Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Misses Campus Santo ngelo/RS

Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Misses Campus Santo ngelo/RS 26 a 29 de abril de 2006

AVALIAO DO EFEITO CITOPROTETOR DO EXTRATO BRUTO E FRAES DE PLANTAS CONTRA DANOS OXIDATIVOS
Karina Azambuja Carbonari Universidade Federal de Santa Catarina URI / Santo ngelo - carbonari@urisan.tche.br Avaliou-se, neste estudo, a atividade antioxidante in vitro, in vivo e ex vivo de determinados produtos extrados de plantas medicinais por meio de uma triagem que incluiu vrios ensaios dentre os quais mensuraram a relativa habilidade scavenger de radicais livres e proteo contra a lipoperoxidao, hidroperoxidao de membranas celulares e contra danos ao DNA. A rutina um flavonide largamente distribudo no reino vegetal, presente em vrias plantas que apresentam importante atividade antioxidante. A rutina um flavonide bem conhecido extensivamente estudado, e so conhecidas suas mltiplas atividades farmacolgicas, incluindo ao antibacteriana, antiviral, antiprotozoria, antitumoral, antialrgica, antiinflamatria, antidiarrica, antiulcerativa, antiespasmdica, antimutagnica, protetora do miocrdio, vasodilatora, e sendo que a ao imunomoduladora tambm foi relatada. tambm considerado um importante agente antioxidante por inibir a lipoperoxidao e capturar o radial OH e o O2-.A proteo contra a peroxidao lipdica foi avaliada utilizando como substrato alvo homogenato de fgado de ratos. Neste ensaio, a peroxidao foi induzida pelo perxido t-butila. As trs plantas pesquisadas revelaram resultados importantes quando comparadas rutina. No que tange a Ouratea parviflora, excetuando-se a frao acetato de etila (OP3) que no apresentou atividade provavelmente por no conter compostos fenlicos, todos os demais produtos de Ouratea parviflora apresentaram importante efeito protetor da lipoperoxidao, sendo que o extrato bruto (OPEB) e a frao hidroalcolica (OP4) protegeram melhor as membranas celulares e nucleares (CE50 < 31,25 g.mL-1) dos efeitos da lipoperoxidao do que a rutina (CE50 = 203,83 1,44). Nas mesmas condies experimentais, o extrato etanlico e todas as fraes de Polymnia sonchifolia, excetuando-se a frao hexnica (PS7), tambm apresentaram maior eficincia (CE50 < 31,25 g.mL-1) quando comparados rutina (CE50 = 203,83 1,44g.mL-1). Com relao Marlierea obscura a proteo contra a lipoperoxidao de membranas tambm mostrou-se eficiente, sendo que as fraes hexnica (MO) e clorofrmica (MO1) exibiram (CE50 = 35,29 3,87g.mL-1 e 32,72 4,06g.mL-1) respectivamente. Sendo assim, mais expressivas que a da rutina (CE50 = 203,83 1,44g.mL-1). Tais resultados vo ao encontro dos relatos existentes na literatura, onde observa-se efeito inibitrio de compostos fenlicos, como flavonides, por serem estes, doadores de hidrognio, mecanismo de ao bsico dos antioxidantes. Com exceo dos ensaios DPPH e radical hidroxil, a atividade antioxidante do extrato bruto (OPEB) apresentou-se sempre maior que a rutina nos demais ensaios in vitro realizados. O extrato etanlico de Ouratea parviflora (OPEB), (OP4) e a frao (PS2) do extrato de Polymnia sonchifolia apresentaram ao scavenger tanto para O2- quanto OH, o que poderia explicar sua elevada proteo contra a lipoperoxidao de membranas celulares. Para tanto, a partir dos resultados exibidos pelos ensaios in vitro com relao atividade antioxidante das referidas plantas medicinais, selecionou-se a planta que revelou melhor

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potencial antioxidante que, no caso, foi Ouratea parviflora, destacando-se, dentre seus produtos, o extrato bruto (OPEB) e a frao hidroalcolica (OP4), que contm o flavonide rutina, para avaliao subseqente da atividade antioxidante in vivo.O tetracloreto de carbono (CCl4) um hidrocarboneto halogenado, muito utilizado em processos de sntese orgnica de compostos clorados, particularmente compostos aromticos halogenados, e tambm na indstria txtil de lavagem a seco, sendo um agente qumico altamente txico, causando principalmente, danos hepticos e renais. A exposio ao CCl4 pode acarretar o desenvolvimento de tumor e cirrose heptica, alm de necrose tubular aguda nos rins. Os efeitos txicos do CCl4 no fgado j foram extensivamente documentados na literatura. Sua ativao metablica pelo citocromo P450 gerando radicais livres, isto , o triclorometano e o radical peroxil do triclorometano, so utilizados para caracterizar a peroxidao de lipdios e a oxidao de protenas, o que geralmente responsvel pela hepatotoxicidade deste composto. Algumas investigaes sugerem que os efeitos nefrotxicos do CCl4 esto associados principalmente com a produo de radicais livres. O mecanismo pelo qual o CCl4 induz a hepatotoxicidade considerado, geralmente, resultante da ativao deste atravs do sistema microssomal do citocromo P450, no reticulo endoplasmtico dos hepatcitos, em que o radical triclorometil (CCl3) e o radical altamente reativo do peroxitriclorometil (O2CCl3) so as formas iniciadoras da peroxidao lipdica do retculo endoplasmtico no estgio avanado de toxicidade do CCl4. No presente estudo, o CCl4 foi utilizado para induzir a peroxidao lipdica endgena, a qual foi avaliada em termos de deteco dos derivados lipoperxidos, atravs de substncias que reagem com o cido tiobarbitrico (TBARS). O CCl4 induz a lipoperoxidao uma vez que houve um aumento significativo da concentrao de TBARS (606%) neste grupo. Observamos que apenas a rutina foi capaz de reverter este ndice de lipoperoxidao heptica causada pelo CCl4, sugerindo que este composto conferiu proteo s membranas celulares contra o ataque oxidativo de radicais livres, uma vez que, como j comprovado experimentalmente in vitro por relatos existentes na literatura, este composto possui grande atividade antioxidante. Curiosamente, no presente trabalho, o ensaio TBARS in vivo no comprovou os resultados obtidos in vitro com relao aos produtos OPEB e OP4 de Ouratea parviflora. Poderamos especular que talvez tenha havido um problema referente absoro intestinal ou celular destes produtos, pois diferentemente, no ensaio in vitro, os resultados revelaram-se distintos. importante ressaltar que neste ensaio in vivo os extratos e fraes foram solubilizados em uma soluo etanol (PA) e gua ultrapura, bidestilada e, dependendo de sua lipossolubilidade total poderiam ter dificuldade em atravessar a barreira lipdica das membranas celulares. Alm da avaliao da lipoperoxidao pelo TBARS, que quantifica a lipoperoxidao de forma geral, tambm procuramos mensurar a concencentrao de hidroperxido lipdico pelo ensaio com xilenol laranja (FOX reativo com hidroperxido lipdico). Nesta avaliao, a rutina apresentou a melhor proteo contra a hidroperoxidao, curiosamente OPEB e OP4, que contm rutina, apresentaram capacidades de proteo contra a hidroperoxidao semelhantes entre si e em relao rutina, corroborando os achados do ensaio TBARS in vitro, diferentemente do que observou-se no ensaio com TBARS in vivo. Com o intuito de confirmar a hiptese de que o CCl4, alm de causar importante dano pela peroxidao lipdica, tambm seria indutor de danos oxidativos significativos ao DNA, utilizou-se o ensaio cometa. Trata-se de um ensaio de alta sensibilidade na deteco de quebras de fitas simples e duplas de DNA em clulas eucariticas

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individuais alm de, virtualmente, poder ser utilizado para detectar possveis danos ao DNA de quaisquer clulas eucariticas. Os resultados obtidos comprovaram esta hiptese, demonstrando a capacidade do CCl4 de induzir um dano oxidativo considervel ao DNA de 120,4%. Dados na literatura demonstram que o CCl4 induz uma fragmentao importante 24 horas aps administrao.A rutina utilizada como composto de referncia, capaz de proteger o DNA do ataque oxidativo dos radicais livres do CCl4, foi capaz de reduzir o dano a este cido nuclico em 35,34%. Segundo YAMAGUCHI et al. (2005) os flavonides possuem importante atividade como agentes antioxidantes por mecanismos scavenger de radicais livres com formao de pequenos radicais fenoxil reativos dos flavonides, o que impediria o ataque oxidativo ao DNA. O OPEB tambm foi capaz de reduzir significativamente o dano ao DNA causado pelo CCl4, no havendo diferena estatstica significativa entre os referidos tratamentos prvios e o grupo controle negativo, mostrando um efeito protetor sobre o DNA de hepatcitos, ainda no relatado na literatura. Com relao frao OP4, o DNA foi mais fortemente protegido, observando-se uma elevao estatisticamente significativa na proteo fragmentao deste cido nucleico (p<0,01) quando comparado ao grupo controle positivo e com relao a rutina. Este resultado promissor revela que a frao OP4, foi mais efetiva em proteger possveis danos ao DNA do que a prpria rutina, de ao congnere.Dados existentes na literatura sugerem que o CCl4 induz a carbonilao das protenas dos hepatcitos de camundongos. Segundo AHAMED et al. (2000), o CCl4 pode induzir hipertrofia heptica, necrose dos hepatcitos alm de causar acmulo de triacilglicerois, diminuindo o contedo de GSH, aumentando a lipoperoxidao, danificando a membrana, deprimindo a sntese de protenas e a atividade de vrias enzimas.Os resultados obtidos mostraram que o CCl4 causou uma elevao de 40,5% na carbonilao de protenas. Tanto OPEB quanto OP4 apresentaram uma proteo mais expressiva que a rutina sobre o dano oxidativo s protenas. Tais resultados so extremamente importantes, pois demonstram que o extrato etanlico desta planta e sua frao hidroalcolica (OPEB e OP4) respectivamente, exibem um importante e significativo efeito citoprotetor contra o ataque oxidativo do CCl4 s protenas, pois evita a carbonilao destas e, tambm, refora os dados anteriormente apresentados relativos proteo contra a peroxidao lipdica (HPO) in vivo e, com relao ao dano ao DNA. Ao avaliar-se possveis danos causados s protenas, o extrato bruto e frao hidroalcolica de O.parviflora revelaram-se mais efetivos que a rutina, embora a frao hidroalcolica tenha apresentado melhor efeito protetor de dano a macromolculas proticas. Ao avaliar-se o dano ao DNA dos camundongos, os resultados indicam que, tanto a rutina quanto o extrato bruto e frao hidroalcolica de O.parviflora, protegeram de modo altamente significativo da ao do CCL4, sendo que a frao hidroalcolica de O.parviflora revelou ser mais efetiva, inclusive, que a prpria rutina. Embora os resultados disponibilizados neste estudo sejam promissores, estudos adicionais sero necessrios para melhor elucidar, tanto o mecanismo de ao antioxidante quanto antiinflamatria das referidas plantas medicinais.