EFECTO DE TEMPERATURA, HUMEDAD, LIMPIEZA DE CAMA Y NMERO DE PARTO SOBRE LA PRODUCCIN DE RATAS Sprague Dawley, EN EL LABORATORIO DE ENSAYOS BIOLGICOS1

Oscar M. Carmona Arguedas1, Karen Corrales Bolvar1, Sergio Cubero Soto1, Melissa Valverde Hernndez1
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Estudiantes de Estadstica. Facultad de Ciencias Econmicas. Universidad de Costa Rica. San Jos, Costa Rica.

RESUMEN

Palabras claves: Sprague Dawley, cras, produccin ratas.

ABSTRACT
Key words: Sprague Dawley,

Introduccin
El mantenimiento de animales de laboratorio, es una importante rea para las investigaciones Biomdicas, por lo que es necesario controlar las condiciones ambientales para contar con animales de calidad microbiolgica y genticamente definida. Para esto dichas condiciones deben estar estandarizadas y estar de acuerdo con normas internacionales. Las ratas son ampliamente usadas en muchos laboratorios, por lo que cualquier hallazgo para su salud, bienestar, y productividad puede tener implicaciones en la investigacin y tambin en la economa del laboratorio. Este animal es el que ms se utiliza en las pruebas de diagnstico e investigacin, dado a sus caractersticas que facilitan el trabajo de laboratorio debido a su tamao, eficiencia reproductiva, variabilidad gentica, y susceptibilidad a agentes qumico y microbianos, convirtindolo as en el ptimo para la realizacin de estudios mdicos y biolgicos (Osorio y Cardozo de Martnez, 2000;Popka, 2001). Para el adecuado mantenimiento de los animales en el laboratorio se deben tomar medidas tales como: El grado de proteccin de los animales de los agentes infecciosos es la mayor consideracin en el diseo de las instalaciones. Para esta proteccin es necesario incluir el uso de la barrera sanitaria y un patrn especial del flujo del trfico del personal y los materiales. (Cardoso, 2000, 2007; Hrapkiewicz, 2007). La limpieza y cambio de esta es necesaria para la salud de los animales, ya que se disminuyen los niveles de amonio y de microorganismos. Sin embargo la frecuencia con que la limpieza se realiza es de gran importancia ya que con esta se eliminan importantes seales olfatorias en el cuidado prenatal (Burn y Manson, 2008a).

Estudios han demostrado que la alta frecuencia en el cambio de la cama afecta el bienestar de los ratones e incrementa la mortalidad en las cras, sin embargo parece que dichos efectos son a largo plazo (Burn y Manson, 2008a), aunque tambin se ha sugerido que no hay diferencias significativas en el bienestar de los ratones con cambio de cama cada dos semanas o veces por semana (Burn y Manson, 2008b). Se debe tomar en cuenta que tambin existen algunos criterios deseables para la cama, y deben controlarse en este estudio para evitar distorsiones en las dems variables estudiadas por lo tanto debera contar con las siguientes caractersticas: absorba la humedad, exenta de polvo, no permita el crecimiento bacteriano, no comestible, no manche, no ocasione traumatismos, se pueda esterilizar. No forme productos indeseables despus de la esterilizacin. Fcil de almacenar. No sea desecante para los animales. No contaminada, no nutritiva, desagradable al gusto, difcil de masticar o de guardar en la boca. No txica, no maloliente, apropiada para la nidacin y la incineracin, fcil de obtener, relativamente barata, resistente al fuego. No sea perjudicial y no presente peligro o riesgos para el personal ( Kraft y cols,1994; HARLAN, 2002).

Efecto de la temperatura, humedad, cambio de cama y cantidad de parto en ratas Sprague Dawley

La cama en las jaulas o cajas de los animales se cambia tan frecuentemente como sea necesario para mantener a los animales limpios, secos, sin mal olor y para mantener el control del amonaco en los niveles aceptables, es decir, 25 ppm (Popka, 2001; Fabricio, 2008). Para los animales menores de laboratorio, se cambia la cama de las jaulas de una a tres veces por semana, en dependencia de variables tales como el tamao de los animales, la densidad de la poblacin, el tipo de jaula y el grado de produccin de excrementos (CCAC, 2007; UE, 2007). En estndares internacionales, la humedad dentro de los laboratorios debe estar entre 40% y 70%, y una de las formas en que esta se puede controlar es por medio de la ventilacin (Fuentes et al, 2008). Por debajo de 40% se incrementa el riesgo de enfermedad y cambios en la piel, as como enfermedades respiratorias, adems tanto ratas como ratones se vuelven estriles cuando el aire es seco. Por otro lado, una alta humedad favorece la proliferacin bacteriana y produccin de amonio en las camas (Animal Welfare Branch; Mart y Ferr, 1987). Las variaciones en la temperatura es uno de los factores ms importantes en el ambiente de los ratones. Las exigencias de temperatura para ratones son de 20C a 25C (Fuentes et al, 2008). Variaciones en la temperatura afecta el desempeo reproductivo, el crecimiento de los ratones, y aumenta la muerte de embriones (Animal Welfare Branch). En la etapa de apareamiento y produccin de nuevas cras, varios autores sostienen que al momento del destete de las cras, la contabilizacin del nmero de cras obtenidas (supervivencia) es comn que se encuentre entre el 85 % y 90 % respecto a la cantidad de nacidas. El desarrollo de esta investigacin se dio con la ayuda del LEBi, laboratorio donde se realizan proyectos de investigacin, anlisis, pruebas biolgicas y conductuales que empleen animales de laboratorio o sus productos como modelo, as como proveer animales de laboratorio. Adems cuenta con la capacidad instalada para ejecutar y desarrollar tcnicas en biotecnologa, brindar asesora en el rea de ensayos biolgicos y produccin animal. Esta investigacin se realiz con el objetivo de estudiar la relacin existente entre la frecuencia de cambios de cama, cambios en la temperatura y humedad, y el nmero de partos con la supervivencia de las cras de las ratas Sprague Dawley, por medio de un modelo de regresin.

Materiales y Mtodos
En este proyecto se van a estudiar 40 ratas madres Sprague-Dawley. Los datos del experimento se recolectaron entre enero de 2009 y mayo de 2011; donde se obtuvieron en total 534 cras nacidas, con un promedio de 13,35 por cada rata madre. El experimento inicia su etapa el da de nacimiento de las cras hasta la etapa del destete, aproximadamente posee una durabilidad de tres semanas. Durante este periodo se determinaron y recolectaron los datos de las siguientes variables:

Efecto de la temperatura, humedad, cambio de cama y cantidad de parto en ratas Sprague Dawley

Cambios de Cama Las cajas donde se encuentran las ratas madres Sprague-Dawley con sus cras tienen una dimensin de 595 x 380 x 200 mm (largo x ancho x altura), las cuales poseen burucha de madera en el interior para colocar la camada (cras). En el estudio este factor, se dividi en dos grupos: control y tratamiento, donde en el primero se realizan 2 cambios de cama, y en el segundo se realiza un solo cambio de cama. Estos cambios son realizados semanalmente. Para efectuar esta accin se realiza un procedimiento rpido y directo donde la madre y las cras son sacadas de la caja sucia hacia una limpia. Para pasar las cras son tomadas con ambas manos en forma de nido y traspasadas a la nueva caja. Una vez que hayan crecido un poco ms se toman de la cola. Las cajas de los animales se encuentran en las siguientes condiciones: se les coloca agua acidificada a un pH 2,5 y alimento especial para animales de laboratorio que pueden consumir sin ninguna restriccin. El cambio de la frecuencia de limpieza de las camas se ha aplicado durante la etapa de lactancia hasta el destete de manera continua, para ello se dividieron en 2 grupos, uno tratamiento y otro de control, cada uno con 4 hembras seleccionadas al azar, esta variable discreta fue recodificada como variable dummy, siendo 0 el grupo de control y 1 el grupo de tratamiento. Temperatura y Humedad. La temperatura fue medida con termmetro dentro del laboratorio a lo largo de cada da, registrando el dato mximo y mnimo, en grados Celsius. Luego se tom la diferencia entre la temperatura mxima y mnima, escogiendo para el anlisis la ms significativa dentro de las tres semanas de lactancia. Similarmente la variable humedad relativa fue medida con un higrmetro durante el da, recolectando el dato mximo y mnimo. Al igual que la temperatura, se seleccion la diferencia ms significativa dentro de las tres semanas del proceso. Tanto la temperatura como la humedad, no fueron medidas durante la noche. Cantidad de partos. Adems de los factores ya mencionados, se registr la cantidad de partos de la rata madre. Este elemento se encuentra relacionado con la madre y sus condiciones fsicas. En todas las unidades, se tomaron en cuenta nicamente los dos primeros partos. Adicionalmente, se registraron la cantidad de cras nacidas y fallecidas despus del destete por cada una de las ratas madres. Con todos estos registros, se elabor la base de datos.

Efecto de la temperatura, humedad, cambio de cama y cantidad de parto en ratas Sprague Dawley

Anlisis Estadstico
Para esta investigacin se opt por construir un modelo de regresin logstica, debido a que se quiere observar la influencia de las variables: cambios de cama, variaciones de temperatura y humedad, y nmero de parto en la probabilidad de sobrevivencia de cras de ratas Sprague Dawley en sus primeras tres semanas de vida. La ecuacin del modelo de regresin sera: ( Donde x1: cambio de cama. x2: cantidad de parto. x3: temperatura. x4: humedad. Adems al modelo anteriormente descrito fue corregido debido a que las cras de las ratas que provenan de la misma madre no eran independientes entre s. Este tipo de modelo es un mtodo adecuado para estimar la probabilidad de que una respuesta binaria ocurra y esta sea explicada por predictores continuos o categricos. (Jaume Arnau Gras, 1996) El modelo de regresin logstica no requiere la evaluacin de supuestos como linealidad, normalidad y homocedasticidad. Sin embargo, es adecuado analizar si el modelo tiene un buen ajuste. Para analizar esta caracterstica, se utiliza la prueba de Pearson. Para el procesamiento de los datos se utilizaron el software estadsticos JMP versin 7 y Stata versin 11. Adems, se utiliz un nivel de significancia de 0.05 para las pruebas realizadas. )

Resultados1
Durante el estudio de cada una de las variables se encontr un valor atpico en el cual la rata dio a luz una cama de 15 ratas, y en el momento del destete, se encontraron todas las cras muertas. Al ser este un valor influencial en la estimacin del modelo, se decidi, en conjunto con el encargado de la investigacin 2 eliminar dicha observacin debido a que no se puedo encontrar explicacin a la muerte de las ratas.

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Las salidas de las estimaciones hechas en Stata y JMP se pueden revisar en anexos. Edwin Len, Investigador del LEBi.

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El modelo utilizado fue el siguiente:3 ( Donde x1: cambio de cama. x2: cantidad de parto. x3: temperatura. x4: humedad Segn el anlisis estadstico realizado a la variable temperatura, se obtuvo una variabilidad mxima de 10C, y una mnima de 6,7C. Es importante resaltar que el modelo anteriormente descrito presenta un buen ajuste, esto se comprob con la prueba de Pearson de bondad de ajuste ( donde la hiptesis nula para esta prueba es que el modelo esta ajustado. Las razones de ventaja y los P-Value de cada una de las variables, calculadas a partir del modelo de regresin anterior pueden observarse en el Cuadro 1. Cuadro 1. Razones de ventaja y significancias de las variables dependientes sobre la prediccin de la probabilidad de estar vivo de la cra de Sprague Dawley. Universidad de Costa Rica, San Jos, Costa Rica. Noviembre, 2011.
Razn de Ventaja 1.057.485 1.063.365 .2317056 .730286 Significancia 0.852 0.293 0.012 0.568
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Temperatura Humedad Cantidad de parto Cambio de cama

Fuente: Investigacin propia

De la estimacin del modelo logstico el nico coeficiente de regresin que resulto significativo fue el asociado a la variable cantidad de parto (P-Value = 0.012). Por lo tanto, podemos decir que esta variable influye de forma negativa en la probabilidad de supervivencia de las cras de las ratas Sprague Dawley.
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Los valores entre parntesis son los valores P asociados a los coeficientes de regresin

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Ante la significancia de la variable cantidad de partos, se puede decir que las ratas que nacieron en segundo parto tienen una razn de ventaja 77% menor de estar muerta de las que nacieron en el primer parto. (Hay un 77% menos de ventaja de estar vivo nacido en el segundo parto). La razn de ventaja se interpreta como desfavorable cuando es menor a uno. Mediante anlisis multinivel, el modelo anterior contiene el factor de correccin en el cual se solventa la limitacin del modelo tradicional que rechaza la hiptesis de independencia entre las cras de una misma madre respecto al grupo de cras de otra rata madre. (Aparicio et al. 2007). Es decir, este modelo multinivel corrige el problema del no cumplimiento de la hiptesis de independencia sobre la que est basada el modelo tradicional, las estimaciones de los errores estndar seran incorrectos e invlidos. (Devis et al. 2001). Es por esto que las estimaciones de los errores presentes en el modelo con correccin multinivel son ms precisas, corrigen el sesgo mencionado anteriormente. En ambos modelos, los coeficientes se mantienen igual puesto que el elemento a corregir son los errores.
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Discusin
Frecuencia de Cambios de Cama. Uno de los puntos ms importantes de esta investigacin es encontrar las diferencias en la supervivencia de las cras dado las diferentes frecuencias en los cambios de cama. Segn los resultados obtenidos, no se encontr relacin significativa de la sobrevivencia de las ratas con respecto a un cambio de cama semanal. Sin embargo, lo esperado era que, a dos cambios de cama semanal el estrs de la rata aumentara debido a el contacto con los encargados de la limpieza (Burn, et al. 2005), adems el aumento en la frecuencia de cambio de camas afecta la comunicacin olfatoria, fsica y auditiva entre la madre y su camada, lo que puede llevar al rechazo de las cras (Burn y Manson, 2008). Por lo tanto se esperara una disminucin en la sobrevivencia de la cra. Sin embargo tambin sera de esperarse que al aumentar la frecuencia de cambio de cama se disminuya la muerte de las ratas debidas a infecciones debidas a virus, parsitos y bacterias (Burn, et al. 2005). Por lo tanto se podra suponer que la discrepancia entre estas premisas, anteriormente citadas influyen en el hecho de poder encontrar una relacin entre estas dos variables. La informacin brindada por el LEBi para la realizacin de este estudio no especifica las razones de las muertes de las cras, por lo que se hace difcil concluir respecto a la influencia del cambio de cama. Esto es importante ya que, segn Burn y Manson (2008), la muerte de las ratas puede deberse a muchas razones, entre ellas el canibalismo de las ratas madres hacia sus cras debido a un instinto cuando estas estn enfermas.
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Efecto de la temperatura, humedad, cambio de cama y cantidad de parto en ratas Sprague Dawley

El resultado obtenido en este estudio concuerda con trabajos realizados anteriormente, donde tampoco se logra identificar relacin entre frecuencia de cambio de cama y sobrevivencia de la camada (Burn, et al. 2005; Burn y Manson, 2008). Cambios en la Temperatura y Humedad. Segn diferentes estudios, la temperatura de mantenimiento de las ratas debe estar entre los 19C y 24C, es decir la variacin permitida es de 4C a 5C (Burn, et al. 2005; Burn y Manson, 2008; Mart y Ferre, 1987). Para el LEBi la variacin manejada en la temperatura es de 8C. Los cambios en la temperatura en nuestro estudio se encuentran entre 6C y 10C, y los de humedad estuvieron entre 21% y 45%, lo cual dificulta llegar a una conclusin con respecto al efecto de la temperatura y la humedad. Sin embargo, dichos cambios tan fuertes deberan reflejarse en un aumento de la muerte de las cras, lo cual no sucede. No hay explicacin terica de los resultados obtenidos. Es importante resaltar que estos resultados se pueden deber a la ausencia de control en la temperatura durante las noches, y adems las observaciones recolectadas fueron las que presentaron el cambio ms fuerte en las tres semanas sin tomar en cuenta lo que sucedi en todo el periodo. Dado a que los datos seleccionados para este estudio, particularmente la temperatura y la humedad no se midieron de manera indicada y apropiada por el LEBi; es una razn para que estas variables que tienen un gran respaldo terico no describan su efecto en el modelo estadstico. Cantidad de partos Como se puede observar en los resultados, esta variable s present un efecto sobre la sobrevivencia de las ratas. Por factores biolgicos, esta especie de rata, al igual que otras especies animales y vegetales, se ven influenciadas por el historial de fecundidad de la madre: conforme aumenta la cantidad de partos que tiene la madre, los nacimientos de nuevas cras van disminuyendo as como su sobrevivencia.
La madre primeriza se caracteriza por tener mayor cantidad de cras y tener ms posibilidad de resistir las primeras tres semanas de lactancia que son cruciales en su sobrevivencia. Esto puede darse por factores biolgicos.
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Conclusiones
Al igual que otros estudios, no se encuentra relacin entre la frecuencia de cambios de cama y la probabilidad de muerte de la rata. Por otro lado, debido a la dificultad en la toma de datos confiables por parte del LEBi, es difcil llegar a una conclusin con respecto a la temperatura y humedad. Sin embargo, esto podra cambiar si se realiza un nuevo estudio
con un mejor diseo del experimento y con una recoleccin de datos de manera ms favorable.

Efecto de la temperatura, humedad, cambio de cama y cantidad de parto en ratas Sprague Dawley

La variable que mostro una relacin negativa con la probabilidad de sobrevivencia de las ratas fue la Cantidad de Partos.

Bibliografa
MELY, AGREGALE LA BIBLIOGRAFA DEL ANTEPROYECTO. ADJUNTALE ESTA QUE UTILICE Aparicio A., Morera M. (2007) La conveniencia del anlisis multinivel para la investigacin en salud: Una aplicacin para Costa Rica. Poblacin y Salud en Mesoamerica. 4(2), 1-23. Extrado el 17 de noviembre desde http://ccp.ucr.ac.cr/revista/volumenes/4/4-2/4-2-1t/index.htm
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Efecto de la temperatura, humedad, cambio de cama y cantidad de parto en ratas Sprague Dawley

ANEXOS Salidas del programa estadstico STATA v.11, utilizado para el anlisis de los datos. Modelo de regresin logstica:
. logistic vivo gruo nparto temp hum Number of obs = 534 LR chi2(4) Prob > chi2 Log likelihood = -157.56986 Pseudo R2 = 30.29 = 0.0000 = 0.0877

Logistic regression

-----------------------------------------------------------------------------vivo | Odds Ratio Std. Err. z P>|z| [95% Conf. Interval]

-------------+---------------------------------------------------------------gruo | nparto | temp | hum | .730286 .2317056 1.057485 1.063365 .2304869 .0880269 .2137609 .0592995 -1.00 -3.85 0.28 1.10 0.319 0.000 0.782 0.271 .3934085 .1100419 .7115605 .9532668 1.355633 .4878824 1.571582 1.18618

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Modelo de regresin logstica con factor de correccin (multinivel)

. logistic vivo gruo nparto temp hum,cluster(id) Number of obs Wald chi2(4) Prob > chi2 Log pseudolikelihood = -157.56986 Pseudo R2 = = = = 534 13.26 0.0101 0.0877

Logistic regression

(Std. Err. adjusted for 39 clusters in id) -----------------------------------------------------------------------------| vivo | Odds Ratio Robust Std. Err. z P>|z| [95% Conf. Interval]

-------------+---------------------------------------------------------------gruo | .730286 .401812 -0.57 0.568 .2484001 2.147011

Efecto de la temperatura, humedad, cambio de cama y cantidad de parto en ratas Sprague Dawley
nparto | temp | hum | .2317056 1.057485 1.063365 .1343913 .3178189 .0620678 -2.52 0.19 1.05 0.012 0.852 0.293 .0743416 .5867492 .9484152 .7221725 1.905883 1.192248

------------------------------------------------------------------------------

Prueba de Bondad de Ajuste (Residuales de Pearson)

. estat gof Logistic model for vivo, goodness-of-fit test number of observations = number of covariate patterns = Pearson chi2(9) = Prob > chi2 = 534 14 15.53 0.0773

Correlaciones entre las variables

. cor vivo gruo nparto temp hum

(obs=534) | vivo gruo nparto temp hum

-------------+--------------------------------------------vivo | gruo | nparto | temp | hum | 1.0000 -0.0440 -0.2258 -0.0492 0.1161 1.0000 -0.0317 0.0992 -0.2543 1.0000 0.4008 -0.2688 1.0000 0.0814 1.0000

Salidas del programa Jump v.7 para el anlisis de datos.