Aula 1 AVALIAO DA ATIVIDADE ENZIMTICA DE PEROXIDASE EXTRADA DE VEGETAL REPOLHO Metodologia Fonte da enzima Peroxidase: a extrao da peroxidase ser

r realizada em um nico lote de repolho. Preparo do extrato enzimtico bruto 1. Pesar aproximadamente 50 g de repolho (picados em pequenos pedaos), adicionar 100 mL de tampo fosfato 50 mM, pH 6,0, gelado. 2. Homogeneizar em liquidificador por 5 minutos. 3. Filtrar o extrato bruto em gaze com dimetro reduzido atravs de 6 dobras. 4. Recolher 20 mL do filtrado e submeter precipitao com sulfato de amnio (100%-13g) durante 30 minutos. 5. Aps a etapa de precipitao, dividir o extrato bruto igualmente em trs tubos de ensaio. 6. Centrifugar a 3500 rpm durante 30 minutos. 7. Separar o sobrenadante do precipitado em tubos de ensaio diferentes. 8. Ressuspender o sobrenadante em 15 mL de tampo fosfato pH 6,0, gelado. 9. Manter os tubos em temperatura baixa (4oC, banho de gelo) Avaliao da atividade enzimtica: A avaliao da atividade enzimtica ser determinada utilizando-se como meio de reao: - 1,5 mL de guaiacol 1% de preparo recente - 0,4 mL de H2O2 0,3% - 1,2 mL de tampo fosfato de sdio 50 mM, pH 6,0. Seguindo o esquema abaixo: Reagentes Sulfato amnio Guaiacol H2O2 BRANCO de ---------1,5 mL 0,4 mL TUBO 1 0,8 g 1,5 mL 0,4 mL 1,2 mL ---------TUBO 2 ---------------1,5 mL 0,4 mL 1,2 mL 100 L TUBO 3 ----------1,5 mL 0,4 mL 1,2 mL -----------

Tampo fosfato 1,2 mL Sobrenadante -----------

Precipitado

------------

------------

-----------

100 L

Observao: O guaiacol deve ser colocado em cada tubo imediatamente antes da leitura no espectroftometro. As reaes em cada tubo de ensaio devem ser acompanhadas durante 5 minutos em um espectrofotmetro a 470 nm. Princpio do mtodo

Calcular a atividade enzimtica da peroxidase do sobrenadante e do precipitado utilizando a equao:

Onde: U mL-1 = unidade de atividade da peroxidase por mL; A = absorbncia ao final dos 5 minutos; = absortividade molar do tetraguaiacol (26.600 L mol-1 cm-1); Ve = volume da soluo de enzima utilizada no ensaio (mL); t = tempo de reao em min e FD = fator de diluio (diluio do extrato bruto enzimtico), calcula-se dividindo o Volume da soluo depois de diluda pelo Volume da soluo antes de ser diluda. Responda estas perguntas na discusso do relatrio: 1. Cite duas finalidades em que a enzima peroxidase pode ser utilizada na rea da sade, meio ambiente ou indstria. Explique a funo desta enzima nestes processos. 2. No mtodo de extrao de peroxidases do repolho qual a funo do sulfato de amnio? empregado na precipitao das enzimas

3. Expressar os valores de atividade enzimtica do precipitado e do sobrenadante. Se voc fosse farmacutico e trabalhasse numa empresa de biotecnologia que produz kits para determinao de colesterol em sangue, qual das fraes (sobrenadante ou precipitado) voc usaria como fonte de peroxidase. Justifique sua resposta comparando o resultado da atividade enzimtica. 4. Enzimas poderiam ser utilizadas com finalidade teraputica para tratamento de doenas como o cncer? Qual? Por qu?