Diagnstico microbiolgico del grupo Rickettsias

Realizado por: Manuel Pedro Jimnez Garca Asignatura: Diagnstico microbiolgico Curso: 4 curso, 2011-12.

NDICE DEL SEMINARIO DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO DE RICKETTSIAS PARTE 1: Introduccin al grupo Rickettsia. 1. Grupos Rickettsia, Ehrlichia y Coxiella. a. Breve descripcin fisiolgica y de sus respectivos ciclos biolgicos b. Estrategias virulentas conocidas de este grupo. 2. Epidemiologa de grupo: Clasificacin de las diferentes especies segn las patologas que producen. a. Productoras de Fiebres exantemticas (7 especies de Rickettsias). b. Productoras de Tifus (3 especies de Rickettsias y 1 de Orientia) c. Productoras de Ehrlichiosis (2 grupos de especies de Ehrlichias) d. Productoras de Fiebre Q (1 especie de Coxiella). 3. Distribucin geogrfica de las diferentes patologas. PARTE 2: Diagnstico microbiolgico de las diferentes especies que producen patologas concretas. 1. Fiebres exantemticas a. Fiebre botonosa mediterrnea b. Fiebre manchada de las montaas rocosas c. Viruela Rickettsial o Rickettsiosis vesicular 2. Tifus a. Tifus murino o tifus endmico b. Tifus epidmico c. Enfermedad de Brill-Zinsser d. Tifus de las malezas 3. Ehrlichiosis 4. Fiebre Q PARTE 3: Aproximacin prctica de las tcnicas principales del diagnstico microbiolgico del grupo Rickettsias. 1. Aislamiento de Rickettsias a partir de muestras clnicas mediante cultivo. a. Cultivo con clulas VERO b. Cultivo Shell vial 2. Diagnstico de las Rickettsiosis mediante inmunofluorescencia indirecta. 3. Deteccin directa de Rickettsias en muestras clnicas mediante amplificacin genmica y secuenciacin del gen gltA.

Bibliografa

SEMINARIO DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO DE RICKETTSIAS PARTE 1: Introduccin al grupo Rickettsia. Esta parte ser introductoria y por tanto, breve, con imgenes didcticas y cuadros de clasificacin, y de distribucin geogrfica.

1. Grupos Rickettsia, Ehrlichia y Coxiella. a. Breve descripcin fisiolgica y de sus respectivos ciclos biolgicos. Los mltiples miembros del grupo Rickettsias, entre los que se encuentran Rickettsia, Ehrlichia y Coxiella, son bacterias aerobias cocobacilos gramnegativos pleomrficos inmviles pertenecientes al grupo filogentico gammaproteobacterias, adems, son parsitos intracelulares obligados o estrictos, es decir, sobreviven muy poco tiempo fuera del husped (con la excepcin de Coxiella burnetii). El hecho de que sean parsitos intracelulares estrictos quiere decir que requieren de clulas eucariotas para poder multiplicarse y desarrollarse. Tratando su fisiologa bacteriana, podemos decir que no son hospedadores energticos ya que presentan una cadena de transporte electrnico completa, cuyo donador de electrones es el NADH, sin embargo, requieren energa en forma de ATP de sus clulas hospedadoras, adems de NAD, coenzima-A, etc. Adems, en general el grupo Rickettsia (salvo Coxiella) no presenta rutas glucolticas, es decir, no oxidan la glucosa pero s oxidan otros intermediarios como el glutamato. En cuanto a su ciclo biolgico, tienen en comn un ciclo vital epidemiolgico en el que intervienen vectores artrpodos y reservorios en mamferos, salvo en el caso de la patologa tifus epidmico, donde el ser humano es un husped accidental. Centrndonos en los tipos celulares que presentan a lo largo de su ciclo biolgico intracelular, encontramos una fase celular vegetativa, caracterizada porque la clula bacteriana es de mayor tamao debido a que el espacio periplsmico se agranda; y posteriormente encontramos una fase celular pequea, donde son muy similares a endosporas y con inclusiones membranosas complejas que confieren electrodensidad cuando se las observa al microscopio electrnico de transmisin. Cabe aadir que en la fase celular vegetativa se produce una diferenciacin vegetativa, mientras que en la fase de clulas pequeas se produce una diferenciacin esporognica, confiriendo a la clula mayor grado de resistencia a las inclemencias del medio externo, en cualquier caso, el ciclo biolgico culmina con una fisin binaria de la clula bacteriana.

b. Estrategias virulentas conocidas de este grupo. En cuanto a las estrategias virulentas conocidas de este grupo, destacamos las estrategias de supervivencia intracelular, que podemos diferenciarlas segn hablemos del grupo Rickettsia o del grupo Coxiella. As pues, las bacterias del grupo Rickettsia se caracterizan porque entran a la clula hospedadora eucariota mediante fagocitosis inducida, adems, presentan unas fosfoliasas que impiden que el lisosoma se una al fagosoma formando el fagolisosoma, impidiendo que se acidifique la vescula de la clula hospedadora eucariota permitiendo la viabilidad de la bacteria patgena, as como el desarrollo y multiplicacin de la misma. En cuanto al grupo Coxiella se produce la entrada a la clula hospedadora eucariota por fagocitosis inducida tambin, sin embargo, no posee mecanismos para evitar la fusin del fagosoma con el lisosoma, as pues, esta bacteria permite soportar condiciones de pH cidas, incluso pudiendo multiplicarse en el fagolisosoma. Cabe aadir, que Coxiella posee mecanismos para evitar la accin de las hidrolasas lisosomales.

2. Epidemiologa de grupo: Clasificacin de las diferentes especies segn las patologas que producen. En base a diversas caractersticas, las diferentes especies de Rickettsias han sido tradicionalmente agrupadas en dos grupos: las causantes de fiebres exantemticas y las productoras de tifus. A continuacin, se tratarn de manera 2

somera los principales cuadros sintomatolgicos, as como el diagnstico de las patologas nombradas, y de la ehrlichiosis, y de la fiebre Q.

A modo de resumen inicial, se presenta esta tabla con las caractersticas clnicas y epidemiolgicas de las rickettsiosis, que las iremos detallando poco a poco:

a. Productoras de Fiebres exantemticas (7 especies de Rickettsias). Rikettsia conorii, R. rickettsii, R. akari, R. africae, R. australis, R. sibirica, y R. japonica. b. Productoras de Tifus (3 especies de Rickettsias y 1 de Orientia). Rickettsia typhi, R. fetis, R. prowazekii, Orientia tsutsugamushi. c. Productoras de Ehrlichiosis (2 grupos de especies de Ehrlichias). Ehrlichia chaffeensis y el grupo de la E. phagocytophila. d. Productoras de Fiebre Q (1 especie de Coxiella). Coxiella burnetii.

3. Distribucin geogrfica de las diferentes patologas. Las fiebres exantemticas, dependiendo del agente etiolgico, afectan a las zonas del Mediterrneo, Amrica del Norte, frica subsahariana, Australia, y el sudeste asitico fundamentalmente.

Las patologas cuyo cuadro sintomatolgico se ajustan a tifus de etiologa de Rickettsia se distribuyen por las zonas del pacfico sur, Asia oriental-sur, pudiendo afectar a nivel mundial debido a los inmigrantes y residentes viajeros. Por ltimo, las ehrlichiosis se distribuyen fundamentalmente a nivel de Amrica del Norte (Estados Unidos), y la fiebre Q, a nivel mundial.

PARTE 2: Diagnstico microbiolgico de las diferentes especies que producen patologas concretas. Se har una descripcin breve de la enfermedad y las tcnicas de diagnstico microbiolgico accesibles en microbiologa clnica aplicada a cada enfermedad.

4. Fiebres exantemticas a. Fiebre botonosa mediterrnea Est producida por Rickettsia conorii, transmitida por la garrapata Rhicicephalus sanguineus. Ha sido descrita en el sur de Europa, frica y centro y sur de Asia. La mayor incidencia de la infeccin tiene lugar en los meses estivales. Desde el punto de vista patognico se produce un dao endotelial con aumento de permeabilidad vascular, edema perivascular y necrosis secundaria. En cuanto a las manifestaciones clnicas ms notorias, tras un perodo de incubacin de una semana, el paciente comienza con fiebre alta, cefalea, exantema y artromialgias. Una caracterstica tpica de esta enfermedad es la presencia de una escara necrtica en la zona de inoculacin, denominada tache noire o mancha negra. Para el diagnstico de la fiebre botonosa mediterrnea se realizan: Pruebas serolgicas de diverso tipo, sin embargo el resultado siempre se positiviza en la fase de convalecencia, por lo tanto hay que extremar precauciones con la metodologa y acompaarla con pruebas adicionales. Adems, se realiza la clsica reaccin de Weil-Flix, que se trata de una prueba de aglutinacin altamente insensible e inespecfica, ya que su fundamento se basa en la reaccin cruzada con antgenos de Rickettsias y de ciertos serotipos de bacterias del gnero Proteus. El diagnstico precoz, por tanto, no va tanto al rea microbiolgica, sino al diagnstico clnico y epidemiolgico, a partir de la mancha negra, generalmente. Aunque tambin se pueden utilizar procedimientos ms sofisticados como: o Cultivos celulares que se inoculan con una muestra del paciente posible portador. o Mtodos inmunohistolgicos o de biologa molecular de biopsias de piel. o Deteccin del agente patgeno en clulas endoteliales por inmunofluorescencia.

b. Fiebre manchada de las montaas rocosas La fiebre manchada de las montaas rocosas es una grave infeccin causada por Rickettsia rickettsii, que se presenta fundamentalmente en el continente americano. Sus principales vectores artrpodos son las garrapatas Dermacentor variabilis, D. andersoni, Rhipicephalus sanguineus y Amblyoma cajennense, dependiendo del rea geogrfica. La mayor incidencia de la patologa se observa en primavera y verano, coincidiendo con la mayor actividad de las garrapatas. El microorganismo se inocula a travs de la piel, pasando a los vasos linfticos y capilares sanguneos, afectando a las clulas endoteliales, produciendo un aumento de la permeabilidad vascular con edema secundario, hipovolemia, hipoalbuminemia e isquemia (falta de oxgeno) local con necrosis. En cuanto a las manifestaciones clnicas, tras un perodo de incubacin medio de una semana, se inicia el cuadro sintomatolgico con malestar general, fiebre, cefalea, mialgias, acompandose de nuseas, vmitos y diarrea. Lo ms caracterstico son las lesiones cutneas, y aparecen algo ms tardamente. Adems, en fases muy tardas se afecta al sistema nervioso central (SNC). Para el diagnstico de esta patologa: Inicialmente se basa en la epidemiologa y la clnica. Sin embargo, existen diversas pruebas serolgicas que reportan falsos negativos en fases iniciales de la enfermedad, pero que confirman el diagnstico en la enfermedad tarda. En la fase aguda de la enfermedad, nicamente es til la biopsia cutnea y su examen inmunohistoqumico. Como procedimientos diagnsticos fiables, pero considerados alternativos debido a que no estn disponibles en todos los laboratorios son: la amplificacin de DNA por PCR, y el cultivo celular. c. Viruela Rickettsial o Rickettsiosis vesicular Enfermedad causada por Rickettsia akari, especie transmitida por el caro Liponyssoides sanguineus, y cuyo reservorio son los ratones. Es una enfermedad poco frecuente, descrita en zonas urbanas de Estados Unidos, Rusia, Corea y frica. Tras ser inoculadas por la picadura del caro, las bacterias proliferan localmente y producen una ppula indolora que progresa a lcera y escara. A nivel histolgico hay una infiltracin epidrmica de clulas polimrficas nucleares y hay una afectacin vascular con extravasacin y formacin de trombos. A nivel clnico, tras un perodo de incubacin de 1-2 semanas se inicia un cuadro brusco caracterizado por fiebre, escalofros, mialgias, cefalea, fotofobia, sudoracin intensa e incluso trastornos gastrointestinales. Poco despus aparece un exantema papular generalizado que evoluciona a vesculas y costras similares a las que aparecen en la viruela viral. La enfermedad no es severa, resolvindose en 2-3 semanas an sin tratamiento. Como curiosidad, si se quieren observar los efectos de esta patologa, en la serie de televisin House, en la sptima temporada, en el captulo 7, se trata esta patologa concreta y est muy bien documentada. En cuanto al diagnstico: Se realiza fundamentalmente por inmunofluorescencia indirecta. Aunque tambin se puede aplicar la inmunofluorescencia directa, pero es de elevado coste en comparacin con la anterior. 5

El diagnstico diferencial se plantea con otras rickettsiosis, infecciones por varicela-zoster y enterovirus.

5. Tifus a. Tifus murino o tifus endmico El agente etiolgico de esta patologa es la Rickettsia typhi, que produce esta zoonosis mundial. Su reservorio natural son las ratas, y el vector artrpodo es la pulga de la rata Xenopsylla cheopis. Existe una variedad de este cuadro causado por R. felis y transmitido desde los gatos por pulgas del gnero Ctenocefalides felis. En cualquier caso, el tifus murino se presenta en pacientes de cualquier edad, sobre todo en los meses de verano y otoo, y en zonas con mal control a nivel del reservorio y los vectores artrpodos, ya que la pulga adquiere la infeccin a raz de picar a las ratas infectadas, propiciando que las bacterias se acumulen en las clulas de la mucosa intestinal de la pulga, y se eliminan con las deposiciones. El mecanismo de inoculacin en humanos es por rascado de la zona de la picadura de la pulga, alrededor de la cual se depositan las heces contaminadas de la misma. En cuanto al cuadro clnico de la enfermedad, tras un perodo de incubacin de 1-2 semanas se inicia un cuadro de fiebre, escalofros, malestar general, nuseas, vmitos, mialgias, etc, y se produce una afectacin endotelial con vasculitis en mltiples rganos. Dicha lesin produce prdida de contenido vascular por aumento de la permeabilidad hipovolemia, hipoalbuminemia y prdida de electrolitos. Aunque generalmente el tifus murino es una enfermedad benigna, puede, por tanto, presentar complicaciones graves. Las complicaciones graves alcanzan la insuficiencia respiratoria, afectacin renal, miocarditis, sntomas neurolgicos, afectacin heptica, y por tanto, fracaso multiorgnico. El diagnstico de la patologa, se basa en: La sospecha clnica inicial a partir de la cual se debe comenzar un tratamiento de choque. Posteriormente ha de realizarse una confirmacin serolgica mediante aglutinacin con ltex o inmunofluorescencia indirecta. Adems, se puede demostrar inmunohistoqumicamente a partir de muestras de biopsias, o del cultivo celular de Rickettsias en clulas hospedadoras adecuadas, o a travs de la deteccin de DNA por PCR de sangre perifrica. La reaccin de Weil-Flix, como en todos los casos de rickettsiosis ha de evitar realizarse, a no ser que no se disponga de otra tcnica diagnstica, debido a que es muy poco sensible y no es especfica. Como diagnstico diferencial, se puede confundir con las siguientes patologas: sarampin, fiebre tifoidea, meningitis bacteriana o vrica, sfilis secundaria y sndrme de shock txico. b. Tifus epidmico o exantemtico El tifus epidmico o exantemtico est causado por Rickettsia prowazekii. El vector es el piojo humano Pediculus humanus corporis, que vive en la ropa, se transmite de persona a persona, y aumenta su presencia en pocas fras del ao, en situaciones de poca higiene, hacinamiento y catstrofes naturales y/o guerras. Adems, presuntamente se ha descubierto en EEUU una variedad transmitida por pulgas y piojos de las ardillas voladoras. Al picar al husped infectado, el piojo adquiere el microorganismo que pasa al tubo digestivo del artrpodo. A partir de aqu se elimina por las heces y se inocula en un nuevo husped mediante el rascado tras una nueva picadura. Tras la inoculacin se disemina por va sangunea y 6

afecta a las clulas endoteliales de venas, arteriolas y capilares, lo que provoca trombosis de la luz por depsito de fibrina y plaquetas, pudiendo producir necrosis distal de los miembros por isquemia continuada. En cuanto a las manifestaciones clnicas, stas se producen tras un perodo de incubacin de una semana, y los sntomas son fiebre alta, cefalea intensa, mialgias, y la aparicin de un exantema maculoso en la parte superior del tronco y las axilas. Adems, puede haber una afeccin sistmica que consiste en alteraciones oculares, tos seca, infiltrados pulmonares e incluso fracaso renal. El diagnstico se basa: Inicialmente en la epidemiologa y la clnica. Posteriormente se busca una confirmacin serolgica mediante inmunofluorescencia indirecta. Al igual que en el tifus murino la prueba de Weil-Flix tiene importantes limitaciones. Adems, la realizacin de amplificacin de DNA por PCR, y la realizacin de cultivos celulares son eficaces pero no estn disponibles en todos los laboratorios. c. Enfermedad de Brill-Zinsser Se trata de una forma recidivante de tifus epidmico. La distribucin geogrfica es universal debido a los flujos migratorios de personas previamente infectadas. Las manifestaciones clnicas son similares, pero menos intensas, asemejndose ms al tifus murino. Incluso se han asociado a situaciones de estrs o debilitamiento inmunolgico en personas de edad avanzada que haban padecido el primer episodio incluso muchos aos atrs. El diagnstico se basa: En un diagnstico clnico y epidemiolgico. Se apoya con anlisis serolgicos. Es conveniente determinar el tipo de anticuerpos especficos, ya que en esta entidad se desarrollan anticuerpos IgG mientras que en el tifus epidrmico o murino se desarrollan IgM. d. Tifus de las malezas Se trata de una zoonosis extendida en Asia, Australia y el rea sur y occidental del ocano Pacfico. Est causada por Orientia tsutsugamushi (anteriormente denominada Rickettsia tsutsugamushi). Se transmite por picadura de las larvas de ciertos caros infectados como Leptotrombidium deliense. Son ms frecuentes en zonas de maleza y en pocas hmedas. Las manifestraciones clnicas propias de la enfermedad se dan tras la inoculacin de O. tsutsugamushi, que se multiplica en la zona de la picadura, produciendo una ppula que se ulcera, y da lugar a una escara con costra negruzca. En los siguientes das se da un cuadro de fiebre, esplenomegalia, linfadenopata, cefalea y mialgias. Incluso en casos graves se aade neumona intersticial y alteracin del SNC. En cuanto al diagnstico de la patologa: Se recurre, sta vez con xito, a la prueba Weil-Flix, que se utiliza conjuntamente con la inmunofluorescencia indirecta, y ambas tcnicas tienen la misma sensibilidad y especificidad. Se hace un diagnstico diferencial con otros tipos de tifus, mononucleosis infecciosa, toxoplasmosis, dengue, etc.

6. Ehrlichiosis Esta patologa se produce por dos microorganismos, que dependiendo de cual sea produce una patologa u otra, as pues, si la estirpe celular que infecta es Ehrlichia chaffeensis produce la ehrlichiosis monoctica humana; mientras que si el microorganismo que infecta es Ehrlichia phagocytophila la patologa que se produce es la ehrlichiosis granuloctica humana. Estos agentes son transmitidos por picaduras de garrapatas, aunque tambin se ha descrito la afectacin profesional en carniceros que trabajan con carne infectada, o que tienen trato con perros con ehrlichiosis canina. Existen personas que no desarrollan sntomas de la enfermedad. Y se suele desarrollar ms en primavera-verano. En cuanto a las manifestaciones clnicas, una vez se ha inoculado el microorganismo, se disemina por la va cutnea, sangunea y linftica, para invadir las clulas correspondientes de los sistemas hematopoyticos y linforreticular. El cuadro sintomatolgico de ambas patologas es muy similar, y suele ser notorio en pacientes inmunodeprimidos, donde puede ser fatal, pasando por etapas de fiebre, cefalea, mialgias, nuseas y posibles fallos a nivel renal. El diagnstico se lleva a cabo: Mediante una epidemiologa previa y clnica. Es de elevada importancia realizar un examen microscpico para comprobar que se observan mrulas de Ehrlichia, que se detectan en el diagnstico temprano y con tincin directa. Los cultivos Ehrlichia son insensibles, complejos y no se hacen rutinariamente, as como la tcnica de amplificacin de DNA por PCR. El mtodo diagnstico ms fiable es la inmunofluorescencia indirecta. 7. Fiebre Q (aguda y crnica) Es una zoonosis de presentacin universal. Tratando nuestro pas, es comn en Espaa en la poca estival de primavera-verano. Est causada por Coxiella burnetii, un microorganismo que difiere de los anteriores en que resiste mejor las inclemencias del medio ambiente, permitiendo que sea viable durante meses expuesto a la desecacin, a temperaturas extremas o contaminando alimentos. Como peculiaridad sufre cambios en su estructura antignica en un proceso denominado variacin o cambio de fase, donde en animales y humanos se manifiesta como fase I o virulenta, que supone la fase contagiosa, y en cultivos celulares in vitro se pasa a la forma II o avirulenta. Este microorganismo se aisla de mltiples reservorios animales, desde artrpodos a mamferos, aunque la fuente ms importante de infeccin en el hombre es el ganado bovino, ovino y caprino. En el animal infectado los microorganismos se acumulan en el tero y glndulas mamarias, transmitindose al hombre por inhalacin de aerosoles en el momento del parto, por contacto directo o exposicin a materiales contaminados (incluyendo heces, orina, paja, ropa, placentas o productos de despiece), o por ingestin de leche. En cualquier caso el ciclo de infestacin se inicia con la picadura de la garrapata u otros artrpodos infectados a los mamferos, transmitindoles la infeccin por la misma picadura o a travs de heces contaminadas. El microorganismo se multiplica y se acumula en tero y placenta, liberndose en el parto gran cantidad en aerosoles que pueden persistir durante mucho tiempo, y tras ser inhalados por el hombre, las coxiellas proliferan en los pulmones y se diseminan por va hematgena. En cuanto a las manifestaciones clnicas, existen dos grandes sndromes causados por C. burnetii, que son la fiebre Q aguda y la fiebre Q crnica, que recientemente se ha demostrado que son factores atribuibles al husped y 8

no a la cepa infectante, los que determinan la posible cronificacin, como pueden ser la inmunodepresin, lesiones vasculares, etc. La fiebre Q aguda comienza con un cuadro febril autolimitado, de 1-2 semanas de duracin, acompaado de una hepatitis, e incluso una neumona. Por otro lado la fiebre Q crnica se puede presentar de mltiples formas, sin embargo la ms tpica es la endocarditis unido a hepatoesplenomegalia, anemia y neumona. El diagnstico de la fiebre Q aguda reside en la serologa, que se puede efectuar por diferentes tcnicas, siendo la inmunofluorescencia indirecta la ms sensible y especfica. Tiene inters la determinacin de anticuerpos IgM, y no es necesario esperar a ver si ha habido seroconversin. El cultivo del microorganismo en cultivos celulares se suele descartar debido a que se transmite por aerosoles, requerira una bioseguridad elevada (tipo III), que no es factible con la mayora de laboratorios. La tcnica basada en amplificacin de DNA por PCR tambin suele descartarse debido a que no se dispone en todos los laboratorios.

En contraposicin, el diagnstico de la fiebre Q crnica, las determinaciones serolgicas muestran que existe elevado ttulo de IgG contra el antgeno de fase I (virulento), que contra el de fase II (avirulento). Adems se requiere determinar IgA contra antgeno de fase I para el seguimiento de la fase crnica.

Cabe aadir, que el tratamiento de todas estas patologas ha de iniciarse lo antes posible para evitar las posibles complicaciones de cada patologa que se puedan producir. Generalmente el antibitico doxiciclina es muy efectivo, aunque tambin se pueden utilizar tetraciclinas, ciprofloxacino y/o cloranfenicol. Se suele acompaar de antipirticos y antiinflamatorios especficos.

PARTE 3: Aproximacin prctica de las tcnicas principales del diagnstico microbiolgico del grupo Rickettsias. Se har una descripcin ms metodolgica de las tcnicas utilizadas, que son precisamente las que ms se utilizan actualmente en microbiologa clnica. Antes de adentrarnos en el procedimiento experimental de las tcnicas ms comnmente llevadas a la prctica, nos detendremos en el tipo de muestra para cada tipo de prueba diagnstica (se refleja en una tabla adjunta ms abajo), y se detallarn los puntos ms relevantes de cada tipo de prueba diagnstica.

As pues, podemos hablar de los siguientes grupos de pruebas diagnsticas, antes de pasar a protocolos de tcnicas concretas: Tincin de Gimnez para observacin microscpica: las muestras de tejidos pueden examinarse microscpicamente mediante esta tincin, que permite visualizar las rickettsias, pero no diferencia en cuanto a la especie ni tampoco otros microorganismos, por lo que su deteccin suele ser dudosa.

Serologa: la inmunofluorescencia indirecta (IFI) es una de las tcnicas ms sensibles y la ms ampliamente utilizada en la actualidad para el diagnstico de las rickettsiosis exantemticas. Los antgenos estn comercializados, estandarizados y prefijados en los portaobjetos sobre los que se aaden las diluciones seriadas del suero del paciente. La confirmacin del diagnstico requiere detectar una seroconversin, que se ha nombrado con anterioridad, que se produce en la fase de convalecencia entre la 3-4 semana. Para una correcta interpretacin de los resultados de serologa, se deben tener en cuenta los datos de reactividad basal de la poblacin en zonas endmicas. Como tcnicas experimentales para evitar la reactividad

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cruzada, en algunos casos, se utilizan ensayos de inmunobloting con sueros sometidos a absorciones con antgenos heterlogos, aumentando la especificidad, pero resultando en una baja sensibilidad. Cultivo celular: para el cultivo de rickettsias, se requiere, en trminos generales, un medio mnimo esencial sin antibiticos, suplementado con suero bovino fetal, glutamina, aminocidos no esenciales, y una incubacin a 33-35C en ausencia de CO2. Para el diagnstico definitivo de las rickettsiosis se requiere el aislamiento e identificacin de la especie a partir del cultivo en clulas VERO o fibroblastos (por Shell vial). Para la deteccin especfica y todo el proceso de incubacin hay que extremar las precauciones, de ah que se requiera un laboratorio de bioseguridad 3. Deteccin molecular: las tcnicas moleculares, como la PCR, permiten un diagnstico rpido y especfico al detectar DNA de rickettsia en tejidos infectados, cultivos celulares y garrapatas u otros artrpodos vectores. Por el momento la mayor parte de tcnicas descritas son de desarrollo propio (in house), y no estn comercializadas, y los genes ms comnmente analizados son los que codifican dos protenas de membrana externa: rOmpA (presente en todas las especies de rickettsias excepto en R. helvtica, R. australis, R. bellii, R. canadensis), y rOmpB (presente en todas las especies excepto R. helvtica, R. bellii y R. massiliae). Adems, tambin se utiliza el gen gltA (del cual hablaremos), que codifica la citrato sintetasa, y es vlido para la identificacin de todas las especies de rickettsias, y el gen 17-kDa (vlido para las rickettsias del grupo de fiebres manchadas). Por otro lado, se ha desarrollado recientemente una tcnica denominada PCR-RLB (reverse line blotting), la cual utiliza como diana el espacio intergnico 23S-5S-ARNr16, que permite la identificacin de la especie implicada sin necesidad de secuenciacin, siendo un mtodo altamente sensible, y especfico y se realiza en poco tiempo, en torno a 1-2 horas. Adems, se pueden utilizar tcnicas como la PCR cuantitativa a tiempo real, que permite obtener resultados en menos de 1 hora.

Ahora trataremos protocolos especficos llevados a la prctica en los laboratorios de microbiologa clnica de los principales hospitales de Espaa y del mundo:

1. Aislamiento de Rickettsias a partir de muestras clnicas mediante cultivo. a. Cultivo con clulas VERO o cultivos Shell vial de fibroblastos Inicialmente se ha de tener en cuenta que el objetivo de esta tcnica es obtener cultivos celulares inoculados con muestras de pacientes en los que se sospecha una rickettsiosis. Se requiere un laboratorio de bioseguridad 3. Este proceso es laborioso, ya que aparte del componente metodolgico, el efecto citoptico no se observa siempre, y cuando se produce no es especfico de la especie de Rickettsia. En cualquier caso, tras unos das de cultivo, se puede detectar la presencia de rickettsias mediante una tincin directa Gimenez, o mediante una inmunofluorescencia indirecta con anticuerpos especficos, o por tcnicas moleculares como PCR. Se ha de tener en cuenta que para la identificacin de la especie de rickettsia aislada, se precisa de secuenciacin de una diana especfica de la especie a nivel de DNA. 11

Protocolo: 1) Recogida de muestras. La muestra ms adecuada para el cultivo de rickettsias es la sangre recogida con citrato o heparina. Las muestras se recogen en contenedores estriles de un solo uso con cierre hermtico y han de analizarse el mismo da. 2) Si el envo no se realiza de manera inmediata, conviene congelar a -80C hasta su envo. 3) Hay que tener en cuenta, que cuando se analiza una muestra de posible rickettsiosis, dichas muestras mostrarn una bacteriemia de menor intensidad que en el caso de otras infecciones bacterianas, lo que obliga a recoger mayor cantidad de muestra para obtener un rendimiento ptimo. 4) Las muestras deben manejarse como potencialmente peligrosas, y antes de procesarse se han de someter a una inspeccin previa para asegurarnos de que no existe ningn criterio de rechazo de la misma. 5) Para realizar el cultivo celular, se requiere de clulas VERO o SHELL VIAL en cultivo con crecimiento en monocapa confluente, en torno a 50.000 clulas viables (comprobadas con azul tripn) por mililitro. 6) Se inoculan 0.2 ml de la muestra del paciente por cada vial de 50.000 clulas viables/ml. Hay que incubar durante 4-6 das en estufa a 33-35C sin CO2 ambiental. Hay que comprobar diariamente si hay contaminacin del cultivo mediante la visualizacin con el microscopio invertido. 7) Posteriormente hay que realizar un subcultivo o pase de los cultivos con nuevo medio de cultivo. Se dejan incubando otros 5-7 das. 8) Posteriormente se raspa el cultivo para comprobar si hay crecimiento de rickettsias, mediante la tincin Gimenez, IFI con suero especfico o tcnicas como PCR. 9) Hay que tener en cuenta, que an teniendo un resultado negativo, no se puede descartar la presencia de rickettsias en el cultivo hasta pasados 20 das de incubacin. Limitaciones del procedimiento: Debido a la baja sensibilidad de la tcnica, no se recomienda realizar este procedimiento en el caso de muestras procedentes de pacientes que hayan comenzado un tratamiento antibitico. En el caso de desconocer la especie concreta, se deber remitir a un centro de referencia para identificarla. Una limitacin de la tcnica es el aumento de la toxicidad de la muestra sobre la monocapa celular durante el proceso.

2. Diagnstico de las Rickettsiosis mediante inmunofluorescencia indirecta. Se describir el diagnstico serolgico de las rickettsiosis mediante la utilizacin de la tcnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI), procedimiento aplicable a todos los laboratorios clnicos que reciben muestras de sueros procedentes de pacientes con sospecha de infeccin por Rickettsia spp. Los mtodos serolgicos, como hemos comentado, se basan en la deteccin de anticuerpos especficos frente a Rickettsia spp., generalmente de tipo IgG e IgM. Al igual que otras serologas, este mtodo se puede utilizar para el diagnstico de la infeccin, para el seguimiento de la respuesta inmune especfica y para conocer la prevalencia de anticuerpos frente a este microorganismo. En el caso de que existan anticuerpos frente al correspondiente antgeno, se formar un complejo antgenoanticuerpo que ser revelado mediante una anti-inmunoglobulina humana de origen animal, marcada con isotiocianato de fluorescena (FITC) generalmente, y visualizado con un microscopio de fluorescencia. 12

Protocolo: 1) Recogida de muestras. Las muestras a analizar mediante IFI de rickettsias es el suero, que se recoge y se enva a contenedores estriles de un solo uso y con cierre hermtico. 2) El suero debe enviarse refrigerado lo antes posible. Si el envo no se va a realizar de inmediato, conviene congelarlo a -20C hasta su envo. 3) Procesado de las muestras. Se ha de someter a las muestras a una inspeccin previa para asegurarse de que ha sido bien seleccionada, recogida y transportada. No se aceptar suero hemoltico ni hiperlipmico. 4) Ya que resulta importante realizar estudios cuantitativos de sueros del mismo paciente a lo largo del tiempo, es fundamental conservar una alcuota congelada a -20C de cada muestra que se analice para poder realizar en paralelo el estudio comparativo con las diferentes muestras. 5) Adentrndonos en el procedimiento de inmunofluorescencia indirecta, se parte de placas de microtitulacin, donde se realizan diluciones seriadas 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, hasta 1/5120, con tampn PBS. 6) Tras realizar las diluciones con el antgeno, y la realizacin de un control negativo y positivo, se incuban a 37C durante 30 minutos en cmara hmeda. 7) Tras los lavados pertinentes, se aade la solucin del conjugado (anti IgG, anti IgM y anti inmunoglobulinas totales), a la dilucin recomendada de cada pocillo, la dilucin del conjugado se prepara con Azul de Evans. Se incuba durante 30 minutos a 37 C. 8) Se repiten los lavados y se deja secar y se procede al montaje. 9) Lectura e interpretacin de resultados. Se realiza en el microscopio de fluorescencia. En el caso de un resultado positivo, se observa una fluorescencia puntiforme caracterstica que evidencia la presencia de las rickettsias y contrasta con el rojo del citoplasma celular producido por el azul de Evans. Los sueros negativos dan lugar a una coloracin roja uniforme sin punteado. Hay que tener en cuenta que a veces no se utiliza azul de Evans.
Para ilustrar los posibles resultados obtenidos utilizo estas imgenes de un ensayo de inmunofluorescencia indirecta, que se ha realizado a partir de muestras de suero de pacientes con signos clnicos de rickettsiosis, y con antgenos de especies de Rickettsias conocidas. Se observarn diferentes intensidades de reaccin de IFI (y no se usa azul de Evans). Las columnas muestran los antgenos ya conocidos de cada especie (columna 1: R. conorii, columna 2: R. felis, columna 3: R. typhi). Las filas muestran el suero con infeccin y anticuerpos especficos (fila A: R. conorii, fila B: R. felis, fila C: R. typhi). Se observa que el suero con infeccin por R. conorii reacciona con los antgenos de R. conorii y R. felis pero no con el de R. typhi. Por el contrario, el suero con infeccin por R. typhi reacciona con los antgenos de R. typhi y R. felis, pero no con R. conorii. Por ltimo, el suero con la infeccin por R. felis reacciona con R. conorii y R. typhi.

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10) Hay que tener en cuenta que el control positivo debe presentar una fluorescencia intensa y brillante, y que el control negativo debe presentar ausencia de fluorescencia. Una fluorescencia amarillenta o verde oscura corresponde con una actividad inespecfica y no debe tenerse en cuenta. Adems, durante la observacin al microscopio de fluorescencia se recomienda no concentrarse mucho tiempo en la misma rea, siendo preferible desplazarse por toda la preparacin con el fin de evitar prdidas de fluorescencia. 11) La evaluacin de un resultado positivo ha de detallar que se trata de una fluorescencia especfica de color verde manzana con una intensidad de 1+ (dbil), 2+ (moderada), 3+ (brillante), 4+ (muy brillante).

12) Se considera que ha tenido lugar una seroconversin cuando al analizar dos muestras de suero obtenidas de un paciente con 20 das de diferencia, se observa un aumento de cuatro veces el ttulo de anticuerpos inicial.

Limitaciones del procedimiento: Hay que tener en cuenta que para minimizar la variabilidad deben analizarse simultneamente todos los sueros del paciente. Adems, hay que tener en cuenta que slo existen portaobjetos comerciales para R. coronii, R. rickettsii y R. thypi. Para el estudio serolgico de otras especies se deben producir los antgenos y preparar los portaobjetos en el propio laboratorio. Requiere personal especializado y laboratorio de bioseguridad 3. La IFI para la deteccin de anticuerpo frente a rickettsias est considerada la mejor prueba diagnstica serolgica. Otra limitacin comn a otros ensayos serolgicos es la necesidad del estudio de sueros pareados, para poder demostrar una seroconversin. Adems, en algunos casos no se produce la seroconversin, por lo que no se puede excluir la enfermedad.

3. Deteccin directa de Rickettsias en muestras clnicas mediante amplificacin genmica y secuenciacin del gen gltA. El objetivo de este procedimiento, es la deteccin de las especies de Rickettsia en muestras clnicas mediante PCR (reaccin en cadena de la polimerasa) convencional, y una secuenciacin posterior del producto amplificado. Este procedimiento es aplicable a todas las muestras clnicas con sospecha de rickettsiosis que se reciben en los laboratorios de microbiologa clnica que realicen diagnstico molecular. Adems, tambin se puede aplicar al DNA

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extrado a partir de cultivos celulares infectados con Rickettsia spp. a partir de muestras clnicas, como hemos explicado en el punto anterior. As pues, esta tcnica molecular permite detectar en poco tiempo el genoma de cualquier patgeno potencial del grupo Rickettsia independientemente de la viabilidad del microorganismo. Estas tcnicas presentan como ventaja que son ms sensibles debido a que el tratamiento previo con antibiticos disminuye la sensibilidad, pero en menor grado que en las anteriores tcnicas. La diana gnica especfica que trataremos ser el gen gltA, que codifica para la enzima citrato sintetasa que est presente en todas las especies de Rickettsia.

Protocolo: 1) Recogida de muestras. Las muestrs ms adecuadas para el diagnstico molecular de rickettsias son sangre extrada con citrato o EDTA, muestra cutnea de la escara de inoculacin, contenido de ppulas o mculas, y en el caso de afectacin neurolgica, muestra de lquido cefalorraqudeo (LCR). Se han de depositar y enviar en contenedores estriles de un solo uso y con cierre hermtico. 2) Procesamiento de las muestras. Como hemos comentado, la bacteriemia en una rickettsiosis es menor que en el caso de otras infecciones bacterianas, lo que obliga a recoger mayor cantidad de muestra para obtener un rendimiento ptimo. Las muestras han de manejarse como si tuvieran microorganismos potencialmente peligrosos, y antes de su procesado se ha de seguir el protocolo de inspeccin previa por si se descarta la muestra. 3) En el procedimiento de la PCR, se utilizarn reactivos para la extraccin de DNA comerciales, especficos para muestras sanguneas, o muestras de suero, o muestras de LCR. Si se parte de biopsias cutneas, se utilizarn reactivos de extraccin de DNA especficos de tejidos. 4) Para la amplificacin del DNA del gen gltA, se utilizar la mezcla de reaccin de PCR estndar, con la peculiaridad de que los dos cebadores u oligonucletidos, tendrn el siguiente cdigo y secuencia: Rp877p: 5-GGGGACCTGCTCACGGCGG-3 Rp128n: 5-ATTGCAAAAAGTACAGTGAACA -3 5) Tras la realizacin de la PCR, se proceder a realizar la electroforesis en gel de agarosa, y posteriormente se proceder a purificar la banda que se corresponde con el producto amplificado por PCR con kits especficos dependiendo de la muestra de partida (sangre, tejido o LCR). El producto purificado tericamente ser la secuencia gnica del gen gtlA que se proceder a secuenciar para confirmar la especie de rickettsia. 6) Hay que tener en cuenta que todos estos procedimientos se han de llevar a cabo en cabinas de bioseguridad tipo 3 o incluso de clase IIA. Y que se han de realizar: un control negativo de extraccin, que supondr una muestra de agua, un control positivo que supondr DNA de rickettsia a una dilucin lmite de deteccin para comprobar la eficacia de la amplificacin de PCR. Adems, se requiere de un control interno, segn el cual se amplificar otro gen como el de la betaglobina, con este control aseguramos que el proceso de PCR ha operado correctamente, y el hecho de que no haya amplificacin de un fragmento se deba a que no estaba presente dicha secuencia en el DNA de partida. 7) Como resultados, obtendremos en un gel de electroforesis: el control negativo sin ninguna banda de electroforesis, en el control positivo debe aparecer una banda de 380 pb, y en las muestras si aparece una banda de 380 pb ser positiva la presencia de rickettiosis (en la imagen las muestras van de la 1 a la 6 y todas son positivas para rickettsiosis). Adems, debe aparecer una banda correspondiente al amplificado de control interno. 15

8) En el proceso de secuenciacin, se utiliza el procedimiento de secuenciacin unidireccional mediante un secuenciador automtico, y el resultado se compara con un software especfico que realice alineamientos de secuencia de DNA utilizando secuencias de referencia, o bien mediante comparacin on line con secuencias de bases de datos, como por ejemplo, de Blastn. 9) Por ltimo, los resultados obtenidos con esta tcnica se expresan en trminos cualitativos de positivo o negativo para rickettsiosis, y los datos de secuenciacin permiten identificar la especie bacteriana. Adems, cuando se notifica un resultado de PCR negativo se debe tener en cuenta que, en ocasiones, la carga bacteriana en algunas muestras suele ser muy baja y por lo tanto, los mtodos moleculares pueden no ser lo suficientemente sensibles, por lo que un resultado negativo no descarta una infeccin.

Limitaciones del procedimiento: Esta tcnica molecular es una prueba ideal para el diagnstico de las rickettiosis ya que la amplificacin del gen gtlA presenta elevada conservacin de las secuencias de DNA en las regiones donde se han diseado los oligonucletidos, confiriendo a esta PCR el ttulo de PCR genrica, sin embargo existen una serie de desventajas en comparacin con el cultivo celular, como son la limitacin para realizar pruebas de sensibilidad con antibiticos. Otra desventaja supone la imposibilidad de coleccionar los aislados para futuras investigaciones. Adems, dependiendo del hospital o del laboratorio de diagnstico, se han de definir y protocolizar los controles internos de inhibicin, sensibilidad, especificidad y reproducibilidad de la tcnica molecular. En este caso, el control interno de amplificacin de DNA ha sido del gen de la betaglobina, que produce un fragmento de 150 pb.

Bibliografa: PRESCOTT, LM, JP HARLEY, DA KLEIN Microbiologa (5 edicin). McGraw-Hill Interamericana. 2004. Documentos tcnicos de protocolos para el Servicio de Microbiologa de los hospitales espaoles. Cdigos PNTEMG-07, PNT-EMG-08 y PNT-EMG-09. Infecciones por Rickettsias. J Cazallas Tarazagaa, J Collazos Gonzleza. Seccin de enfermedades infecciosas. Hospital Galdcano (Vizcaya). Diagnstico microbiolgico de las infecciones por patgenos bacterianos emergentes: Anaplasma, Bartonella, Rickettsia, Tropheryma whipplei. Jos Ramn Blanco et al. rea de enfermedades infecciosas, Centro de Rickettsiosis y enfermedades transmitidas por artrpodos vectores. Hospital San Pedro CIBIR. Logroo. Ruz Beltrn R, Herrero Herrero JI, Martn Snchez AM, Martn Gonzlez JA. Prevalence of antibodies to Rickettsia conorii, Coxiella burnetii and Rickettsia typhi in Salamanca Province (Spain). Serosurvey in the human population. Eur J Epidemiol 1990;6:293-9 [Medline].

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