-35 bases) no aumentan el rendimiento y los primers cortos carecen de suficiente especificidad. Ambos primers deben tener una Tm similar (como mucho la diferencia entre ambas temperatura debe ser de 5C). La relacin bases pricas: bases pirimidnicas debe ser 1:1 (o como mucho40-60%). La secuencia de los primers debe comenzar y terminar con 1-2 bases pricas. Para evitar la formacin de dmeros de primers es necesario comprobar que los primers no contengan secuencias complementarias entre s. Los dmeros de primers consisten en fragmentos de doble cadena cuya longitudes muy prxima a la de la suma de los primers y se producen cuando un primer es extendido a continuacin del otro. El mecanismo exacto por el que se forman estos dmeros no est completamente determinado. La observacin d e q u e primers con los extremos 3' complementarios favorecen su formacin sugiere que el paso inicial se debe a interacciones transitorias que aproximan los extremos complementarios. Algunas polimerasas, incluida la Taq, han mostrado una dbil a c t i v i d a d polimerizadora no dirigida por un ADN patrn, la cual puede unir nucletidos adicionales al doble extremo apareado. Si esta actividad puede producirse sobre una hebra sencilla de oligonucletidos, resultara una buena oportunidad para que la extensin formara un corto solapamiento en el extremo3' con el otro primer, suficiente para promover la formacin del dmero

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DESOXINUCLETIDOS TRIFOSFATOS Las concentraciones de dNTPs que suelen usarse estn en torno a 200 M para cada uno de ellos. En un volumen de reaccin de 25 l con esta concentracin de dNTPs se sintetizaran entre 6 - 6.5 g de ADN. La concentracin de dNTPs y de MgCl2 va relacionadas ya que el Mg se une a los dNTPs con lo que concentraciones elevadas de dNTPs inhibiran la reaccin al no tener la Taq polimerasa suficiente Mg como para incorporar dNTPs. Para una concentracin de 200 M de cada dNTP se suele aadir MgCl2 a una concentracin de 1.5 mM. TAQ-POLIMERASA Las cantidades ptimas de Taq polimerasa necesarias para la sntesis de ADN estn alrededor de 2 unidades en 25 l de volumen final de reaccin. La actividad de este enzima se ve influenciada por la concentracin de dNTPs, de Mg+2 y de algunos iones monovalentes de manera que concentraciones elevadas de los mismos inhiben dicha actividad. Por otro lado, pequeas concentraciones de KCl estimulan la actividad sinttica de la Taq en un 50-60% con un mximo aparente cuando su concentracin es de50 mM. Existen algunos datos relacionados con la influencia de ciertos reactivos que se emplean antes de la amplificacin y que alteran la actividad de la Taq. Por ejemplo concentraciones 1M de urea estimulan la actividad, el SDS a bajas concentraciones que la inhibe al igual que concentraciones mayores del 10% de etanol

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ADN MOLDE O TEMPLATE" Es el ADN del cual queremos copiar un determinado fragmento, es, por tanto, el ADN que la Taq polimerasa utiliza como molde para la sntesis de nuevas cadenas polinucleotdicas. La cantidad de ADN necesaria para la PCR depende de varios factores: Del marcador que se va a amplificar: hay marcadores cuyos primers son ms especficos o bien cuyas condiciones de amplificacin estn mejor optimizadas que las de otros. Por esta razn puede darse el caso de que cierta cantidad de ADN (sobre todo cuando jugamos con cantidades mnimas) amplifique para unos marcadores pero no para otros. Por ello, cuando en un laboratorio se va a utilizar un nuevo marcador es necesario hacer un estudio de validacin en l que se incluye un estudio de sensibilidad. De dicho estudio de sensibilidad puede sacarse como conclusin cul es la mnima cantidad de ADN que amplifica en condiciones estndar. De manera general, para casi todos los STR utilizados en Gentica Forense la cantidad ptima de ADN que asegura un rendimiento adecuado est en torno a los 5 g. Calidad del ADN: Cuando se trabaja con ADN cuya calidad es ptima no suele haber problemas en la amplificacin y cantidades del mismo por encima e incluso por debajo de los 5 g rinden buenos resultados. El problema aparece cuando la calidad del ADN obtenido no es la idnea, bien porque est degradado o bien porque dicho ADN vaya ligado a una serie de contaminantes que pueden inhibir la actividad de la polimerasa. Si el ADN est degradado por la accin de enzimas de restriccin el que obtengamos o no resultado en la amplificacin va a depender de que el fragmento a amplificar haya sido daado o no. En el caso en el que tengamos ADN sin degradar pero unido a una serie de contaminantes habra que intentar diluir al mximo la muestra para disminuir dichos contaminantes, pero siempre dentro de un rango de ADN que no est por debajo del lmite de sensibilidad de la PCR. El problema de las cantidades mnimas de ADN y la presencia de contaminantes o inhibidores de la Taq es un hecho habitual en criminalstica y requiere un estudio pormenorizado de la muestra antes de la amplificacin

TIPOS DE REACCIN EN CADENA POLIMERASA PCR ANIDADO NESTED PCR Se utiliza para acotar un resultado. Comprende dos reacciones de PCR. La primera amplificacin de dos fragmentos resultantes. La segunda reaccin trabaja sobre los fragmentos obtenidos en la 1era reaccin.

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Este modo es ms especfico, ya que cuando la Taq trabaja con grandes cantidades de DNA, su fidelidad disminuye. En cambio con este mtodo, se trabaja con fragmentos cortos desde la segunda reaccin lo que hace ms efectivo el proceso

PCR MULTIPLE Se lleva a cabo la reaccin de PCR tradicional, pero con ms de dos primers, para amplificar varias regiones al mismo tiempo. Se puede utilizar para identificar especies

PCR INVERTIDO En este caso, la nica diferencia es que los primers, en vez de converger, divergir, divergen desde un punto. Es decir que en caso de ser DNA lineal de doble hebra, los productos sern dos hebras que no necesariamente se complementan. En cambio si se lleva a cabo en un plsmido, si se podra a llegar un producto DNA de doble hebra.
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RAMDOM AMPLIFICATION OF POLIMORPHIC DNA (RAPD) Aqu se utilizan varios primers, y se espera que amplifiquen varios segmentos del DNA en estudio. Mediante este mtodo, se puede obtener un patrn semi nico, que podra ser caracterstico para cada especie. Los primers aqu utilizados, tiene un largo de 6 12 nucletidos.

REAL TIME PCR (r t PCR) Es una versin mejorada del tradicional PCR. Taq Man: en este real time PCR, se aade una sonda que puede alinear con el trmino de la amplificacin de una hebra. Esta sonda contiene un fluoruro complejado a un extremo del fragmento de alinea, y en otro extremo hay un compuesto quencher, que por ende absorbe la luz emitida por el fluoruro.
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Cuando el DNA polimerasa llega hasta la ubicacin de la sonda unida al fragmento de DNA, la actividad exonucleasa de la enzima, rompe el DNA sonda, y el quencher se aleja del fluoruro, esto se refleja como un aumento de luminiscencia en la muestra. La cual se puede cuantificar para estimular la cantidad de DNA amplificado

ADYUVANTES DE LA PCR Son elementos que mejoran el rendimiento y la especificidad de la PCR. Aunque algunos autores han recomendado el uso del DMSO y del glicerol, el adyuvante ms extendido y utilizado es el BSA. A concentraciones por encima de 0.8 g/l el BSA incrementa la eficiencia de la PCR ya acta como una protena captadora de iones que pueden ser inhibidores de la Taq polimerasa. La PCR ofrece una serie de ventajas, frente al uso de las tcnicas de anlisis gentico utilizadas con anterioridad, como son: Su capacidad para obtener resultados en casos en los que la cantidad de ADN es mnima o en casos en los que el ADN est parcialmente degradado. Genera en un espacio corto de tiempo un elevado nmero de copias de la secuencia de ADN que es objeto de estudio, lo cual permite utilizar tcnicas de visualizacin ms sencillas y rpidas que el uso de sondas marcadas radioactivamente. Permite la determinacin y agrupacin allica en clases discretas, lo que facilita la elaboracin de bases de datos al ser la estandarizacin inmediata y posibilitar la aplicacin de mtodos bioestadsticos y programas elaborados. El uso de marcadores microsatlites de pequeo peso molecular aumenta las probabilidades de obtener resultados positivos de amplificacin cuando el ADN se encuentra degradado ya que puede ser que dichos fragmentos no hayan sido digeridos. Esta ventaja es de gran importancia en Criminalstica ya que normalmente los indicios biolgicos encontrados han estado sometidos a diversos factores (calor y humedad) que favorecen el crecimiento bacteriano.
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Sin embargo, una de las grandes ventajas de la PCR que es su elevada sensibilidad puede, en ocasiones, convertirse en un gran problema ya que se podra coamplificar un ADN extrao o ajeno al que nos interesa. No obstante, en los laboratorios de Gentica Forense las medidas de precaucin que se toman para evitar problemas de contaminacin por manipulacin son extremas. Una vez amplificado el ADN, los fragmentos resultantes son separados en funcin de su tamao por medio de un proceso de electroforesis. Actualmente se utilizan dos tipos de electroforesis en los laboratorios de Gentica Forense: Electroforesis en geles verticales de poliacrilamida Electroforesis capilar La electroforesis capilar es una tcnica relativamente novedosa en el campo dela Gentica Forense pero que est poco a poco sustituyendo a los sistemas de electroforesis vertical. En este caso el proceso electrofortico es llevado a cabo en un capilar de silica de unas 50m de dimetro, lo cual hace que la cantidad de calor generado sea menor y que puedan aplicarse voltajes mayores. Para que puedan ser analizados por electroforesis capilar los primers o los dideoxinucletidos (en el caso de la secuenciacin) deben ser marcados fluorescentemente con unas molculas denominadas fluorocromos que emiten fluorescencia a una determinada longitud de onda cuando son excitados por lser. El equipo en el que se realiza el proceso lleva acoplado un ordenador encargado de traducir los datos de emisiones fluorescentes en secuencias o fragmentos con sus correspondientes alelos asignados. La electroforesis capilar presenta una serie de ventajas frente a los sistemas de electroforesis vertical como son: Rapidez: ya que permite el anlisis simultneo de varios loci aunque estos posean alelos con tamaos solapantes. Sensibilidad: hace posible detectar cantidades muy pequeas de ADN amplificado. Los resultados se obtienen de manera informatizada, lo que evita problemas de interpretacin de los resultados y facilita el anlisis de los mismos a travs de programas informticos.

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III.

UTILIDAD MEDICA

El diagnstico molecular est revolucionando la prctica clnica de enfermedades infecciosas. Sus efectos sern importantes en la configuracin de la atencin de casos agudos donde oportunas y precisas herramientas de diagnstico son esenciales para las decisiones de tratamiento del paciente y los resultados. PCR es la tcnica molecular ms desarrollada hasta ahora y tiene una amplia gama de aplicaciones clnicas, incluyendo la deteccin de patgenos especficos o de amplio espectro, evaluacin de las infecciones emergentes, la vigilancia, la deteccin temprana de agentes biolgicos y la creacin de perfiles de resistencia a los antimicrobianos. Los mtodos basados en PCR tambin pueden asociarse a los procedimientos tradicionales de diagnstico. Otro avance de la tecnologa es necesario para mejorar la automatizacin, optimizar la sensibilidad y especificidad y expandir la capacidad para detectar varios organismos simultneamente. La PCR convencional es utilizada como base para un gran nmero de tcnicas en el laboratorio debido a su especificidad y rapidez. Permite identificar especies de bacterias que producen determinados cuadros infecciosos. Esto se consigue, amplificando cierta zona del genoma bacteriano cuyo producto de PCR posea caractersticas particulares que permitan identificar de una manera inequvoca la bacteria o agente causal. En el caso de infecciones virales, que implican la integracin del genoma del patgeno en el ADN del hospedador, como es el caso de la infeccin por VIH, la PCR cuantitativa posibilita la determinacin de la carga viral existente y por tanto, del estadio de la enfermedad De igual manera, la PCR es usada en servicios de donantes de sangre para test de rutina. Mediante la implementacin de la PCR, se pueden detectar infecciones peligrosas en el donante (HIV, Hepatitis B) mientras an estn en el perodo de incubacin. A su vez, en el diagnstico de enfermedades hereditarias presentes en el genoma, en las cuales los procedimientos se presentan largos y engorrosos, la PCR ha venido a facilitar este problema, amplificando mediante iniciadores correspondientes los diferentes genes para la identificacin de mutaciones existentes. EN DERMATOLOGA La aplicacin de la PCR en las enfermedades de la piel ha permitido conocer los mecanismos ntimos de muchas entidades, facilitando su diagnstico e incluso su tratamiento. Esta tcnica es ampliamente utilizada en el diagnstico de enfermedades de la piel producida por parsitos, virus y bacterias; tales como leishmaniasis, lepra, oncocercosis y virus de papiloma, entre otras, ampliamente reportadas en la literatura.

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La reaccin se lleva a cabo un par de oligonucleotidos obtenidos a partir de una secuencia repetida de ADN nuclear de Leishmania braziliensis. Los oligos amplifican un fragmento de 603 pares de bases en L. braziliensis (banda mostrada en la figura). La reaccin se realiz utilizando como molde ADN total extrado a partir de biopsias de pacientes con leishmaniasis cutnea localizada y es evidente la sensibilidad y especificidad en el diagnstico. Las enfermedades hereditarias de la piel se caracterizan por mutaciones genticas. El diagnstico molecular por PCR est hoy en da disponible para mltiples enfermedades en las que anteriormente no se dispona de tcnicas diagnsticas de laboratorio sino solamente la clnica. El diagnstico mediante PCR de las enfermedades hereditarias ofrece dos ventajas claras: en primer lugar, es notablemente sensible y con frecuencia es suficiente disponer de una sola clula nucleada, y en segundo lugar, todas las clulas del organismo contienen el mismo ADN lo que conlleva un riesgo elevado de tumores malignos 19. En otras enfermedades hereditarias existe una produccin proteica defectuosa, frecuentemente en la zona de la membrana basal, como sucede en la Epidermlisis ampollosa distrfica y juntural que se manifiesta clnicamente como fragilidad cutnea y formacin de ampollas sub- epidrmicas originadas por un trauma mnimo. En cuanto a las variantes de la PCR, estas tcnicas han sido implementadas para el diagnstico de numerosas enfermedades de la piel. Por ejemplo, la RT-PCR, puede ser aplicada para detectar translocaciones en los tumores de piel y partes blandas, como en el Liposarcoma mixoide y en sus variantes pobremente diferenciadas. Una lista larga de cambios cromosmicos de tumores en dermatologa se ha podido determinar con la implementacin de la RT-PCR. En cuanto a las enfermedades congnitas o degenerativas de la piel se han descrito numerosas alteraciones cromosmicas que pueden igualmente ser detectadas por esta variante de la PCR. De igual manera, las variantes PCR asimtrica, PCR anclada y PCR anidada sirven para aumentar la sensibilidad y especificidad de la reaccin y se utilizan cuando partimos de cantidades muy bajas de ADN problema. Se han diseado protocolos de consenso especficos para la deteccin de un amplio espectro de Virus de papiloma humano (VPH) cutneos no genitales o asociados a epidermodisplasia verruciforme. Por ejemplo en tejidos incluidos en parafina, el estudio de productos de PCR anidada obtenidos con iniciadores que codifican una protena de 65 KDa comn a todas las micobacterias, se ha observado que en un 80% de las lesiones cutneas de sarcoidosis, una enfermedad granulomatosa sistmica, se ha podido identificar ADN de micobacterias.

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Mediante el anlisis del patrn de enzima de restriccin en estos productos de PCR (PCR/REPA) se han sub-clasificado las micobacterias detectadas en estos tejidos y han sido M. tuberculosis complex, M. aviumintracellulare y M. kansasii. Con la variante "anidada" de PCRelectroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacin se detecta hasta un 90% de clonalidad en el receptor TCR-gamma en lesiones de micosis fungoides en todos los estudios. A su vez, el PCR multiplex, ha sido de gran utilidad en la deteccin del gen de la distrofina en la distrofia muscular de Duchenne. De igual manera, empleando esta tcnica y sondas flurognicas se puede diagnosticar la enfermedad en varios tipos de muestra. En lo que respecta a la variante PCR In situ, esta se realiza sobre cortes de tejidos o extensiones citolgicas, y posteriormente se detectan los productos amplificados en el lugar donde se encuentra el ADN. Con esta tcnica, se ha podido detectar una nica copia del genoma del VPH en una clula determinada. En otros estudios utilizando PCR se han podido determinar los genes involucrados en la atriquia universal congnita o atriquia con lesiones papulosas (una forma hereditaria de alopecia, en el que la prdida de pelo ocurre poco despus del nacimiento y aos despus se sigue una erupcin papulosa difusa). Igualmente en la porfiria cutnea tarda espordica se ha estudiado la mutacin de un gen similar a MHC clase I cuya mutacin se piensa que es la causa de la hemocromatosis. En la dermatitis atpica, el estudio mediante PCR-RFLP en sangre perifrica muestra un predominio significativo (85%) de homocigotos para alelos acetiladores lentos (Nacetiltransferasa 2, NAT2) entre los pacientes con dermatitis atpica, frente a un 54% en sujetos sanos. Otros estudios describen una mayor frecuencia de acetiladores rpidos en pacientes con dermatitis alrgica de contacto que en controles En familias japonesas se ha observado que las diferencias en la actividad transcripcional del gen de IL4 influyen en la predisposicin a dermatitis atpica, al estudiar el polimorfismo del gen IL4. En otros estudios, usando marcadores muy polimrficos, se observa vnculos entre la dermatitis atpica y marcadores del cromosoma 11q13 (como D11S903 y el gen del receptor IgE de gran afinidad (FCER 1 B o Fc (psilon) RI-b Leu 181) con enfermedad respiratoria y una IgE srica superior a 2000 IU/mL. Mediante PCR con iniciadores especficos para segmentos V gamma 1-8y V-gamma 9 del gen del receptor de linfocitos T (TCRgamma), en combinacin con electroforesis en gel en condiciones desnaturalizantes (PCR-DGGE), se ha observado que un 66% de micosis fungoides en estadio de placa y un 100% de micosis fungoides en estadio de tumor o de linfomas cutneos de clulas T pleomrficos presentan reordenamientos clonales del gen TCRgamma, mientras ninguno de los pseudos-linfomas cutneos de clulas T, estudiados presentaban este reordenamiento. La PCR se ha utilizado tambin para detectar mutaciones en toda la regin de codificacin del gen p53. Las mutaciones de p53, estudiadas con PCR-SSCP se encuentran con mayor frecuencia en carcinomas epidermoides infiltrantes que en el
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carcinoma in situ (enfermedad de Bowen) o micro-infiltrante. Tambin se asocian a linfomas cutneos primarios y a la evolucin de micosis fungoides desde el estadio de placa al estadio tumoral y a la transformacin histolgica del linfoma folicular en un linfoma difuso ms agresivo. Tambin se utiliza en el estudio de gen supresor tumoral, cuyas mutaciones se describen en el epitelioma basocelular y parecen ser ms frecuentes en el epitelioma basocelular espordico (30%) que en el asociado a xeroderma pigmentosa (11%). Adems, se ha comprobado la coexistencia de mutaciones en p53 y en el gen supresor tumoral en un 50% de los epiteliomas basocelulares asociados a xeroderma pigmentoso

DIAGNSTICO DE ENFERMEDADES HEREDITARIAS

Las enfermedades hereditarias dependientes de un solo gen, con mutaciones bien definidas y que causan el desarrollo de los sntomas clnicos, son apropiadas para el diagnstico por medio de la reaccin PCR. El mtodo se basa en la ampliacin de la regin que puede estar afectada por la mutacin. En principio puede tratarse de mutaciones puntuales o prdidas (deletions) en el genoma. Para el diagnstico se disponen bsicamente de 3 alternativas: hibridacin de las amplificaciones con oligonucletidos especficos para el alelo (OEA), anlisis de restriccin de las amplificaciones y determinacin directa de la secuencia de la regin amplificada. Con el surtido de endonucleasas disponibles actualmente en el mercado, es posible encontrar para casi todas las secuencias una enzima apropiada. Para la determinacin directa de la secuencia de los productos de la reaccin PCR se ofrecen varias alternativas. Una posibilidad es la concepcin de una reaccin PCR en la cual solo en los primeros ciclos ambas cadenas son sintetizadas. A continuacin predomina la sntesis de una cadena. El incremento del producto de la reaccin PCR es lineal en lugar de exponencial). Finalmente el producto es una cadena simple de ADN, la cual puede ser utilizada directamente como matriz para la secuencia a determinar. Otra posibilidad es la determinacin directa de la secuencia del producto de cadena doble de la reaccin PCR. Esto, sin embargo, parece ser difcil sobre todo con amplificaciones cortas. Una ltima posibilidad la presenta, por supuesto, el clonado delas amplificaciones y el posterior anlisis de los clones recombinantes. Un ejemplo para el anlisis de restriccin de las amplificaciones es la deteccin de la anemia falciforme del hombre (SAIKI y col., 1985). Para ese fin se amplifica una regin con un largo de 725 pb del gen dela globulina y luego se divide la amplificacin mediante la enzima CvnI. Con ello se obtienen dos fragmentos constantes (256 y 88 pb) y un fragmento de 381 pb de largo. Este puede ser dividido en dos subfragmentos (201 y 180 pb) si proviene de un individuo sano. En cambio en individuos con anemia falciforme una mutacin puntual causa la prdida del lugar de reconocimiento para la enzima (KAZAZZIAN, 1989). La identificacin directa de la mutacin es posible despus del anlisis electrofortico de las ampliaciones tratadas enzimaticamente.
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La citrulinemia es una enfermedad hereditaria del bovino provocada por una mutacin puntual en el gen de la enzima arginina succinato sintetasa. En los animales que padecen esta enfermedad, el codn 86, que normalmente codifica para arginina, se transforma en un codn stop. La consecuencia es un producto gnico corto en el locus que impide el normal desenvolvimiento del ciclo metablico de la urea provocando un aumento de la concentracin de citrulina con alteraciones patolgicas. La mutacin modifica tambin el lugar de reconocimiento de la endonucleasa AvaII, presente en animales sanos, de forma tal que en los animales con esa deficiencia gentica el lugar con Ava II no se puede separar. Con la eleccin de un iniciador adecuado es posible amplificar un fragmento de 176 pb de largo, que produce dos fragmentos (98 bp + 78 pb) cuando los animales sanos son tratados con Ava II. En los animales enfermos falta el lugar de reconocimiento para Ava II (FRSTER, 1991). Diagnsticos de rutina para la talasemia se basan en la hibridacin especfica del ADN amplificado con oligonucletidos especficos para el alelo en combinacin con el anlisis de restriccin. Aproximadamente la mitad de los ms de 60 mutantes de la talasemia son identificables mediante el anlisis de restriccin. Las mutantes restantes son diagnosticables mediante el anlisis de restriccin. El resto de las mutantes es diagnosticable por medio de la hibridacin Dot-blot con oligonucletidos especficos para el alelo. La precisin del lavado debe ser establecida de tal manera que la diferencia entre las fuerzas de la seal de hibridacin entre homocigotas y heterocigotos sea detectable con claridad. La secuenciacin de las regiones amplificadas cobra particular importancia en la identificacin de nuevas mutantes (WONG y col., 1987).Defectos ocasionados por prdidas pequeas pueden ser diagnosticados mediante la seleccin deiniciadores apropiados para ambos lados del lugar presumible de la prdida. Un ejemplo de ello es el diagnstico de la distrofia muscular Duchenne. En una reaccin PCR se emplean 18 iniciadores, que limitan 9 regiones ms comnmente afectadas por prdidas del gen distrofin. La falta de las amplificaciones de la regin determinada indica la mutacin. En general este mtodo es limitado por el largo de la amplificacin en individuos sin prdidas, dado que la amplificacin de regiones que superan 2 kB es problemtica y poco adecuada para el diagnstico de rutina.

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DIAGNSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS La reaccin de PCR se ofrece como mtodo diagnstico para detectar infecciones, sobre todo las subclnicas porque su sensibilidad permite la deteccin de cantidades mnimas de ADN (tericamente una sola copia de la molcula matriz es suficiente). Es posible comprobar secuencias integradas en el genoma (p.e. infecciones retrovirales) como tambin la presencia de secuencias episomales y extracelulares propias de las infecciones. La reaccin de PCR facilit un progreso importante en la investigacin HIV. Se posibilit el diagnstico de secuencias provirales HIV-I de las clulas mononucleares de la sangre perifrica, obtenida de pacientes sero-positivos; a pesar que no fue posible confirmar la infeccin a travs del cultivo del virus (OU y col., 1988). De especial importancia es la aplicacin de la PCR en el diagnstico de infecciones subclnicas provocadas por agentes difcilmente cultivables in vitro. La eleccin del iniciador especfico de especie garantiza la identificacin del agente infeccioso. El polimorfismo en las regiones especficas de especie permite la identificacin de las distintos tipos (DOVC y col., 1992). De esta forma se dispone, en el estudio etiolgico de las infecciones, de un mtodo eficaz que puede aclarar tambin los interrogantes forenses.

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BIBLIOGRAFIA
Gentica Humana Fundamentos y aplicaciones en Medicina, 3era Edicin Solari

Biologa molecular del Gen, 5ta edicin Watson, J, D; Baker, T. A.; Bell, S. P.; Gann, A.; Levine, M. et Losick, R (2004).

CIENCIA HOY http://www.cienciahoy.org.ar/hoy23/reaccion.htm SCIELO Revista Argentina de Microbiologia http://www.scielo.org.ar/ Biologia de la reproduccin - www.reprobiotec.com http://lecahiermichaelien.wordpress.com/ http://biotec.foroes.net/t103-tipos-de-pcr

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