TESE Fungos Endofíticos Michelia Champaca

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
Julio de Mesquita Filho

Instituto de Qumica de Araraquara
Tese de Doutorado
BUSCA DE SUBSTNCIAS BIOATIVAS EM FUNGOS ASSOCIADOS

COM A ESPCIE Michelia champaca L. (Magnoliaceae)
IOANIS HCRISTOS LEPTOKARYDIS
Araraquara 2008
FICHA CATALOGRFICA
L611b
Leptokarydis, Ioanis Hcristos

Busca de substncias bioativas em fungos endofticos associados com a
espcie Michelia champaca L. (Magnoliaceae) / Ioanis Hcristos Leptokarydis.
- Araraquara : [s.n], 2008
262 f. : il.
Tese (doutorado) Universidade Estadual Paulista, Instituto de Qumica
Orientador: Angela Regina Arajo
1. Qumica orgnica. 2. Fungos endofticos. 3. Colletotrichum

gloeosporioides. 4. Michelia champaca L. I. Ttulo.
Elaborao: Servio Tcnico de Biblioteca e Documentao do Instituto de Qumica de

Araraquara
Seo Tcnica de Aquisio e Tratamento da Informao
IOANIS HCRISTOS LEPTOKARYDIS
Busca de Substncias Bioativas em Fungos Associados com a Espcie Michelia

champaca L. (Magnoliaceae)
Tese apresentada ao Instituto de Qumica,

Universidade Estadual Paulista, como parte dos
requisitos para obteno do titulo de Doutor em
Qumica.
Orientadora: Prof. Dra. ngela Regina Arajo.
Araraquara
2008
Dedico este trabalho...
A minha Me, pela pessoa maravilhosa e que sempre esteve presente, apoiando e me
fortalecendo em todos os momentos. meu exemplo de vida.
A meu irmo (Daniel) e cunhada (Simone) que sempre estiveram ao meu lado,
participando de cada momento de desafio e alegria durante esta trajetria. E meu querido
sobrinho. Thiago que traz mais felicidade a nossa famlia, e um novo sentido a minha vida.
minha querida Veridiana Dionzio pelo amor, constante incentivo e

companheirismo. Conhec-la me fez uma pessoa melhor, am-la me fez uma pessoa muito
mais feliz.
A querida Prof. ngela, a qual serei grato pelos seus ensinamentos. Graas a sua
dedicao se tornou possvel a realizao deste trabalho sendo de fundamental importncia
para minha formao.
A querida Prof. Mrcia Nasser, a qual serei eternamente grato pelos seus conselhos,
ensinamentos e sua dedicao nos momentos mais difceis que passei durante este trajeto,
tornando possvel a finalizao deste trabalho.
A todas as pessoas que por motivos profissionais, pessoais ou acadmicos chegarem

a esta Tese.
AGRADECIMENTOS
O cientista que raciocina segundo o plano da percepo dos sentidos o que se acha mais afastado do
reconhecimento da verdade, porque toma todas as iluses produzidas plos sentidos como realidades e repele as
revelaes de sua prpria intuio. O filsofo, incapaz de perceber a verdade, procura adquiri-la por meio da
inteligncia, podendo dela aproximar-se at certo ponto. S aquele que adquiriu a condio consciente da
verdade, reconhecendo-a por percepo direta, a ela se acha intimamente unido e no pode absolutamente
enganar-se. poderosa tribuna do aperfeioamento. (Prof. Jos Henrique de Sousa)
A Deus, pela presena constante iluminando minha vida, orientando meus caminhos e me
dando sabedoria.
Ao Departamento de Qumica Orgnica do Instituto de Qumica - UNESP, Araraquara, pela
possibilidade do desenvolvimento deste trabalho e por ter sido cenrio de uma etapa muito
importante da minha vida.
Prof. Dra. ngela R. Arajo pela orientao. Obrigado por sua dedicao em todos estes
anos.
Aos professores membros da banca que gentilmente aceitaram o convite para avaliao desta
tese.
Aos docentes do Departamento de Qumica Orgnica: Vanderlan S. Bolzani, Mrcia Nasser
Lopes, Maysa Furlan, Alberto J. Cavalheiro, Lcia M. X. Lopes, Dulce H. Siqueira, Wagner
Vilegas, Lourdes Campaner dos Santos, lan Castro-Gamboa e Isabele Nascimento plos
ensinamentos transmitidos e pela amizade.
s Professoras Lcia M. X. Lopes, Wagner Vilegas que participaram do meu exame de
qualificao e contriburam valiosamente com sugestes e ensinamentos.
Ao Dr. Nivaldo Boralle pela realizao dos inmeros espectros, amizade e por estar sempre
disposto a compartilhar seus conhecimentos.
Ao Dr. Alberto Camilo Alcio por ser to prestativo, no medindo esforos para colaborar
com o trabalho cientifico.
Aos meus grandes amigos Ms. Renata Sordi, Dr. Helder L. Teles, ex-colegas de grupo e
competentes profissionais. Obrigado pelas inmeras dicas, discusses pertinentes e
ensinamentos que colaboraram para a realizao deste trabalho.
Aos amigos de grupo: Mariana C. Cafu, Lisinia M. Zanardi, Camila M. de Oliveira, pela
amizade convivncia e colaborao dentro e fora do laboratrio.
A todos os amigos do departamento, que ainda esto ou j passaram por l: Carenina Vidoti,
Daniara, Karin Bandeira, Fernanda Garcia, Amanda Danuelo, Marcos Pivato, Cludio
Viegas, Guilherme Zucolo, Cristiano, Fernando Continguiba, Otvio Fausino, Ana Lcia,
Andra Morandim, Viviane Cndida, Amlia, Jonas Mota, Hosana, Douglas Pichi, Aline,
Andr, Gisele Baraidi, Marcos Batista, Patrcia Pauleti, Marcos, Wanessa, Magela, Sara,
Aristeu Tininis e a todos que passaram por este grupo, plos momentos de alegria
compartilhados que fizeram a rotina do laboratrio ainda mais agradvel.
As festinhas de defesa e de final de ano, reunies de grupo e congressos sero para sempre
lembradas.
Aos meus eternos amigos da Tarraketa local onde morei e guardarei pela eternidade os
momentos maravilhosos que tive l.
Aos meus eternos amigos da Repblica GA: Allynsom, Marcos (Tomate) Norberto (Yo) pelas
inmeras conversas que tivemos e pelos momentos de amizade que sempre ficaro em minha
mente.
s secretrias da Ps-Graduao - Sandra, Patrcia e Clia por serem atenciosas e gentis.
s funcionrias da Biblioteca: Cristina e Valria, sempre a disposio para ajudar e a todos os
outros funcionrios que esto ou j passaram por l, pela dedicao e auxlio.
Agradeo a todos que participaram direta ou indiretamente do desenvolvimento deste trabalho
e aos meus inimigos ocultos que ao tentarem me atrapalhar acabaram me ajudando muito no
meu desenvolvimento.
As Empresas Anaber Cosmticos e Asca Brinquedos por permitir que eu pudesse trabalhar em
perodo diferenciado dando a possibilidade de continuar o meu Doutorado.
PENSAMENTOS
O mestre est disponvel para todas as pessoas e no rejeita nenhuma delas. Ele est pronto
a usar todas as situaes e nada desperdia. Isto o que se chama personificar a luz. (LaoTzu, To Te King)
Nunca desista nesse momento, porque exatamente neste lugar e hora que a mar vai
mudar. (Harriet Beecher Stowe)
S til o conhecimento que nos torna melhores. (Scrates)
Sbio aquele que conhece os limites da prpria ignorncia. (Scrates)
Trs coisas devem ser feitas por um juiz: ouvir atentamente, considerar sobriamente e
decidir imparcialmente. (Scrates)
RESUMO
Os fungos, diferente dos vegetais so heterotrficos, mais especificamente
quimiorganotrficos, por suas caractersticas especficas pertencem a um reino separado.
Alguns dos fungos atravs de sua evoluo se especializaram em invadir os espaos
intercelulares das plantas passando a sobreviver dentro dos seus hospedeiros, no provocando
nenhuma patologia. Estes microrganismos so denominados de fungos endofticos. A disputa
por alimentos entre os fungos no interior das espcies vegetais, gerou a necessidade dos
fungos produzirem metabolitos secundrios com atividades contra outros microrganismos,
podendo assim demarcar seu territrio. Todo este processo deve acontecer de forma a no
causar patologias na planta que a fonte de seu alimento, em alguns casos essas relaes de
mutualismo e comensalismo se aprimoraram sendo muito comum alguns vegetais possuirem
fungos endofticos protegendo contra pragas insetos e patgenos. Este trabalho descreve o
isolamento e a purificao dos fungos endofticos associados s folhas, caules, razes e
sementes da espcie vegetal Michela champaca. Foram isolados 8 fungos, sendo 3 dos caules,
4 das folhas, 1 das razes, nenhum fungo foi isolado das sementes. Os extratos brutos
produzidos por estes fungos em caldo de dextrose e batata foram avaliados quimicamente
(CLAE-DAD e RMN1H) e submetidos bioensaios para avaliao da potencialidade
anticancergena, antifngica e anticolinestersica. Todos os extratos apresentaram atividade
contra os fungos fitopatognicos Cladosporium cladosporioides e Cladosporium
sphaerospermum e 40% apresentaram atividade frente s linhagens mutantes de
Saccharomyces cerevisiae. Aps esta triagem, os fungos endofticos Mc-8R (ainda no
identificado) e Colletotrichum gloeosporioides (Mc-7F) foram selecionados para estudo
qumico/biolgico. Estes foram cultivados em culturas fermentativas em larga escala em CDB
para obteno dos extratos brutos. O extrato bruto AcOEt, obtido aps cultivo de Mc-8R em
CDB, levou, aps fracionamento cromatogrfico, ao isolamento das Pirenocinas A (1), E (2) e
B (3) e dos cidos Pirenochaticos, C (4), A (5) e B (6), j descritos na literatura e os cidos
Pirenochaticos (7) e (8) inditos. No estudo da variao metablica, modificando os meios
de cultivo, foi possvel identificar o Ergosterol (9) e o Perxido de Ergosterol (10) nos
extratos hexnicos de Arroz e Milho, respectivamente. O extrato AcOEt de Mc-7F
identificado como Colletotrichum gloeosporioides, foi submetido a tcnicas cromatogrficas e
espectroscpicas de RMN uni e bidimensionais e permitiu o isolamento e identificao das
substncias Uracila (11), ciclo-(S*-Pro-S*-Tyr) (12), ciclo-(S*-Pro-S*-Val) (13), cido-(2Amino-fenil)-actico (14), cido-(4-Hidroxi-fenil)-actico (15), 4-Hidroxi-benzamida (16) e
cido-(2-Hidroxi fenil)-actico (17), e dos derivados indlicos inditos (18) e (19). Dos
extratos AcOEt de Mc-C3 (Xylaria sp.) e Mc-6F (Phomopsis stipata) foram isoladas as
substncias cido 2- hexilideno-3- metilsuccnico (20) e o cido 3-nitropropinico (21).
Todas substncias tiveram suas estruturas identificadas ou determinadas atravs de tcnicas
espectroscpicas (RMN de 1H e 13C, HMBC, HMQC, NOESY, COSY) e espectrometria de
massas (ESI-MS). Das substncias isoladas de Mc-8R e Colletotrichum gloeosporioides, 72%
e 66% apresentaram atividade antifngica e 56% e 89 % atividade anticolinesterase,
respectivamente.
Palavras-chave: fungo endofitico, Colletotrichum gloeosporioides; Michelia champaca
ABSTRACT
Some fungal species, through their evolution, have specialized in invading plants and
surviving inside their hosts causing no warm them. These microorganisms have been called
endophytic which in the invasion process, produce chemical substances that inhibit
competitors to invade their neighborhood and thus survive in harmony with the host. This
work seeks to evaluate the chemical diversity of substances from endophytic fungi associated
to Michelia champaca L. that present biological activity by isolating and identification of
their secondary metabolites. This work resulted in the isolation of eight fungi species and
selection of 2 strains which presented strong antifungal activity against Cladosporium
cladosporioides and C. sphaerospermum, both of them pathogenic fungus; and a weak
antitumor activity against mutant strains of Saccharomyces cerevisiae. The first one was
codified as Mc-8R and chromatographic fractionation of its EtOAc extract allowed the
identification of the Pirenocines A (1), E (2) and B (3) and the Pirenochaetic acids, C (4), A
(5) and B (6), and in addition to the novel (7) and (8). Ergosterol (9), was found in the hexanic
extract obtained from growing Mc-8R in rice, and the Ergosterol peroxide (10), which was
isolated from the hexanic extract in corn. The other selected fungi species was identified as
Colletotrichum gloeosporioides. The fractioning of its EtOAc extract led to the isolation of
the known substances as Uracil (11), cyclo-(S*-Pro-S*-Tyr) (12), cyclo-(S*-Pro-S*-Val) (13),
2-Aminophenyl acetic acid (2-APA), (14), p-Hydroxyphenylacetic acid (15), 4-Hydroxybenzamide (16) and (2-Hydroxy-phenyl)- acetic acid (17), in addition to the novel compounds
(18) and (19). 2-Hexylidene-3-methylsuccinic acid (20) was also identified as major
compound from the fungus Mc-C3, (Xylaria sp.). The fungus Mc-6F was identified as
Phomopsis stipata and its extract contained 3-Nitro-propionic acid (21) as major compound.
The eight endophytic studied presented activity against the phytopathogenic fungi
Cladosporium sphaerospermum and C. cladosporioides; about 40% of the isolated fungi had
also presented activity against mutant strains of Saccharomyces cerevisiae. Of isolated
substances from Mc-8R, 72% they had presented antifungal activity and 56% had presented
anticholinesterasic activity. From Colletotrichum gloeosporioides, 78% of the isolated
compounds presented antifungal and anticholinesterase activity.
Keywords: endophytic fungus; Colletotrichum gloeosporioides; Michelia champaca
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Substncias bioativas obtidas a partir de fungos .................................................................. 22
Figura 2: Foto de Michelia Champaca L. (Magnoliaceae) Fonte: Ioanis H. Leptokarydis ................. 31
Figura 3: Substncias bioativas obtidas a partir do fungo Colletotrichum gloeosporioides ................ 33
Figura 4: Cromatogramas em grad. explorat. das fraes Mc-8R XAD Solto e XAD Saco (H2O0,5%
HOAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm) em C-18............................. 48
Figura 5: Cromatogramas em grad. explorat. do extrato Mc-8R (H2O/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40 em
C-18....................................................................................................................................................... 52
Figura 6: Cromatogramas em grad. explorat. das fraes Mc-8R1, Mc-8R2, e Mc-8R3 obtidas do
fracionamento cromatogrfico do extrato AcOEt de Mc-8R (H2O0,5%HOAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40,
com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm)................................................................................................... 54
fracionamento cromatogrfico do extrato AcOEt de Mc-8R (H2O0,5% HOAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40,
fracionamento cromatogrfico do extrato AcOEt de Mc-8R (H2O0,5% HOAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40,
Figura 9: Cromatogramas em grad. explorat. das fraes Mc-8R7, Mc-8R8, Mc-8R9 e Mc-8R10
obtidas do fracionamento cromatogrfico do extrato AcOEt de Mc-8R (H2O0,5% HOAc/MeOH; 95:5 a
0:100 em 40, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm). .......................................................................... 56
Figura 10: Grfico 01: variao metablica de Mc-8R com vrios meios de culturas e condies de
crescimento ........................................................................................................................................... 68
Figura 11: Estrutura da Citreopirona (Pirenocina A) (1) ..................................................................... 74
Figura 12: Estrutura da Pirenocina E (2) ............................................................................................. 76
Figura 13: Estrutura da Pirenocina B (3) ............................................................................................. 77
Figura 14: Estrutura parcial A para substncia (4)............................................................................... 79
Figura 15: Estrutura parcial B para substncia (4) ............................................................................... 79
Figura 16: Estrutura do cido Pirenochatico C (4)............................................................................ 79
Figura 17: Estrutura parcial B para a substncia (5)............................................................................ 80
Figura 18: Estrutura do cido Pirenochatico A (5)............................................................................ 81
Figura 20: Estrutura do cido Pirenochatico B (6)............................................................................ 83
Figura 22: Estrutura da substncia (7) ................................................................................................. 84
Figura 23: Estrutura parcial B para a substncia (8) ............................................................................ 85
Figura 24: Estrutura da substncia (8) ................................................................................................. 85
Figura 25: Estrutura da do Ergosterol (9) ............................................................................................ 87
Figura 26: Estrutura do Perxido de Ergosterol (10) ........................................................................... 88
Figura 27: Estrutura da Uracila (11) .................................................................................................... 89
Figura 28: Estrutura ciclo-(S*-Pro-S*-Tyr) substncia (12) ................................................................ 91
Figura 29: Estrutura da ciclo-(S*-Pro-S*-Val) para substncia (13) ................................................... 93
Figura 30: Estrutura da cido-(2-Amino-fenil)-actico para substncia (14) ..................................... 95
Figura 31: Estrutura da cido-(4-Hidroxi-fenil)-actico para substncia (15).................................... 97
Figura 32: Estrutura da 4-Hidroxi-benzamida para substncia (16) .................................................... 98
Figura 33: Estrutura da cido-(2-Hidroxi fenil)-actico para substncia (17) .................................... 99
Figura 34: Estruturas Parciais A e B da Substncia (18) ................................................................... 101
Figura 35: Principais correlaes observadas em gHMBC para a substncia (18)............................ 102
Figura 36: Estruturas Parciais A e B da Substncia (19) ................................................................... 104
Figura 37: Principais correlaes observadas em gHMBC para a substncia (19)............................ 104
Figura 38: Estrutura do cido 2-hexilideno-3-metilsuccnico (20)................................................... 106
Figura 39: Grfico 2: Atividade antifngica das substncias (1) a (19) frente os fungos Cladosporium
cladosporioides e C. sphaerospermum ............................................................................................... 108
Figura 40: Grfico 3: Atividade antifngica das substncias isoladas de Mc-7F frente os fungos
Cladosporium cladosporioides em limite de deteco........................................................................ 108
Figura 41: Grfico 4: Atividade antifngica das substncias isoladas de Mc-7F frente os fungos
Cladosporium sphaerospermum em limite de deteco...................................................................... 109
Figura 42: Grfico 5 e 6: Atividade inibidora da acetilcolinesterase das substncias isoladas de Mc-8R
e Mc-7F ............................................................................................................................................... 110
Figura 43: Espectro de RMN de 1H de Mc-1C (CDCl3 a 11,7 T) ..................................................... 121
Figura 44: Espectro de RMN de 1H de Mc-2C (CDCl3 a 11,7 T)...................................................... 122
Figura 45: Espectro de RMN de 1H de Mc-3C (CDCl3 a 11,7 T)...................................................... 122
Figura 46: Espectro de RMN de 1H de Mc-4F (CDCl3 a 11,7 T)....................................................... 122
Figura 47: Espectro de RMN de 1H de Mc-5F (CDCl3 a 11,7 T) ...................................................... 123
Figura 50: Espectro de RMN de 1H de Mc-8R (CDCl3 a 11,7 T)...................................................... 124
Figura 51: Cromatograma em CLAE-DAD de Mc-8R Czapek com deteco monitorada em 254nm.
............................................................................................................................................................. 125
Figura 52: Espectro de RMN de 1H de Mc-8R Czapek (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................... 125
Figura 53: Cromatograma em CLAE-DAD de Mc-8R Nutriente com deteco monitorada em 254nm.
............................................................................................................................................................. 126
Figura 54: Espectro de RMN de 1H de Mc-8R Nutriente (DMSO-d6 a 11,7 T)................................ 126
Figura 55: Cromatograma em CLAE-DAD de Mc-8R YM com deteco monitorada em 254nm. . 127
Figura 56: Espectro de RMN de 1H de Mc-8R YM (DMSO-d6 a 11,7 T) ......................................... 127
Figura 57: Cromatograma em CLAE-DAD de Mc-8R Extrato de Malte com deteco monitorada em
254nm.................................................................................................................................................. 128
Figura 58: Espectro de RMN de 1H de Mc-8R Extrato de Malte (DMSO-d6 a 11,7 T)..................... 128
Figura 59: Cromatograma em CLAE-DAD de Mc-8R Arroz ACN com deteco monitorada em
254nm.................................................................................................................................................. 129
Figura 60: Espectro de RMN de 1H de Mc-8R Arroz ACN (DMSO-d6 a 11,7 T) ............................ 129
Figura 61: Cromatograma em CLAE-DAD de Mc-8R Milho ACN com deteco monitorada em
254nm.................................................................................................................................................. 130
Figura 62: Espectro de RMN de 1H de Mc-8R Milho ACN (DMSO-d6 a 11,7 T) ............................ 130
Figura 63: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-8R Arroz Hex (CDCl3 a 11,7 T ).................. 131
Figura 64: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-8R Milho Hex (CDCl3 a 11,7 T) .................. 131
Figura 65: CCDC das fases Hexnicas do Milho, Arroz e Arroz hex ppt, com eluente em 86% Hex
3% HAc 11 % (Soluo A) em tripla eluio. .................................................................................... 131
Figura 66: Cromatograma em grad. explorat. do extrato AcOEt Mc-7F.1 (H2O+0,5% HAc/MeOH;
95:5 a 0:100 em 40, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm)............................................................... 132
Figura 67: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-7F.1 (DMSO-d6 a 11,7 T) ............................. 132
Figura 69: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-7F.2 (DMSO-d6 a 11,7 T) ............................. 133
Figura 71: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-7F.3 (DMSO-d6 a 11,7 T) ............................ 134
Figura 85: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-7F.10 (DMSO-d6 a 11,7 T) .......................... 141
Figura 87: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-7F.11 (DMSO-d6 a 11,7 T) .......................... 142
Figura 88: Espectro de RMN de 1H de (1) (DMSO-d6 a 11,7 T)....................................................... 143
Figura 89: Espectro de RMN de 13C de (1) (DMSO-d6 a 11,7 T) ...................................................... 144
Figura 90: Mapa de contorno gHMQC de (1) (DMSO-d6 a 11,7 T) .................................................. 145
Figura 91: Mapa de contorno gHMBC de (1) (DMSO-d6 a 11,7 T) .................................................. 146
Figura 92: Espectro de RMN de gCOSY de (1) (DMSO-d6 a 11,7 T)............................................... 147
Figura 93: Espectro de Massas de (1) ................................................................................................ 148
Figura 94: Espectro de RMN de 1H de (2) (DMSO-d6 a 11,7 T) ....................................................... 149
Figura 95: Espectro de RMN de 13C de (2) (DMSO-d6 a 11,7 T T)................................................... 150
Figura 96: Mapa de contorno gHMQC de (2) (DMSO-d6 a 11,7 T) .................................................. 151
Figura 97: Mapa de contorno gHMBC de (2) (DMSO-d6 a 11,7 T) .................................................. 152
Figura 98: Espectro de RMN de gCOSY de (2) (DMSO-d6 a 11,7 T)............................................... 153
Figura 99: Espectro de Massas de (2) ................................................................................................ 154
Figura 100: Espectro de RMN de 1H de (3) (DMSO-d6 a 11,7 T) ..................................................... 155
Figura 101: Mapa de contorno gHMQC de (3) (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................................ 156
Figura 102: Mapa de contorno gHMBC de (3) (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................................ 157
Figura 103: Espectro de RMN gCOSY de (3) (DMSO-d6 a 11,7 T).................................................. 158
Figura 104: Espectro de Massas de (3) .............................................................................................. 159
Figura 106: Espectro de RMN de 13C de (4) (DMSO-d6 a 11,7 T) .................................................... 161
Figura 109: Espectro de gCOSY de (4) (DMSO-d6 a 11,7 T)............................................................ 164
Figura 110: Espectro de NOESY 1D de (4) (DMSO-d6 a 11,7 T) ..................................................... 165

Figura 135: Espectros de Massas de (8)............................................................................................. 190
Figura 136: Espectro de RMN de 1H de (9) (CDCl3 a 11,7 T) .......................................................... 191
Figura 137: Espectro de RMN de 13C de (9) (CDCl3 a 11,7 T) ......................................................... 192
Figura 138: Espectro de RMN de 1H de (10) (CDCl3 a 11,7 T) ........................................................ 193
Figura 139: Espectro de RMN de 13C de (10) (CDCl3 a 11,7 T) ....................................................... 194
Figura 140: Mapa de contorno gHMQC de (10) (CDCl3 a 11,7 T) ................................................... 195
Figura 141: Mapa de contorno gHMBC de (10) (CDCl3 a 11,7 T) ................................................... 196
Figura 142: Espectro de RMN de 1H de (11) (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................................... 197
Figura 143: Espectro de RMN de 13C de (11) (DMSO-d6 a 11,7 T) .................................................. 198
Figura 144: Mapa de contorno gHMQC de (11) (DMSO-d6 a 11,7 T) .............................................. 199
Figura 145: Mapa de contorno gHMBC de (11) (DMSO-d6 a 11,7 T) .............................................. 200
Figura 146: Espectro de gCOSY de (11) (DMSO-d6 a 11,7 T).......................................................... 201
Figura 152: Espectro de NOESY 1D de (12) (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................................... 207
Figura 153: Espectro de Massas de (12) ............................................................................................ 208
Figura 160: Espectro de Massas de (13) ............................................................................................ 215
Figura 166: Espectros de Massas de (14)........................................................................................... 221
Figura 169: Espectro de DEPT 135 de (15) (DMSO-d6 a 11,7 T) ..................................................... 224
Figura 179: Espectros de DEPT de (17) (DMSO-d6 a 11,7 T)........................................................... 234

Figura 185: Espectro de DEPT de (18) (DMSO-d6 a 11,7 T) ............................................................ 240
Figura 193: Espectro de DEPT de (19) (DMSO-d6 a 11,7 T) ............................................................ 248
Figura 201: Espectro de DEPT de (20 (DMSO-d6 a 11,7 T).............................................................. 256
LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 1: Isolamento dos fungos associados.................................................................................... 44
Esquema 2: Cultivo dos fungos, obteno dos extratos e triagem qumico/biolgica......................... 46
Esquema 3: Extrato Produzido por Mc-8R em CDB........................................................................... 46
Esquema 4: Extrato Produzido por Mc-8R em CDB na Presena de XAD 2...................................... 47
Esquema 5: Extratos obtidos em Mc-8R em Czapek, Nutriente, YM e Extrato de Malte................... 49
Esquema 6: Extratos Obtidos da Variao Metablica de Mc-8R em Arroz e Milho ......................... 51
Esquema 7: Separao Cromatogrfica do Extrato de Mc-8R obtido no crescimento em CDB via
CLAE. ................................................................................................................................................... 53
Esquema 8: Separao Cromatogrfica do Extrato Mc-8R XAD Saco via CLAE.............................. 53
Esquema 9: Fracionamento em coluna comatrogrfica do Extrato Mc-8R obtido no crescimento em
CDB ...................................................................................................................................................... 54
Esquema 10: Fracionamento Cromatogrfico Frao Mc-8R.3 .......................................................... 57
Esquema 11: Fracionamento Cromatogrfico de Mc-8R4 .................................................................. 58
Esquema 12: Fracionamento Cromatogrfico Frao Mc-8R Milho Hex ........................................... 59
Esquema 13: Extrato obtido do crescimento de Colletotrichum Gloeosporioides (Mc-7F) em CDB. 59
Esquema 14: Fracionamento Cromatogrfico do Extrato Mc-7F em C-18 ......................................... 60
Esquema 15: Fracionamento Cromatogrfico em C-18 do Extrato Mc-7F.1 ...................................... 61
Esquema 16: Fracionamento Cromatogrfico Extrato Mc-7F.1 .......................................................... 61
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Metablitos secundrios produzidos por microrganismos endofticos. ............................... 25
Tabela 2: Meios de cultura utilizados para os crescimentos dos fungos.............................................. 39
Tabela 3: Rendimento dos extratos dos fungos endofticos fermentados em 500 ml de CDB ............ 62
Tabela 4: Resultados das atividades antifngicas dos extratos produzidos pelos endofticos isoldos de
M. champaca. ........................................................................................................................................ 62
Tabela 5: Resultados obtidos no ensaio com S. cerevisiae dos extratos produzidos pelos endofticos
isolados de M. champaca. ..................................................................................................................... 63
Tabela 6: Resultados obtidos no ensaio ensaios de inibio da acetilcolinesterase para os extratos dos
endofticos isolados de M. champaca. .................................................................................................. 63
Tabela 7: Resultados do limite de deteco em bioautografia dos extratos Mc-6F e Mc-8R. ............. 64
Tabela 8: Relao produtiva dos fungos por quantidade de meio de cultura....................................... 68
Tabela 9: Dados de RMN de 1H e 13C da Pirenocina A (1) (CDCl3 a 11,7 T) ..................................... 75
Tabela 10: Dados de RMN de 1H e 13C da Pirenocina E (2) (CDCl3 a 11,7 T).................................... 76
Tabela 11: Dados de RMN de 1H e 13C da Pirenocina B (3) (DMSO-d6 a 11,7 T) .............................. 77
Tabela 12: Dados de RMN de 1H, 13C, gHMBC e NOESY 1D do cido Pirenochatico C (4)
(DMSO-d6 a 11,7 T).............................................................................................................................. 80
Tabela 13: Dados de RMN de 1H e 13C dos cidos Pirenochaticos A, B, 7 e 8 (DMSO-d6 e CDCl3, a
11,7 T) ................................................................................................................................................... 82
Tabela 14: Dados de RMN de 13C do Ergosterol (9) (CDCl3 a 11,7 T) e dados de RMN de 13C
literatura para o Ergosterol (SHIRANE, et al., 1996). .......................................................................... 87
Tabela 15: Dados de RMN de 13C do Perxido de Ergosterol (10) (CDCl3 a 11,7 T) e dados de RMN
de 13C literatura para o Perxido de Ergosterol (YUE, J. M. et al, 2001) ............................................. 88
Tabela 16: Dados de RMN de 1H, 13C, gHMBC e gCOSY da Uracila (11) (DMSO-d6 a 11,7 T)....... 89
Tabela 17: Dados de RMN de 1H, 13C, gHMBC e NOESY 1D da ciclo-(S*-Pro-S*-Tyr) (12) (DMSOd6 a 11,7 T)............................................................................................................................................ 92
Tabela 18: Dados de RMN de 1H, 13C, gHMBC e NOESY 1D da ciclo-(S*-Pro-S*-Val) (13) (DMSOd6 a 11,7 T)............................................................................................................................................ 94
Tabela 19: Dados de RMN de 1H, 13C e gHMBC cido-(2-Amino-fenil)-actico (14) (DMSO-d6 a
11,7 T). .................................................................................................................................................. 95
Tabela 20: Dados de RMN de 1H, 13C e gHMBC cido-(4-Hidroxi-fenil)-actico (15) (DMSO-d6 a
11,7 T) ................................................................................................................................................... 97
Tabela 21: Dados de RMN de 1H, 13C e gHMBC 4-Hidroxi-benzamida (16) (DMSO-d6 a 11,7 T) ... 98
Tabela 22: Dados de RMN de 1H, 13C e gHMBC cido-(2-Hidroxi fenil)-actico (17) (DMSO-d6 a
11,7 T) ................................................................................................................................................. 100
Tabela 23: Dados de RMN de 1H, 13C e gHMBC da Substncia (18) (DMSO-d6 a 11,7 T) ............. 102
Tabela 24: Dados de RMN de 1H, 13C e gHMBC da Substncia (19) (DMSO-d6 a 11,7 T) ............. 104
Tabela 25: Dados de RMN 1H, 13C, gHMBC, e gCOSY do cido 2-hexilideno-3-metilsuccnico (20)
(CDCl3, a 11,7 T) ................................................................................................................................ 106
Tabela 26: Resultados da atividade antifngica das substncias isoladas do extrato de Mc-7F
Colletotrichum gloeosporioides e Mc-8R. .......................................................................................... 107
Tabela 27: Resultados da atividade antifngica em limite de deteco das substncias isoladas do
extrato de Mc-7F frente o fungo Cladosporium cladosporioides ....................................................... 108
Tabela 28: Resultados da atividade antifngica em limite de deteco das substncias isoladas do
extrato de Mc-7F frente o fungo Cladosporium sphaerospermum ..................................................... 109
Tabela 29: Resultados dos ensaios de inibio da acetilcolinesterase das substncias isoladas. ....... 110
ABREVIATURAS E SMBOLOS
AcOEt
AChE
ACN
BDA
CDB
CC
CCDC
CLAE
CLAE-DAD
C-18
Czapek
DMSO-d6
explorat.
gCOSY
gHMBC
gHMQC
grad.
HAc
Hex.
ISP
J
1
JCH
2
JCH
3
JCH
4
JCH
ME
MeOH
min.
multip.
NuBBE
Nutrient
p.
pgs.
ppt
rf
RMN de 1 H
RMN de 13C
subst.
TMS
tr.
YM
C
H
Acetato de etila
Acetilcolinesterase
Acetonitrila
Batata Dextrose Agar
Caldo de Batata Dextrose
Cromatografia em coluna
Cromatografia em camada delgada comparativa
Cromatografia lquida de alta eficincia
Cromatografia lquida de alta eficincia com detector em arranjo de diodos
Slica gel de fase reversa tipo octadecil silano
Sacarose, NaNO3, Na2(PO4)3, MgSO4, KCl, FeSO4
Dimetilsulfxido deuterado
Exploratrio
Gradient Correlated Spectroscopy
Gradient Heteronuclear Multiple Bond Coherence
Gradient Heteronuclear Multiple Quantum Coherence
Gradiente
cido actico
Hexano
Isopropanol
Constante de Acoplamento
Correlao entre carbono hidrognio a uma ligao
Correlao entre carbono hidrognio a duas ligaes
Correlao entre carbono hidrognio a trs ligaes
Correlao entre carbono hidrognio a quatro ligaes
Extrato de Malte
Metanol
Minutos
Multiplicidade
Ncleo de Bioensaio, Biosntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais
Extrato de carne, peptona
Pagina
Paginas
Precipitado
Retention factor
Ressonncia Magntica Nuclear de Hidrognio
Ressonncia Magntica Nuclear de Carbono 13
Substncia
Tetrametilsilano
Tempo de reteno
Extrato de levedura, extrato de malte, peptona e dextrose
Deslocamento qumico de carbono
Deslocamento qumico de hidrognio
SUMRIO
1 INTRODUO .............................................................................................................................. 20
1.1 - A Importncia Ecolgica e Biotecnolgica dos Microrganismos em Qumica de Produtos
Naturais ................................................................................................................................................. 20
1.2 - A Importncia Ecolgica e Biotecnolgica dos Fungos ............................................................... 21
1.3 - Microrganismos Endofticos......................................................................................................... 23
1.3.1 - Fungos Endofticos. ................................................................................................................... 23
1.4 - A Espcie Vegetal Michelia champaca (Magnoliaceae) Planta Extica. ..................................... 30
1.5 O Fungo Colletotrichum gloeosporioides Isolado de Michelia champaca .................................. 31
1.5.1 O Gnero Colletotrichum .......................................................................................................... 31
1.5.1.1 O Fungo Colletotrichum gloeosporioides .............................................................................. 32
2 - OBJETIVOS .................................................................................................................................... 34
3 - DESENVOLVIMENTO EXPERIMENTAL .................................................................................. 35
3.1 - Especificao dos Materiais, Instrumentos e Tcnicas Utilizadas................................................ 35
3.1.1 - Solventes Utilizados: ................................................................................................................. 35
3.1.2 - Evaporador Rotatrio:................................................................................................................ 35
3.1.3 - Cromatografia Lquida de Alta Eficincia: ................................................................................ 35
3.1.4 - Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC):..................................................... 36
3.1.5 - Cromatografia em Coluna:......................................................................................................... 36
3.1.6 - Ressonncia Magntica Nuclear: ............................................................................................... 37
3.1.7 - Espectrometria de Massas (EM): ............................................................................................... 37
3.1.8 Ensaio Bioautogrfico:.............................................................................................................. 38
3.1.9 - Bioensaio com Saccharomyces cerevisiae:................................................................................ 38
3.1.10 - Cultivo dos Fungos Endofticos em Vrios Meios de Cultura:................................................ 38
3.2 - Anlises Qumicas e Biolgicas.................................................................................................... 39
3.2.1 - Cromatografia Lquida de Alta Eficincia com Detector UV em Arranjo de Diodos (CLAEDAD):.................................................................................................................................................... 39
3.2.2 - Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC):..................................................... 39
3.2.3 - Critrios de Pureza:.................................................................................................................... 40
3.2.4 - Ensaio para Deteco de Substncias com Atividade Antitumoral Potencial e/ou Citotxica:. 40
3.2.5 - Ensaio para Avaliao da Atividade Antifngica Atravs de Bioautografia:............................ 41
3.2.6 - Ensaio Preliminar para a Deteco de Inibidores da Enzima Acetilcolinesterase: .................... 42
3.3 - Isolamento e Purificao dos Fungos Endofticos Associados Michelia champaca.................. 43
3.3.1 Identificao dos Fungos Isolados de Michelia champaca. ...................................................... 45
3.4 - Cultivo dos Microrganismos e Obteno dos Extratos. ................................................................ 45
3.4.1 - Triagem Qumica a e Biolgica dos Extratos dos Fungos Associados Michelia champaca... 45
3.5 Cultivo com CDB em Larga Escala do Fungo Endoftico Mc-8R com CDB.............................. 46
3.5.1 Variao Metablica de Mc-8R em CDB na Presena de XAD 2 ............................................ 47
3.5.2 Variao Metablica de Mc-8R em Diferentes Meios de Cultura. .............................................. 48
3.5.3 Variao Metablica Triagem dos Extratos para Estudo de Mc-8R em Arroz e Milho............ 49
3.6 - Fracionamento do Extrato Mc-8R ................................................................................................ 51
3.6.1 - Fracionamento via CLAE do Extrato Mc-8R Obtido em CDB ................................................. 51
3.6.2 Fracionamento do Extrato Mc-8R XAD Saco via CLAE. ........................................................ 53
3.6.3 - Fracionamento via CC do Extrato Mc-8R Obtido em CDB ...................................................... 54
3.6.4 Purificao da Frao Mc-8R Milho Hex. ................................................................................ 58
3.7 Cultivo do Fungo Mc-7F com CDB em Larga Escala. ................................................................ 59
3.8 - Fracionamento do Extrato Mc-7F Obtido em CDB...................................................................... 59
3.8.1 - Fracionamento em CLAE das Fraes Mc-7F.1 e Mc-7F.2 ...................................................... 60
4 - RESULTADOS E DISCUSSES. .................................................................................................. 62
4.1 Triagem Qumica e Biolgica dos Extratos dos Fungos Endofticos Isolados de Michelia
champaca. ............................................................................................................................................. 62
4.1.1 Fungos Endofticos Isolados dos Caules de Michelia champaca.............................................. 64

4.1.2 Fungos Endofticos Isolados das Folhas de Michelia champaca. ............................................. 65
4.1.3 Fungos Endofticos Isolados das Razes de Michelia champaca .............................................. 67
4.2 Cultivo do Endoftico Mc-8R em Diferentes Meios de Cultura................................................... 67
4.3 Elucidao Estrutural das Substncias Isoladas. .......................................................................... 73
4.3.1 Elucidao Estrutural das Substncias Produzidas por Mc-8R................................................. 73
4.3.1.1 Identificao Estrutural da Citreopirona (Pirenocina A) (1). ................................................. 73
4.3.1.2 Identificao Estrutural da Pirenocina E (2). ......................................................................... 75
4.3.1.3 Identificao Estrutural da Pirenocina B (3). ......................................................................... 76
4.3.1.4 Identificao Estrutural do cido Pirenochatico C (4)......................................................... 78
4.3.1.5 Identificao Estrutural do cido Pirenochatico A (5). ....................................................... 80
4.3.1.6 Identificao Estrutural do cido Pirenochatico B (6)......................................................... 81
4.3.1.7 Elucidao Estrutural do cido Pirenochatico (7) ............................................................... 83
4.3.1.8 Elucidao Estrutural do cido Pirenochatico (8) ............................................................... 84
4.3.1.9 Identificao Estrutural de Ergosterol (9) .............................................................................. 86
4.3.1.10 Identificao Estrutural do Perxido de Ergosterol (10)...................................................... 87
4.3.2 Elucidao Estrutural das Substncias Produzidas por Mc-7F ................................................. 89
4.3.2.1 Identificao Estrutural da Uracila (11) ................................................................................. 89
4.3.2.2 Identificao Estrutural do ciclo-(S*-Pro-S*-Tyr) (12).......................................................... 90
4.3.2.3 Identificao Estrutural do ciclo-(S*-Pro-S*-Val) (13).......................................................... 92
4.3.2.4 Identificao Estrutural de cido-(2-Amino-fenil)-actico (14)............................................ 94
4.3.2.5 Identificao Estrutural de cido-(4-Hidroxi-fenil)-actico (15) .......................................... 96
4.3.2.6 Identificao Estrutural de 4-Hidroxi-benzamida (16)........................................................... 97
4.3.2.7 Identificao Estrutural do cido-(2-Hidroxi fenil)-actico (17) .......................................... 98
4.3.2.8 Elucidao Estrutural de (18) ............................................................................................... 100
4.3.2.9 Elucidao Estrutural de (19) ............................................................................................... 102
4.3.3 Elucidao Estrutural da Substncia Produzida por Mc-3C Xylaria sp. ................................. 105
4.3.3.1 Identificao Estrutural do dicido cido 2-hexilideno-3-metilsuccnico (20) ................... 105
4.4 Atividade Biolgica das Fraes e Substncias Isoladas de Mc-7F e Mc-8R............................ 107
4.4.1 Avaliao da Atividade Antifngica de (1) a (19) Frente aos Fungos Fitopatognicos
Cladosporium cladosporioides e C. sphaerospermum........................................................................ 107
5 CONSIDERAES FINAIS........................................................................................................ 111
REFERNCIAS.................................................................................................................................. 114
ANEXOS............................................................................................................................................. 120
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ____________________________________________1 - Introduo 20
1 INTRODUO
1.1 - A Importncia Ecolgica e Biotecnolgica dos Microrganismos em Qumica de
Produtos Naturais
Entre todos os produtores de molculas naturais conhecidas, os microrganismos
representam uma rica fonte de metablitos biologicamente ativos com larga aplicao como
agroqumicos, antitumorais, antiparasitrios, imunossupressores entre outros. Estima-se que
apenas 1% das bactrias e 5% dos fungos encontrados nos solos so conhecidos, indicando a
possibilidade de se encontrarem milhares de espcies ainda desconhecidas. Estes
microrganismos so encontrados na Antrtida, rtico, Alpes, desertos, regies ridas,
vulcnicas e solos frteis ou infrteis, englobando assim todo planeta abrangendo todos os
ecossistemas, independente de suas condies geogrficas ou climticas.
Historicamente, de todos os microrganismos estudados, os actinomicetos e os fungos
imperfeitos mostraram-se melhores produtores de metablitos secundrios. Isto sugere que os
fungos so essenciais para a sade e prosperidade de todo ecossistema terrestre sendo
essenciais para sua sustentabilidade e biodiversidade. Existem as relaes simbiticas entre
espcies que se beneficiam reciprocamente (mutualismo) que oferecem proteo a pragas e
outros microrganismos patognicos atravs da produo de metablitos secundrios ou uma
relao, alimentar, na qual uma espcie se beneficia sem prejudicar a outra (comensalismo),
tendo assim uma relao harmnica entre microrganismos e hospedeiros.
A evoluo dos estudos biolgicos vem demonstrando um ciclo de interao
intrinsecamente forte entre hospedeiros e microrganismos sendo estes endoftico. Em estudos
mais aprofundados possvel averiguar a existncia de fungos micorrzicos arbusculares
migrando para o interior da planta e estabelecendo uma relao mutualista (GUNATILAKA,
2006).
1.2 - A Importncia Ecolgica e Biotecnolgica dos Fungos

Os fungos so organismos heterotrficos, mais especificamente quimiorganotrficos
tpicos de ambientes midos e encontra-se distribudos em habitats diversos como gua, solo,
ar e sobre partculas em suspenso e podem ser unicelulares (leveduriforme) ou pluricelulares
(miclio). So divididos, conforme o habitat, em grupos como coprfilos, micoparasitas de
gua doce ou marinhos, termoflicos, filoplanos, epifticos, endofticos, entre outros. Estimase que existam pelo menos um milho e quinhentas mil espcies de fungos
(HAWKSWORTH, 2001).
Os fungos comumente prosperam em ambientes competitivos, mantendo relaes
simbiticas (mutualismo ou comensalismo), trficas (predao e parasitismo) e de competio
(por territrio e recursos alimentares) com outros organismos do seu ecossistema. Eles podem
ser predadores de insetos e nematides. Fungos endofticos do gnero Claviceps so
encontrados principalmente em gramneas e produzem os alcalides de ergot, substncias que
ao serem ingeridas junto com a planta provocam doenas em insetos e mamferos herbvoros,
protegendo a planta e o fungo dos predadores (TAN; ZHANG; SONG, 2006).
A relao de parasitismo fungo-planta envolve a produo de fitoalexinas, que so
produzidas pela planta visando conter a infeco fngica (GLOER, 1995). Os fungos por sua
vez, produzem fitotoxinas que causam a necrose e a morte do tecido vegetal (HARBONE,
1994). Fungos patognicos de ervas daninhas apontam como uma fonte de novos herbicidas,
com forte atividade (HOAGLAND, 1990). Nas relaes de competio, o mecanismo de
antagonismo envolve a produo de agentes qumicos por uma espcie, inibindo o
crescimento da outra. Isto um indicativo de que os metablitos responsveis por esses
efeitos so essencialmente antibiticos naturais (WICKLOW, 1992 e CARROL, 1992).
Aproximadamente 25% dos produtos naturais biologicamente ativos at hoje
conhecidos, foram obtidos a partir de fungos (KONGSAEREE, et al., 2003).
Dentre eles destacam-se os antibiticos -lactmicos das classes da Penicilina F

(Penicillium chrysogenum) e Cefalosporina C (Cephalosporium acremonium) que juntos
representam um mercado mundial de 15,0 bilhes de dlares e a Ciclosporina A
(Tolypocladium inflatum gams) (imunossupressor) e Lovastatina (Aspergillus terreus)
(redutor de colesterol), (Figura 1: p. 22) que so responsveis por um mercado mundial de
1,5 e 8,4 bilhes de dlares, respectivamente (DEMAIN, 2000). Entre 2000 e 2003, de todos
os frmacos originados de produtos naturais ou derivados destes lanados nos EUA, Europa e
Japo, pelo menos quatro foram derivadas ou sintetizadas a partir de metablitos secundrios
de fungos (BUTLER, 2004).
H
H2N
CONH
Penicilina F
CONH
HOOC
Cefalospporina C
CH2OAc
COOH
HO
COOH
O
O
HO
Lovastatina
MeN
CONMe
CONMe
H
CO
OCH3
CONH
CONMe
NMe
H3C
CO
OC
NHCO
NHCO
NMeCO
O
Ciclosporina A
OH
N
O
HO
CH2OH
Aspercilina
N
H
OH
H
N
O
OH
O
OH
CO
Figura 1: Substncias bioativas obtidas a partir de fungos
OH
Papulacadina
NHCO
NMe
1.3 - Microrganismos Endofticos

Microrganismos endofticos so geralmente bactrias e/ou fungos que colonizam o
interior de rgos vegetais, sem causarem nenhuma patologia ou danos ao hospedeiro. Esta
uma relao simbitica (GUNATILAKA, 2006).
Os primeiros relatos de endofticos datam de 1904. Na poca foi dada pouca
relevncia a esta classe. Recentemente, descobriram a importncia ecolgica destes
microrganismos atravs da produo de metablitos secundrios com diferentes estruturas e
atividades biolgicas. H duas dcadas atrs existiam apenas 100 espcies de endofticos
avaliados sob a tica de suas produes metablicas, cujas estruturas apresentaram atividades
biolgicas interessantes (GUNATILAKA, 2006).
1.3.1 - Fungos Endofticos.
Com a evoluo das espcies fngicas algumas se tornaram endofticas se
especializando em invadir os espaos celulares dos tecidos vegetais, atravs das razes,
estmatos e feridas (ANDREWS; HIRANO, 1991).
Apresentam um enorme potencial ainda muito pouco explorado sendo um importante
nicho de produo de novos metablitos secundrios bioativos (GUNATILAKA, 2006).
Uma vez instalado, o endfito pode habitar a planta por toda sua vida, em alguns casos
sendo transmitido atravs das sementes (CARROL, 1988).
Qualquer espcie de planta vascular pode hospedar entre 10 e 100 diferentes espcies
de fungos endofticos, sendo no mnimo duas especficas do hospedeiro (DREYFUSS;
CHAPELA, 1994). Os endofticos no apresentam estruturas que perfuram as clulas da
planta e digerem as substncias no seu interior (haustrios), estrutura comum em fungos
fitopatognicos e em geral, as infeces causadas por fungos endofticos no produzem
sintomas externos, podendo estar latentes ou serem assintomticas (PETRINI; CARROL,
1981 & PETRINI, 1986).
Entretanto, mudanas no hospedeiro causadas por fatores de stress, podem induzir a

transio de um estado simbitico (mutualismo ou comensalismo) a trfico (parasitismo)
(PETRINI, O, 1991).
Nas relaes mutualistas, alm de proteger as plantas contra insetos e patgenos, os
fungos endofticos ainda so capazes de produzir metablitos que aumentam o crescimento e
enraizamento da planta hospedeira e a sua resistncia a estresses biticos e abiticos
(HALLMANN, J. et al., 1997). Estas molculas que podem possuir vrias atividades:
hormnios, antibiticos, antitumorais entre outras funes biolgicas, apresentam grande
interesse industrial e biotecnolgico. Pesquisadores da Sandoz, em um programa de triagem
de produtos naturais oriundos de fungos verificaram que entre os fungos filamentosos, os
endofticos so os mais produtivos quimicamente, apresentando uma produo de metablitos
secundrios 73% maior que os outros fungos (DREYFUSS, M. M., 1994).
O estudo feito por Schulz, B. et al., (2002), mostra que 51% das substncias
biologicamente ativas isoladas de fungos endofticos eram inditas em comparao com
somente 38% de novas substncias isoladas da microbiota de solo.
Gunatilaka A. A. L. (2006) fez um levantamento da diversidade dos metablitos
isolados de microrganismos endofticos e relatou o isolamento de substncias pertencentes a
diversos grupos estruturais como esterides, xantonas, fenis, isocumarinas, alcalides,
quinonas, furandionas, terpenides, peptdeos, citocalasinas compostos alifticos entre outros.
Levantamento bibliogrfico sobre a ocorrncia de metablitos secundrios isolados de
microrganismos endofticos evidenciou um grande nmero de substncias bioativas, sendo
destacadas algumas na Tabela 1: p. 25
Tabela 1: Metablitos secundrios produzidos por microrganismos endofticos.

Microrganismo
Acremonium zeae (NRRL
13540) (mitosporic Hypocreales)
Aspergillus clavatus strain H037 (Trichocomaceae)
Aspergillus fumigatus CY018
(Trichocomaceae)
Aspergillus niger IFB-E003

(Trichocomaceae)
Hospedeiro
(tecido vegetal)
Zea maydis L. (Milho)
(Poaceae); (Semente)
Taxus mairei
(Leme & Lv.) and
Torreya grandis Arn.
(Taxaceae); Casca
Cynodon dactylon (L.)
Pers. (Poaceae); folha

Pers. (Poaceae); folhas
Produto Natural
pirrocidina A
pirrocidina B
Brefeldina A
asperfumoide
asperfumina
monometilsulocina
fumigaclavina C
fumitremorgina C
pisiona
ergosterol
cido helvolico
peroxido de ergosterol
cyclo (Ala-Leu)
cyclo (Ala-Ile)
rubrofusarina B
fonsecinona A
Aspergillus parasiticus
RDWD1-2
(Trichocomaceae)
Sequoia sempervirens
(D. Don) Endl.
(Taxodiaceae); casca
aurasperona A
asperpirona B
sequoiatona C
sequoiatona D
sequoiatona E
sequoiatona F
sequoiamonascina A
sequoiamonascina B
sequoiamonascina C
sequoiamonascina D
Aspergillus sp.
(Strain #CY725)
(Trichocomaceae)

Botrytis sp. (Sclerotiniaceae)
Taxus brevifolia Nutt.

(Taxaceae); casca
Cephalosporium sp.
IFB-E001
(mitosporic Hypocreales)
Cephalosporium sp.
Trachelospermum
jasminoides Lemoire
(Apocynaceae); vine
Dendrobium nobile Sw.
(Orchidaceae); razes
Ceratopycnidium baccharidicola
(Ascomycetes, Incerte sedis)
Baccharis cordifolia L.
(Asteraceae); tronco;
folhas
monometilsulocrim
cido helvolico
ergosterol
perxido de ergosterol
ramulosina
6-hidroxramulosina
8-dihidroramulosina
grafislactona A
ergosterol
cyclo (Gly-Val)
cido butanodioico
sulfato de colina
2-[2-(hidroxi-tetracosanoil)
amino]-1,3,4-octadecatriol
leucine
D-manitol
meso-eritritol
cido piridina-3-carboxilico
-estearina
uracila
rodicins
verrucarins
Atividade Biolgica
Antifngico; bactericida
antifngico; antiviral;
anticancer; herbicida
antifngico;antimictico
antifngico; antimictico
citotxico; inibidor da
xantina oxidase
antifngico; inibidor da
xantina oxidase
txico para Artmia salina
txico para Artmia salina;
citotxico
antibitico; inibidor de
clula brancas
bactericida
antibitico
antibitico
antibitico
antioxidante; anti radicais
livres
Txico para animais

Txico para animais
Tabela 1: Metablitos secundrios produzidos por microrganismos endofticos (continuao).

Chaetomium chiversii
CS-36-62 (Chaetomiaceae)
Hospedeiro
(tecido vegetal)
Ephedra fasciculata A. Nels
(Ephedraceae); tronco
Chaetomium globosum
(chaetomiaceae)
Ephedra fasciculata A. Nels

(Ephedraceae); tronco
Cladosporium herbarum
IFB-E002
(Mycosphaerellaceae)
Cynodon dactylon (L.) Pers.

(Poaceae); folhas
Microrganismo
Colletotrichum sp. strain EG4

(Phyllachoraceae)
Cytospora sp. CR 200
(Valsaceae)
Ginkgo biloba L. (Ginkgoaceae);

folhas
Conocarpus erecta L.
(Combretaceae); tronco
Diaporthe sp. CR 146

(Valsaceae)
Forsteronia spicata G. Meyer

(Apocynaceae); tronco
Dothiorella sp. strain HTF3

(Botryosphaeriaceae)
Aegiceras corniculatum Gaertner.

(Myrsinaceae) (Mangrove); casca
Eupenicillium sp.
(Trichocomaceae)
Murraya paniculata (L.) Jack

(Rutaceae); folhas
Fusarium oxysporum strain

97CG3
Fusarium sp. IFB-121
Catharanthus roseus (L.) G. Don

(Apocynaceae); casca interna
Quercus Variabilis L. (Fagaceae);
casca
Produto Natural
radicicol
cido orselinico
globosumona A
globosumona B
globosumona C
tricodiona
orcinol
aspernigrina A
rubrofusarina B
fonsecinona A
3,5,6-trihidroxiergosta-7,22-diene
7-hidroxi-4-metoxi-5metilcoumarina
orlandina
kotanina
compostos flavonodicos
citosporona A
citosporona B
citosporona C
citosporona D
citosporona E
citoskirina A
citoskirina B
citosporone A
citosporone B
citosporone C
citosporone D
citosporone E
citosporone B
dothiorelone A
dothiorelone B
dothiorelone C
dothiorelone D
alanditripinona
alantrifenona
alantripinene
alantrileunona
vincristina
cerebroside
fusaruside
Fusidium sp.
(Mitosporic fungi)
Mentha aVensis L. (Lamiaceae);

folhas
Guignardia sp.
Hormonema sp. ATCC 74360
(Dothioraceae)
Leptosphaeria sp. strain IV403
(Leptosphaeriaceae)
Melanconium betulinium
(Melanconidaceae)
Spondias mombin L.
(Anacardiaceae); folhas
Juniperus communis L.
(Cupressaceae); folhas
Artemisia annua L. (Asteraceae);
tronco
Betula pendula Roth; B. pubescens
Ehrh. (Betulaceae); partes acima do
solo
fusidilactona A
fusidilactona B
fusidilactona C
cis-4-hidroxi-6deoxiscitalona
cido (-)-(S)-guignardic
(72)*
enfumafungina
cido leptosfaerico
leptosfaerona
cido
3-hidroxipropinico
Atividade Biolgica
Hsp90
citotxico
citotxico
xantina oxidase
Inibidor de germinao
de plantas
citotxico; antifngico
bactericida
bactericida
citotxico
citotxico
citotxico
citotxico
anticancergena
Bactericida; inibidor da
xantina oxidase
bactericida; inibidor da
xantina oxidase
Antifngico
Anti nematide

Microrganismo
Microsphaeropsis olivacea
(mitosporic Ascomycota)
Hospedeiro
(tecido vegetal)
Pilgerodendron
uviferum
(D. Don) flores
(Cupressaceae)
[Gymnosperm]; Floema
Produto Natural
7-hidroxi-2,4-dimetil-3(2H)benzofuranona
enalina
grafislactona A
botralina
Microsphaeropsis sp. strain

NRRL15684
Monochaetia sp.
(Amphisphaeriaceae)
Buxus sempervirens L.
(Buxaceae); folhas
Mycelia sterila
strain 4567
(Ascomycota)
Folhas tronco pecolo

de vrias plantas
floresta tropical
Cinnamomum
zeylanicum Schaelter.
(Lauraceae); caules
Cirsium arvense
(Canadian thistle)
(Asteraceae); ns
Mycelia sterilia
(Ascomycota)
Atropa belladonna L.
(Solanaceae); razes
Muscodor albus
(mitosporic Xylariales)
Nectria galligena
(Nectriaceae)
Malus x domestica
Borkch (apple)
(Rosaceae); xilema
antimicrobial; antiviral
cido ambuico
antimicotico
Antibiticos volateis
antibitico
3-acetil-6-hidroxi-4-metil-2,3dihidrobenzo-furano
3-(3,5-dihidroxi-2-metilfenil)-2butanona
4-acetil-3,4-dihidro-6,8-dihidroxi5-metilisocoumarina
4-acetil-3,4-dihidro-6,8- dihidroxi3-metoxi-5- metilisocoumarina
3,4-dihidro-3,6,8-tri- hidroxi-3,5dimetil-isocoumarina
6,8-diacetoxi-3,5dimetilisocoumarina
preussomerina G
preussomerina H
preussomerina I
preussomerina J
preussomerina K
preussomerina L
colletorina B
colletoclorina B
ilicicolina E
ilicicolina F
,-dehidrocurvularina
Penicillium implicatum
(isolate SJ21)
(Trichocomaceae)
Bontia daphnoides L.
(Scrophulariaceae);
madeira
Taxus mairei
(Leme & Lv) and
Torreya grandis Arn.
(Taxaceae); tronco
Diphylleia sinensis H L.
Li (Berberidaceae);.
razes; ndulos;
pecolos
inibidor da
acetilcolinesterase
inibidor da
acetilcolinesterase
ulocladol
2,5-diacetilfenol butirolactona I
lactona S 39163/F-I
ilicicolina C
Nodulisporium sp.
MF 5954, ATCC74245
(microsporic Xylariales)
Paecilomyces sp.
H-036 and W-001
(Trichocomaceae)
Atividade Biolgica
cido nodulisporico A
cido nodulisporico A1
cido nodulisporico A2
brefeldina A
Substncias anlogas ao
podofilotoxina
bactericida; antifngico;
inibidor da FPTase
inibidor da
acetilcolinesterase; inibidor
da -glucuronidase
inibidor da
da -glucuronidase
inibidor da
da -glucuronidase
citotxico para germinao
de sementes e inibidor de
crescimento de novas razes
inseticida
inseticida
Antifngico; antiviral;
anticancergeno; herbicida
anticancergeno

Microrganismo
Penicillium janczewskii
(Trichocomaceae)
Periconia sp.
OBW-15
(Halosphaeriaceae)
Hospedeiro
(tecido vegetal)
Prumnopitys andina
(Endl.) Laubenf.
(Podocarpaceae); floema
Taxus cuspidata
Siebold & Zucc.
(Taxaceae); interior das
cascas
Produto Natural
peniprequinolona
nematicida; hormnio de
crescimento das razes
gliovicina
melleina
citotxico contra
bactrias; antiviral;
fitotxico
antimictico; aumento da
germinao e crescimento
das razes (em baixa
concentrao)
aumento da germinao e
crescimento das razes
(em baixa concentrao)
antifungal; antimycotic
periconicina A
periconicina B
Pestalotiopsis jesteri
(Amphisphaeriaceae)
Pestalotiopsis
microspora
(Amphisphaeriaceae)
Pestalotiopsis spp.
(Amphisphaeriaceae)
Phomopsis phaseoli
(Valsaceae)
Phomopsis sp.
(Valsaceae)
Phyllosticta capitalensis
(telemorph Guignardia
mangiferae)
Pseudomassaria sp.
ATCC 74411
(Hyponectriaceae)
Fragraea bodenii Thunb.

(Gentianaceae); interior
das cascas
Terminalia morobensis L.
(Combretaceae); tronco
Atividade Biolgica
jesterona
hidroxijesterona
pestacina
Isopestacina
antimictico; antioxidante
antifngico; antioxidante
folhas e troncos de plantas

tropicais
Folhas de plantas tropicais
cido ambuico
antimictico
cido 3-hidroxipropinico
nematicida
Erythrina crista-galli L.
(Fabaceae); galhos mortos
phomol
antiinflamatrio (ensaios
com edemas em ratos);
fracamente citotxico
demetilasterriquinona B1 (DMAQB1)
Asterriquinona
Asterriquinona oxidada e
decomposta
cido rizoctnico
monometilsulocrim
ergosterol
3,5,6-trihidroxergosta-7,22dieno
(-)-oocidina A
Ativador de receptores de
insulina
temperate and tropical

madeira e folhas da rvore
Planta no identificada
(collected near Kinshasa,
Democratic Republic of
Congo); folhas
Rhizoctonia sp. Cy064

(mitosporic
Hymemomycetes)

Serratia marcescens
MSU-97
(Enterobacteriaceae)
Scytalidium sp.
Rhyncholacis penicillata
Tul. (Podostemaceae); ns
Salix sp.
(Salicaceae); folhas
cido 4,6-dihidroxi3-metil-2-(2oxopropionico)-benzoico
cido 2-(1-acetil-2-hidroxivinil)4,4-dihidroxi-3-metilbenzoico
4-acetil-3,4-dihidro-6,8-dihidroxi-5metilisocoumarina
4-acetil-3,4-dihidro-6,8-dihidroxi-3metoxi-5-metilisocoumarina
descarboxicitrinona
6,8-dihidroxi-4-hidroximetil-3,5dimetilisocromo-1-ona
4-acetoximetil-6,8-dihidroxi-3,5dimetilisocromo-1-ona
4-acetil-6,8-dihidroxi-5-metil-2benzopirano-1-ona
(+)-dihidronaftol(1,2-b)-furano-5,6dicarboxilico anidrido
acetona aduto com atronetinona
bactericida fraco
bactericida fraco
bactericida fraco
bactericida fraco
antifngico

Microrganismo
Streptomyces aureofaciens
CMUAc130
(Streptomycetaceae)
Hospedeiro
(tecido vegetal)
Zingiber officinale
Roscoe (Zingiberaceae);
razes
Produto Natural
5,7-dimetoxi-4-fenilcoumarina
5,6-dimetoxi-4-(p-metoxi- fenil) coumarina
Vanilina
Streptomyces griseus subsp.

(strain HKI0412)
(Streptomycetaceae)
Kandelia candel (L.)

Druce (Rhizophoraceae)
[Mangrove]; tronco
Streptomyces sp. NRRL 30562

(Streptomycetaceae)
Streptomyces sp. NRRL 30566
(Streptomycetaceae)
Kennedia nigricans
Lindley (Fabaceae); stem
GreVillea pteridifolia J.
Knight (Proteaceae);
tronco
Monstera sp. (Araceae);
tronco
sementes de arvore de
mangue no identificada
Streptomyces sp. MSU-2110

(Streptomycetaceae)
Xylaria sp.
No. 2508
(Xylariaceae)
Fungo no identificado CR115
(90% similar a no caracterizado
nas razes Basidiomycete)
Daphnopsis americana
(Miller) J. S. Johnson
(Thymelaeaceae); ns
Fungo no identificado No.

1893
Kandelia candel (DC)

Wight & Arn.
(Rhizophoraceae);
dropper
Fungo no identificado
SWS11I1 (DAOM 221611)
Picea glauca
(Moench) Voss.
(Pinaceae); needles
3-metoxi-4-hidroxitoluene
cido 7-(4-aminofenil)-2,4-dimetil-7- oxohept-5-enoico
cido 9-(4-aminofenil)-7-hidroxi-2,4,6trimetil-9-oxo-non-2-enoico
cido 12-(4-aminofenil)-10-hidroxi-6-(1hidroxietil)-7,9-dimetil-12- oxo-dodeca-2,4dienico
munumbacinas A-D (peptides)*
Atividade
Biolgica
antifngico
antifngico
fraco
antifngico
fraco
antifngico
antibitico
Kakadumicina A (peptide)*
antibitico
Coronamicina (peptide)*
antibitico
cido piliformico
ergosterol
3,5,6-trihidroxiergosta-7,22-diene
-glicerol monopalmitato
cido p-hidroxibenzoico
guanacastepeno A
guanacastepeno B
guanacastepeno C
guanacastepeno D
guanacastepeno E
guanacastepeno F
guanacastepeno G
guanacastepeno H
guanacastepeno I
guanacastepeno J
guanacastepeno K
guanacastepeno L
guanacastepeno M
guanacastepeno N
guanacastepeno O
lactona 1893 A
lactona 1893 B
cyclo (Phe-Gly)
cyclo (Ser-Leu)
5-(p-hidroxibenzoil)-hidantoina
vermiculina
trans-3-metildodec-cis-6-en-4-olida
trans-8-hidroxi-3-metildodec-cis-6-en-4-olida
trans-8-acetoxi-3-metildodec-cis-6-en-4-olida
trans-9-hidroxi-3- metil-8-oxo-dodec-trans-6en-4-olida
trans-8,9-dihidroxi-3- metil-dodec-cis-6-en-4olida
trans-9-hidroxi-8-oxo-3-metil-dodecan-4olida
trans-7,9-dihidroxi-3-metil-8-oxo-dodecan-4olida
trans-6-hidroximetil-3-metil-7-oxo-dodecan4-olida
7,8-11-trihidroxidrimana
cido 10,11-dihidroxifarnesoico
bactericida
bactericida

Microrganismo
Fungo no identificado SWS
2611L (DAOM 229664)
Hospedeiro
(tecido vegetal)
Picea glauca
(Moench) Voss.
(Pinaceae); needles
Produto Natural
6,7-dihidroxi-2-propil-2,4-octadien4-olida
5,6,8-trihidrox-4-(1-hidroxietil)
isocoumarina
sescandelina
sescandelina B

2524
Avicennia marina
Forssk. (Acanthaceae);
sementes (Mangue)

2533
Avicennia marina
Forssk. (Acanthaceae);
folhas novas

2534
Kandelia candel (L.)

Druce
(Rhizophoraceae);
Fungo no identificado E-3
Prumnopitys andina
(Endl.) Laubenf.
(Podocarpaceae);
floema
4-hidroxi-2-metoxiacetanilida
(3S,4R)-dihidroxi-(6S)- undecil-piranona
cyclo-(L-Phe-L-Leu1-L-Leu2 LLeu3-L-Ile)
vermopirona
avicenina A
avicenina B
5-decloroavicenina A
6,7-dimetil-8-hidrox-3metilisocoumarina
ergosterol
5,8-epidioxiergosterol
3,8,6-trihidroxiergosta-7,22dieno
cyclo-(Phe-Phe)
cyclo-(Leu-Tyr)
guanidina
4-hidroxi-2-metoxiacetofenona
cido protocatecuico metil ester
meleina
Atividade Biolgica
txico cultura de
clulas de CF-1 praga
mariposa
fracamente txico
cultura de clulas de
CF-1 praga mariposa
fracamente txico
CF-1 praga mariposa
fracamente txico
CF-1 praga mariposa
no citotxico
no citotxico
bactericida ; antiviral;
fitotxico
p-hidroxibenzaldeido
4-(2-hidroxetil)fenol
Fonte: GUNATILAKA, A. A. L. Natural products from plant-associated microorganisms: distribution, structural diversity,
bioactivity, and implications of their occurrence. Journal of Natural Products, v. 69, n. 3, p. 509-526, Nov. 2006.
1.4 - A Espcie Vegetal Michelia champaca (Magnoliaceae) Planta Extica.

A famlia Magnoliaceae compreende cerca de 10 gneros encontrados na sia (ndia,
Malsia) e Amrica do Sul (Brasil) sendo que a maioria ocorre no hemisfrio Norte. No Brasil
so cultivadas vrias espcies dos gneros Magnlia e Michelia (popularmente conhecida
como magnlia amarela). O gnero nativo do Brasil o Talauma, com seu fruto seco muito
caracterstico, que floresce no Sul do Brasil durante a primavera (JOLY, 1975).
Michelia champaca uma rvore sempre verde e a madeira obtida da rvore adulta
macia, forte e muito durvel, com uma densidade de 706,0 Kg/m3. So fceis de trabalhar,
sendo usadas para a fabricao de mveis, madeira compensada, navios, artigos decorativos,
na construo civil, etc. (NOATAY, 2007).
Medicinalmente eram empregadas em Java, como tnico, estimulante, diurtico e
febrfugo. O ch das razes e das folhas usado para provocar a menstruao e no combate s
infeces da garganta, respectivamente. A casca, aps a decoco, possui propriedades
digestivas e o leo essencial das sementes empregado em frico, contra as dores articulares
e os reumatismos (PIO CORRA, 1974). O extrato da casca da raiz de M. champaca
mostrou-se um potente inseticida frente larva do Aedes egyptii (JACOBSSON, et al., 1995).
Figura 2: Foto de Michelia Champaca L. (Magnoliaceae) Fonte: Ioanis H. Leptokarydis
1.5 O Fungo Colletotrichum gloeosporioides Isolado de Michelia champaca

1.5.1 O Gnero Colletotrichum
O gnero Colletotrichum membro da subdiviso Deuteromycotinia da ordem das
Melanconidiales e se caracterizam pela formao de estruturas denominadas acrvulos, em
forma de disco achatado, subepidrmico, com espinhos ou setas, conidiforos simples e
alongados, condios hialinos unicelulares, geralmente em forma de bastonete, que
permanecem nos acrvulos aderidos por uma massa mucilaginosa de polissacardeos, solveis
em gua. Apesar destes esporos no serem estruturas de resistncia, os miclios do fungo

podem permanecer viveis por longo perodo de tempo, em sementes, restos culturais, ou em
infeces latentes em frutos. As espcies anamrficas do gnero Colletotrichum (teleomorph,
Glomerella) geralmente so as responsveis pela doena antracnose formando leses
neurticas ovais em frutas. As vrias espcies de Colletotrichum incluem as mais
devastadoras pragas patognicas infectando plantas como cereais, frutas, legumes, etc. Estas
tm crescimento rpido em meio de cultura Batata Dextrose Agar (BDA), formando colnias
concntricas, de colorao verde-oliva marrom, podendo ocorrer formao ou no de
setores (GARCIA-PAJN; COLLADO, 2003).
1.5.1.1 O Fungo Colletotrichum gloeosporioides
O Fungo Colletotrichum gloeosporioides, uma espcie, pertencente ordem
Melanconiales da classe Coelomycetes, cuja fase perfeita classificada com estirpes
homotlicas ou heterotlicas de ascomicetos do gnero Glomerella sp.. Os fungos deste
gnero, juntamente com sua fase perfeita, so considerados os maiores patgenos de plantas
em todo o mundo. A antracnose se constitui um dos mais srios problemas do maracujazeiro
amarelo (Passiflora edulis Simmonds f. flavicarpa). Essa doena tem como agente causal o
fungo Colletotrichum gloeosporioides (GARCIA-PAJN; COLLADO, 2002).
C. gloeosporioides possui uma ampla gama de hospedeiros infectando goiabeira,
mangueira, mamoeiro, cajueiro, jaqueira, certas anonceas, como pinha, biriba, cherimia,
condessa, frutferas do grupo da Spondia como cajazeira, cajarana, seriguela, umbu, e
emboquela (MENEZES, 2002 & SANTOS FILHO, SANTOS, 2003).
muito bem conhecido que Colletotrichum gloeosporioides uma espcie que produz
metablitos fitotxicos similares aos produzidos por outros do mesmo gnero. Alguns destes
metablitos (Figura 3, p. 33), que lhe conferem resistncia contra outros patgenos
(GARCIA-PAJN; COLLADO, 2003).
O
H
CO2H
HO2C
CO2H
CO2H HO2C
CO2H
N
CO2H
R1
H11C5
O
CO2H
O
HO
NH2
H CO 2 H
CH3
R2
13
1
O
O
4
5
OH
H
5 R1=H, R2=CH3
H
4
7 H
6 R1=CH3, R2=H
NH
CO
CH
CO
CO2H
8 R=
O
OMe
9 R=
HO
HO
N
O
CO2H
(CH2)3
NH2
O
O
NH
CO2H
CH2OH
3+
O
NH
O
CH
(CH2)3
CO
N
(CH2)3
NH
CO2H
10 R=
CH2
CH2
HN
CO
CH
CO
NH
16
OMe
9'
OH
1
A
HO
7 O
3'
8'
19
8''
O
B
21
5'
17
5''
7' O
3''
17
9''
1''
OH
7'' OH
H
7
3
OH
27
OR
18 R= COCH3
19 R= COCH2C6H5
COOH
1'
3'
5'
9
5
HO
4
4'
7
20
24
13
1
28
20
N
H
Figura 3: Substncias bioativas obtidas a partir do fungo Colletotrichum gloeosporioides
26
25
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ____________________________________________2 - Objetivos
34
2 - OBJETIVOS
9 Isolar, purificar, identificar e preservar os fungos associados espcie vegetal

Michelia champaca (Magnoliaceae);
9 Isolar, determinar e/ou identificar os metablitos secundrios;
9 Busca de substncias com atividade biolgica frente s linhagens mutantes de
Saccharomyces cerevisiae, fungos fitopatognicos Cladosporium cladosporioides e C.
sphaerospermum e atividade inibidora da acetilcolinesterase;
9 Realizar o isolamento, elucidao e identificao estrutural dos metablitos
secundrios atravs de tcnicas cromatogrficas e espectromtricas;
9 Verificar a co-produo de metablitos secundrios;
9 Avaliar as substncias puras frente aos fungos fitopatognicos Cladosporium
cladosporioides e C. sphaerospermum e atividade inibidora da acetilcolinesterase;
9 Realizar a variao metablica cultivando o fungo Mc-8R em diferentes meios de
cultura e condies;
9 Contribuir para o estudo quimiotaxonmico de fungos endofticos e verificar a
simbiose dos fungos endofticos com a espcie vegetal (Michelia champaca).
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ___________________________3 Desenvolvimento Experimental 35
3 - DESENVOLVIMENTO EXPERIMENTAL
3.1 - Especificao dos Materiais, Instrumentos e Tcnicas Utilizadas.
3.1.1 - Solventes Utilizados:
Foram utilizados solventes Pa. e CLAE dos fabricantes JT. Backer p., Mallinckrodt e
Synth. Nos experimentos de RMN, foram utilizados os solventes deuterados CDCl3 e DMSOd6 produzidos por Merck, Aldrich e Fluka.
3.1.2 - Evaporador Rotatrio:
As solues foram concentradas em evaporador rotatrio sob presso reduzida do
fabricante Buchi.
3.1.3 - Cromatografia Lquida de Alta Eficincia:
As anlises cromatogrficas foram obtidas por cromatografia lquida de alta eficincia
(CLAE) em aparelhos:
Varian Pro Star (Solvent Delivery Module 240 e Auto Sampler 410) acoplado ao
detector Varian Pro Star Photodiode Array Ultra-violet (PDA-UV) 330 e registrados em
microcomputador de 500 MHz com processador Pentium II, utilizando o software Varian Star
Cromatography Workstation verso 5.52 Modo analtico em gradiente exploratrio.
Varian Pro Star (Solvent Delivery Module SDM 230) acoplado ao detector Varian
Pro Star UV/Vis 310 e registrados em microcomputador de 500 MHz com processador
Pentium II, utilizando o software Varian Star Cromatography Workstation verso 5.52
Modo analtico em modo isocrtico.
Shimadzu (bomba Shimadzu LC-10 AD, auto injetor Shimadzu SIL 10 A) acoplado
ao detector ultravioleta em arranjo de diodos Shimadzu SPD MX AVP e registrados em
microcomputador de 500 MHz com processador Pentium II, utilizando o software Shimadzu
CLASS-LC10 verso 1.64A Modo analtico e/ou gradiente exploratrio.
Varian Pro Star (Solvent Delivery Module SDM SD-1) acoplado ao detector Varian
Pro Star UV/Vis 320 e registrados em microcomputador de 500 MHz com processador
Pentium II, utilizando o software Varian Star Cromatography Workstation verso 5.52 em
modo preparativo.
Foram utilizadas colunas analticas Phenomenex tipo LUNA (C18 e Fenil-Hexil, 250 x
4,6 mm, 5 m) e coluna preparativa Phenomenex tipo LUNA (C18 e Fenil-Hexil, 250 x 21,20
mm, 10 m).
3.1.4 - Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC):
Nas anlises por CCDC foram utilizadas placas pr-prontas de slica gel da marca
Sorbent Technologies (TLC Plates W/UV 254, Aluminium backed, 200 m 20 x 20 cm)
recortadas em pedaos de 5 x 5 cm. Foram tambm utilizadas placas de vidro preparadas com
slica gel 60G. As placas foram feitas aplicando-se uma suspenso de slica em gua destilada,
na proporo 1:2 (m/v), sobre placa de vidro de 5, 10 e 20 x 20 cm, obtendo-se 0,25 mm de
espessura para placas comparativas e 0,75 mm de espessura para as placas de preparativas,
atravs da utilizao de espalhador Quickfitt. Aps a preparao das placas, estas foram
deixadas em repouso por cerca de 6 horas temperatura ambiente, posteriormente sendo
ativadas em estufa a 120 oC por 120 minutos. As visualizaes foram por radiao na regio
do ultravioleta nos 254 e 366 nm os cromatogramas foram obtidos por nebulizao com
anisaldedo seguida de aquecimento ou exposio a iodo sublimado.
3.1.5 - Cromatografia em Coluna:
Nas separaes cromatogrficas em coluna aberta ou sob presso se utilizou como
fases estacionrias slica gel de fase reversa C18 (Merck) e slica gel de fase normal (Acros
com dimetro de partcula de 0,035-0,070 mm).
3.1.6 - Ressonncia Magntica Nuclear:

Os espectros de Ressonncia Magntica Nuclear de 1H,
13
C e experimentos uni e
bidimensionais foram obtidos em espectrmetro Varian AS 500 - OXFORD operando com

campo magntico de 11,7 T, utilizando TMS como referncia interna.
3.1.7 - Espectrometria de Massas (EM):
Os espectros de massas foram obtidos em espectrmetro de massas de alta resoluo
utilizando as tcnicas EI e ESI (+ e/ou -).
Modelo: ultrOTOFQ - ESI-TOF Mass Spectrometer
Fabricante: Bruker Daltonics, Billerica, MA, EUA.
Preparao e condies do experimento:
Solubilizao da amostra em: MeOH, MeOH/H2O ou CHCl3 com ou sem a adio de 0,1% de
cido actico
Injeo da Amostra: Bomba de Infuso, Fluxo 100l/h
Condies de operao:
End Plate: 4000 Volts
Capillary: 4500 Volts
Capillary Exit: 300 Volts
Skimmer 1: 55 Volts
Skimmer 2: 25 Volts
Dry Gas Temp 150C
Dry Gas Flow 4 L/min
Neb Gas Pressure 2 Bar
Calibrao quando utilizado em alta resoluo: usa-se para calibrao interna uma
soluo de NA-TFA a 10mg/ml e na calibrao externa uma soluo de Formiato de Sdio, a
10 mM.
3.1.8 Ensaio Bioautogrfico:

O ensaio para avaliao do potencial antifngico foi realizado com os fungos
Cladosporium sphaerospermum e Cladosporium cladosporioides. Foram utilizadas placas de
CCDC da Merck TLC Slica Gel 60 F 254. Para a preparao da soluo estoque utilizou-se:
quantidades especificadas de glicose. A soluo foi autoclavada a 120 oC, por 20 minutos
(HAMBURGER; HOSTETTMANN, 1991).
3.1.9 - Bioensaio com Saccharomyces cerevisiae:
O meio de cultura utilizado para o desenvolvimento e crescimento de Saccharomyces
cerevisiae constitui-se em 2% de peptona, 2% de dextrose e 2% de Agar (GUNATILAKA et
al., 1994). Foram utilizadas as seguintes linhagens:
Rad +: Linhagem selvagem
Rad 6: Linhagem controle
Rad 52Y: Linhagem mutante recombinante (associada com reparo na dupla hlice e
recombinao meitica)
Rad 321N: Linhagem mutante associada Topoisomerase II (enzima vital no
processo de diviso celular)
3.1.10 - Cultivo dos Fungos Endofticos em Vrios Meios de Cultura:
O meio de cultura slido BDA foi preparado com o antibitico Sulfato de Gentamicina
e acondicionado e homogeneizado em frascos tampados com pedaos de espumas com 1 cm
de espessura amarradas com elstico. Estes foram autoclavados a 121C durante 40 min., e
resfriados a 45 C em cmara assptica. O meio BDA foi depositado em placas de Petri at
formar uma camada de aproximadamente 0,5 cm, sendo posteriormente tampadas e vedadas
com filme plstico. Os meios de cultura lquidos utilizam o mesmo procedimento citado
anteriormente tendo as diferenas da no adio de antibitico e no deposio em placas de
Petri permanecendo em seus frascos originais. As concentraes utilizadas para cada meio de
cultura esto descritas na (Tabela 2: p.39). Para o cultivo dos fungos endofticos em meios
lquidos foi utilizado s incubadoras rotatrias dos fabricantes Marconi e Tecnal.
Tabela 2: Meios de cultura utilizados para os crescimentos dos fungos.
Meio de
C
Tipo
Composio
Especificao
cultura
g/L
Fcula de batata (4g), dextrose
Base para cultivo de leveduras
Slido
39
BDA
(20g), agar (15g)
e fungos
Caldo de Fcula de batata (4g),
Base para cultivo de leveduras
Lquido
24
CDB
dextrose (20g)
e fungos
Base para cultivo de fungos e
Lquido
20
Extrato de malte (20g)
ME
bactrias
Extrato de levedura (3g), extrato
Base para cultivo de
Lquido
21
de malte (3g), peptona (5g),
leveduras, fungos e outros
YM
dextrose (10g)
microrganismos acidricos
Base para cultivo de
Extrato de carne (3g), peptona
microrganismos noLquido
8
Nutrient
(5g)
fastidiosos
Sacarose (30g), NaNO3 (3g),
Base para cultivo de fungos e
Lquido
35
Na2(PO4)3 (1g), MgSO4 (0,5g),
bactrias capazes de utilizar
Czapek
KCl (0,5g), FeSO4 (0,01g)
Nitrognio inorgnico
Fabricante
SIGMA
DIFCO
DIFCO
DIFCO
DIFCO
DIFCO
3.2 - Anlises Qumicas e Biolgicas

3.2.1 - Cromatografia Lquida de Alta Eficincia com Detector UV em Arranjo de
Diodos (CLAE-DAD):
Os extratos e fraes escolhidos foram submetidos a gradiente exploratrio utilizando
coluna analtica de fase reversa Fenil-Hexil ou C-18 tipo Luna da Phenomenex e eludos com
H2O/ACN ou H2O/MeOH (95:5) at (0:100) em 40 min., permanecendo 10 min. nesta
condio, com fluxo de 1,0 mL/min., utilizando ou no a adio de 0,5% de cido actico
dopando a gua, utilizando detector UV-DAD operando inicialmente a 254 nm.
Os extratos foram pr-tratados por Clean up por solubilizao em MeOH/H2O
(95:5), centrifugao, eluio em C-18 e filtrao em acrodisc 13CR PTFE 0,45m da
Gelman.
3.2.2 - Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC):
Estabelecer condies primrias de separao cromatogrfica, como etapa inicial para
o ensaio de deteco de substncias antifngicas. Para isso, empregou-se a metodologia do
tringulo de seletividade com solventes dos tipos Localizante Bsico, Localizante no Bsico,
No Localizante e Doador ou Receptor de prtons. Realizaram-se experimentos com

solventes puros, misturas binrias, ternrias e quaternrias ajustando-se a fora de eluio
com Hex. (SNYDER; KIRKLAND; GLAJCH, 1997).
3.2.3 - Critrios de Pureza:
O critrio de pureza adotado foi obteno de uma nica mancha aps anlise em
CCDC, utilizando diferentes sistemas de eluentes e, quando separado por CLAE, a obteno
de um nico pico simtrico, mesmo aps variao das condies de anlise.
3.2.4 - Ensaio para Deteco de Substncias com Atividade Antitumoral Potencial e/ou
Citotxica:
O bioensaio utilizando linhagens de Saccharomyces cerevisiae, um modelo para
avaliao do potencial antitumoral e citotxico, e se fundamenta no emprego de clulas desta
levedura (eucariticas com propriedades similares s das clulas humanas) que foram
geneticamente modificadas, para apresentarem os mesmos defeitos observados em clulas
cancergenas humanas, com a principal vantagem de serem facilmente crescidas in vitro, e
assim serem ensaiadas frente a substncias candidatas a novos frmacos anticancergenos.
Este bioensaio constitui uma importante ferramenta no estudo de produtos naturais, pois
permitem a deteco de substncias puras potencialmente antitumorais, como tambm
extratos e fraes cromatogrficas, possibilitando um estudo biomonitorado.
Para o desenvolvimento e crescimento das linhagens de Saccharomyces cerevisiae, o
meio de cultura utilizado foi levado ao aquecimento sob agitao constante at a
homogeneizao. Em seguida, o mesmo foi esterilizado em autoclave, sendo posteriormente
resfriado a 45-50 oC e transferido para placas de Petri em capela de fluxo laminar, formando
uma camada fina. Da cultura estoque de cada linhagem, preparou-se uma suspenso diluda
com gua destilada nas seguintes densidades pticas, lidas a 600 nm: Rad 52Y (0,05-0,1),
Rad+ (0,05) e Rad 321 (0,05 a 0,1). Solues destas linhagens foram adicionadas sobre as
placas contendo os meios de cultura, de modo a cobri-los. Aps a retirada do excesso e

secagem das placas foram feitos poos sobre sua superfcie (6 mm de dimetro) atravs de um
tubo conectado a uma bomba de vcuo.
Todos os extratos foram avaliados na concentrao de 2mg/mL, utilizando-se como
veculo soluo de DMSO:MeOH (50:50) e aplicados cerca de 100 L dentro dos poos do
meio de cultura para cada linhagem e posteriormente incubados por 48 horas. So utilizados
como substncias referncias: Camptotecina (4 e 5 g/mL) respectivamente para RAD+ e
52Y; estreptonigrina (200 g/mL) para 321N.
Os resultados preliminares obtidos atravs
do ensaio so relatados como halos de inibio do crescimento das linhagens. Resultados mais
elaborados (para substncias j isoladas) so expressos como valores de IC12, que a
concentrao (em g/mL) requerida para produzir uma zona de inibio de 12 mm de
dimetro ao redor do ponto de aplicao da amostra (halo considerado mnimo para a
atividade antitumoral).
Um extrato considerado ativo como um potencial antitumoral, se apresentar
atividade seletiva frente uma ou mais linhagens mutantes (IC12 menor que 1/3 do IC12 de
Rad+) e tambm ter IC12 menor que 2.000 g/mL. Se o halo de inibio das linhagens for
maior que 12 mm, porm no obedecer estas condies, este indica ser citotxico.
(GUNATILAKA, et al., 1994).
3.2.5 - Ensaio para Avaliao da Atividade Antifngica Atravs de Bioautografia:
A bioautografia consiste da associao entre a cromatografia em camada delgada e um
ensaio biolgico in situ (HAMBURGER; HOSTETTMANN, 1991), possibilitando
localizar constituintes biologicamente ativos presentes em uma matriz complexa ou indicar o
potencial biolgico de substncias puras.
O mtodo fundamenta-se na capacidade de inibio do crescimento do

microrganismo aplicado sobre um cromatograma e incubao deste visando o aparecimento
de possveis zonas de inibio por constituintes ativos (HOMANS; FUCHS, 1970).
Todos os extratos dos endofticos foram submetidos a este bioensaio, sendo
aplicados (em duplicatas) na concentrao 2,0 mg/mL em placas cromatogrficas pr-prontas,
utilizando 400 ug para extrato bruto; 200 ug para frao e 100 ug para subfrao e substncia
pura, posteriormente eludos empregando-se um sistema de solventes pr-estabelecido,
temperatura de ~ 30oC.
Aps a evaporao dos solventes e localizao das manchas (substncias) por meio
de absoro no UV, nebulizou-se as placas cromatogrficas com uma suspenso de esporos
dos fungos Cladosporium sphaerospermum e Cladosporium cladosporioides em um meio
preparado no ato da aplicao do ensaio (10 mL de soluo aquosa de glicose a 30% e 60 mL
da soluo estoque do fungo). Aps nebulizao, procedeu-se a incubao das placas em
atmosfera mida por 2 a 3 dias a 25 oC. O aparecimento de zonas de inibio indicaram a
presena de substncias com potencial antifngico.
3.2.6 - Ensaio Preliminar para a Deteco de Inibidores da Enzima Acetilcolinesterase:
A inibio da AChE possvel seguindo-se a metodologia de Marston; Kissling;
Hostettmann, (2002) para cromatografia em camada delgada fina. Neste ensaio o extrato foi
dissolvido em metanol (80 mg/mL). Uma amostra de 200 g (2,5 L) do extrato foi analisada
em CCDC de slica gel 60 F254 (0,2 mm, MERCK).
Como controles positivos foram utilizados galantamina (1 g) e fisostigmina (0,3
g), dissolvidos em metanol. Foi utilizado como eluente CHCl3:MeOH (90:10). Aps o
desenvolvimento da cromatografia, a placa foi borrifada com a soluo da enzima
acetilcolinesterase (Soluo A) seguida da evaporao do solvente.
A placa cromatogrfica foi incubada em uma cmara mida a 37 C por 20 minutos,

e em seguida borrifada com a soluo D.
A colorao roxa aparece em aproximadamente 2 minutos. O aparecimento de
mancha branca (indicao de inibio da reao enzimtica), sobre um fundo de colorao
roxa indica que houve inibio da atividade da enzima acetilcolinesterase. Os resultados so
observados e fotografados em cmera fotogrfica Epson e os valores de rf calculados onde
houver inibio da reao.
Soluo A: Acetilcolinesterase (1000 U, Sigma, produto no C2880) dissolvida em
150 mL do tampo Tris-HCl (0,05 M; pH = 7,9), a soluo estoque foi armazenada a 4 C, no
momento do uso adicionado 0,1% de albumina de soro bovino frao V;
Soluo B: 250 mg de 1-naftil acetato em 100 mL de etanol;
Soluo C: 400 mg do sal Fast Blue B em 160 mL de gua destilada;
Soluo D: mistura de 10 mL da soluo B + 40 mL da soluo C.
Todos os ensaios foram realizados no Instituto Botnico de So Paulo seo de
Fisiologia Vegetal, sob responsabilidade da Dra. Maria Cludia M. Young.
3.3 - Isolamento e Purificao dos Fungos Endofticos Associados Michelia champaca.
O material botnico coletado (caules, folhas, razes e sementes) de Michelia champaca
foi processado no prazo de 24 horas, aps a coleta. A retirada dos epifticos superficiais foi
realizada lavando o material coletado abundantemente com gua corrente e detergente neutro.
Em cmara assptica, o material foi imerso em lcool 70% por 1 minuto, em hipoclorito 1%
por 5 minutos e novamente em lcool 70% por 1 minuto. Realizou-se ento uma dupla
lavagem em gua destilada estril (1 minuto) da qual se retirou 5 mL para fazer o controle da
assepsia (MAIER, et al., 1997).
Os pedaos de caules, folhas, razes e sementes (esterilizados), foram seccionados

assepticamente e inseridos nas placas de Petri contendo BDA preparado com sulfato de
gentamicina e incubados durante 10 dias a 25 C. O crescimento dos fungos foi monitorado
at que suas hifas atingissem aproximadamente 2-3 cm de dimetro, em seguida as culturas
foram repicadas e replaqueadas sucessivamente at a obteno de linhagens puras avaliadas
atravs da aparncia uniforme nas placas, sendo posteriormente preservadas em gua estril.
Os rgos vegetais de M. champaca possibilitaram o isolamento de 8 fungos endofticos
sendo todos codificados com Mc de Michelia champaca em seguida organizados por ordem
alfabtica sendo os 3 fungos dos caules numerados de 1 a 3 (Mc-1C, Mc-2C e Mc-3C), 4 das
folhas sendo numerados de 4 a 7 (Mc-4F, Mc-5F, Mc-6F e Mc-7F) e 1 das razes sendo o 8
(Mc-8R). Nenhum fungo foi isolado das sementes (Esquema 1, p. 44).
Michelia
champaca
Folhas, caules, razes

e sementes
Esterilizao (NaOCl 1%, EtOH 70%)
Limpeza (H2O destilada esterilizada)
Isolamento dos endofticos (BDA)
8 Linhagens
Isoladas
Replaqueamento em (BDA)
Purificao
Linhagens
Puras
Preservao
H2O estril
MC-1C
MC-2C
MC-3C
MC-4F
MC-5F
MC-6F
Esquema 1: Isolamento dos fungos associados
MC-7F
MC-8R
3.3.1 Identificao dos Fungos Isolados de Michelia champaca.

Dos 8 endofticos isolados de Michelia champaca, as linhagens Mc-3C, Mc-6F e Mc7C foram identificadas como sendo Xylaria sp., Phomopis stipata e Colletotrichum
gloeosporioides. A identificao foi realizada pelo Prof. Dr. Ludwig H. Pfenning do
Departamento de Fitopatologia da Universidade Federal de Lavras - MG.
3.4 - Cultivo dos Microrganismos e Obteno dos Extratos.
O cultivo das cepas foi realizado em meio slido BDA conforme procedimento citado
no item 3.1.10; p. 38 e incubadas a 25 C at que suas hifas atingissem 2 a 3 cm de
crescimento. Estas foram inoculadas em dois frascos de 500 mL contendo 250 mL cada do
meio lquido CDB, e incubadas em mesa agitadora orbital (shaker) sob temperatura de 25C
por 28 dias.
Ao trmino do processo de fermentao, a fase aquosa foi separada dos miclios por
filtrao sob presso reduzida e particionados com AcOEt, (3X 300 ml) fornecendo os
extratos, aps evaporao do solvente (Esquema 2, p. 46). Este mesmo procedimento foi
aplicado para crescimento nos meios de cultura: Czapek, Nutriente, YM, Extrato de Malte.
3.4.1 - Triagem Qumica a e Biolgica dos Extratos dos Fungos Associados Michelia
champaca.
Os extratos obtidos dos fungos isolados foram enviados para avaliao da atividade
antifngica frente aos fungos fitopatognicos Cladosporium sphaerospermum e C.
cladosporioides, ensaios antitumoral e de citotoxidade frente s linhagens mutantes de
Saccharomyces cerevisiae e inibio da enzima acetilcolinesterase.
Todos os extratos obtidos foram submetidos anlise espectromtrica de RMN 1H
(Figura 43-Figura 50; pgs. 121-124) (Esquema 2, p. 46).
MC-1C
15,6 mg
MC-2C
7,3 mg
MC-3C
91,3 mg
MC-5F
8,7 mg
MC-4F
5,2 mg
MC-6F
30,5 mg
MC-7F
15,0 mg
MC-8R
48,5 mg
Crescimento (500 mL CDB, 28 dias)

Filtrao a presso reduzida
Miclios
Filtrados
Partio lq/lq AcOEt (3x300 mL)
Evaporao do solvente
Extratos
Brutos
Bioensaios
RMN 1 H
Esquema 2: Cultivo dos fungos, obteno dos extratos e triagem qumico/biolgica
3.5 Cultivo com CDB em Larga Escala do Fungo Endoftico Mc-8R com CDB.
O fungo Mc-8R foi cultivado em 10 L CDB divididos em 40 frascos de 500 mL
contendo 250 mL em cada frasco, de acordo com os procedimentos citados no item 3.4; p. 45,
obtendo-se 3,82 g de extrato, (Esquema 3, p. 46).
Mc-8R
Crescimento (10,0 L (CDB), 28 dias,
Agitao Orbital, Filtrao
Miclio
Filtrado
Triturao com 1,0L de gua

Filtrao
Partio (3 X 2,0L AcOEt)

Evaporao do
solvente
Miclio
Fase Aquosa
Descarte
Extrao com
EtOH 1,0L (5X)
Filtrao
Extrato EtOH
Miclio
Evaporao
do solvente
Extrato EtOH
Miclio 5,0 g
Extrato AcOEt
3,82g
Frao Aquosa
Evaporao do
solvente
Extrato aquoso
5,0g
Extrao
MeOH/H2O (95:5)
ppt, Filtrao
Miclio
Secagem
Miclio seco
25,0g
Esquema 3: Extrato Produzido por Mc-8R em CDB
Evaporao do
solvente
Extrato
MeOH/H2O
1,5g
Evaporao do
solvente
Goma 2,5 g
3.5.1 Variao Metablica de Mc-8R em CDB na Presena de XAD 2

Utilizando o procedimento citado no item 3.4; p. 45 o isolado Mc-8R foi cultivado na
presena de XAD 2 em 500 mL de CDB contendo 50 g de XAD 2 solto e em 500 mL de CDB
contendo 10 cartuchos de tecido sinttico preenchidos com 5,0 g de XAD 2. No termino do
perodo da fermentao, o frasco contendo XAD 2 solto foi submetido filtrao. A frao
aquosa foi descartada ao XAD 2 impregnado com o miclio foi adicionado 500 mL gua,
ocorrendo a decantao parcial do XAD 2 e flotao do miclio. Este foi retirado
cuidadosamente com uma esptula cncava. O frasco com XAD 2 Saco foi submetido
raspagem do miclio aderido. Ambos, separadamente foram extrados com AcOEt (3 x 300
mL). Aps a evaporao do solvente obteve-se os extratos Mc-8R XAD Saco (436,7 mg) e
Mc-8R XAD Solto (105,9 mg). Estes extratos foram analisados por CLAE, de acordo com o
procedimento citado no item 3.2.2. p. 39 utilizando como fase estacionria C-18, adicionando
0,5% HOAc a gua (Esquema 4, p. 47, Figura 4:, p. 48).
Linhagem fngica
Mc-8R
Inoculao em 500 mL
(CDB) 28 dias + 50g
XAD 2 Solto
Filtrao
Filtrado
Descarte
Inoculao em 400 mL
(CDB) 28 dias + 10 sacos
com 5 g de XAD 2 cada
Raspagem Miclio
Miclio +
XAD 2
Flotao
XAD 2
Solto
Miclio
Descarte
Extrao (3X 300 ml AcOEt)

Extrato Bruto
Mc-8R XAD Solto
105,9mg
Sacos
com XAD 2
Filtrado
Descarte
Extrao (3X 300 ml AcOEt)

Extrato Bruto
Mc-8R XAD Saco
436,7mg
Esquema 4: Extrato Produzido por Mc-8R em CDB na Presena de XAD 2
XAD Solto
XAD Saco
Figura 4: Cromatogramas em grad. explorat. das fraes Mc-8R XAD Solto e XAD Saco (H2O0,5% HOAc/MeOH;
95:5 a 0:100 em 40, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm) em C-18.
3.5.2 Variao Metablica de Mc-8R em Diferentes Meios de Cultura.

Os extratos produzidos por Mc-8R quando cultivado em Czapek, Nutriente, YM e
Extrato de Malte foram obtidos de acordo com o procedimento citado no item 3.4; p. 45
(Esquema 5, p. 49).
Estes extratos foram analisados por CLAE, utilizando como fase estacionria slica de
fase reversa C-18, de acordo com o procedimento citado no item 3.2.2, p. 39 adicionando
0,5% HOAc a gua (Figura 51-Figura 57, pgs. 125-128) e experimentos de RMN 1H
(Figura 52-Figura 58, pgs. 125-128).
Mc-8R
Crescimento separado em frascos com
Czapeck, Nutriente, YM, Extrato de Malte
(28 dias, 25 C, agitador orbital 500 mL
cada), Filtrao
Miclio
Descarte
Filtrados
separadamente
Partio (3 X 200 mL AcOEt)
Frao aquosa
Descarte
Frao
AcOEt
Evaporao
do solvente
Extrato Bruto
Mc-8R
Czapeck 25,3 mg
Extrato Bruto
Mc-8R
Nutriente 13,4 mg
Extrato Bruto
Mc-8R
YM 30,4 mg
Extrato Bruto
Mc-8R
Extrato de Malte 148,8 mg
Esquema 5: Extratos obtidos em Mc-8R em Czapek, Nutriente, YM e Extrato de Malte
3.5.3 Variao Metablica Triagem dos Extratos para Estudo de Mc-8R em Arroz e
Milho
Para o cultivo do endoftico em cereais, foram utilizados 90 g de arroz parboilizado
(Tio Joo) e 90 de milho de canjica descascado (Yoki) colocados em quatro frascos de 500
mL contendo 90 mL de gua destilada cada.
Estes meios foram autoclavados quatro vezes de 12 em 12 horas por 40 minutos
temperatura de 121 oC. Aps as primeiras 24 horas foram adicionados mais 20 mL de gua
deionizada em cada frasco, dando seqncia a autoclavagem. Aps o termino do processo de
altoclavagem o fungo foi inoculado nos meios de cultura e foram incubados por 21 dias
temperatura ambiente (cultura esttica). Aps este perodo procedeu-se a extrao dos cereais
com metanol por triturao em liquidificador, seguida de filtrao a presso reduzida.
A massa triturada foi novamente extrada com MeOH (3x500 mL). Aps a evaporao
do solvente forneceram 1,86 g e 1,90 g de extrato de Arroz e Milho, respectivamente
(Esquema 6, p. 51).
Ambos os extratos foram solubilizados em ACN (1L) e particionados com Hexano
(3x300 mL) separadamente. Aps a evaporao dos solventes, obteve-se 1,10 g e 0,93 g de
extrato Hexnico Milho e Arroz, respectivamente e 0,81 g e 0,93 g de extrato ACN Milho e
Arroz, respectivamente (Esquema 6, p. 51). Na manipulao do extrato Mc-8R Arroz Hex.,
observou-se a formao de um precipitado que foi separado e seco fornecendo 47,5 mg, foram
realizados experimentos de RMN de 1H e
13
C onde pode-se identificar o Ergosterol
(Esquema 6, p. 51, Figura 136 e Figura 137, p. 191 e 192). Os extratos Mc-8R-ACN-Arroz
e Mc-8R-ACN-Milho foram analisados por CLAE, utilizando como fase estacionria slica de
fase reversa C-18, seguindo o mesmo procedimento citado no item 3.2.2, p. 39. Adicionandose 0,5% de HOAc a gua, (Figura 59 e Figura 61, pgs. 129 e 130) os extratos Mc-8R-HexArroz, Mc-8R-Hex-Milho e Mc-8R-Hex-Arroz-ppt (Ergosterol) foram analisados em CCDC
(Figura 65, p. 131). Os extratos Mc-8R-ACN-Arroz, Mc-8R-ACN-Milho, Mc-8R-Hex-Arroz
e Mc-8R-Hex-Milho foram submetidos a experimentos de RMN de 1H (Figura 60 - Figura
64, pgs. 129-131).
Mc-8R
Crescimento, 21 dias, 90g Cereal
(Milho e Arroz) + 110 g gua
Arroz
Milho
Triturao com MeOH, Filtrao

Extrao 3 X do triturado c/ MeOH
Filtrao
Triturao com MeOH, Filtrao

Extrao 3 X do triturado c/ MeOH
Filtrao
Triturado
Descarte
Frao
MeOH
Triturado
Descarte
Frao
MeOH
Extrato Bruto
Mc-8R Arroz
MeOH 1,91g
Extrato Bruto
Mc-8R Milho
MeOH 1,90 g
Partio Hex/ACN
Extrato Bruto
Mc-8R Milho
Hexano 1,1g
Extrato Bruto
Mc-8R Milho
ACN 0,81 g
Partio Hex/ACN
Extrato Bruto
Mc-8R Arroz
Hexano 0,93 g
Extrato Bruto
Mc-8R Arroz
ACN 0,93 g
Filtrao ppt
Arroz ppt Hex
47,5 mg
Esquema 6: Extratos Obtidos da Variao Metablica de Mc-8R em Arroz e Milho
3.6 - Fracionamento do Extrato Mc-8R

3.6.1 - Fracionamento via CLAE do Extrato Mc-8R Obtido em CDB
Nesta etapa do trabalho foram testadas em CLAE, duas condies de eluio:
H2O/MeOH, com e sem a dopagem de 0,5% de HAc na gua em Fenil-hexil utilizando
gradiente exploratrio seguindo o mesmo procedimento citado no item 3.2.2, p. 39 e de
deteco em 254 e 319 nm (Figura 5, p. 52). Posteriormente parte do extrato de Mc-8R (0,32
g) foi submetida a clean up e analisado em CLAE. Em que otimizou-se a separao
cromatogrfica do extrato foi em sistema de eluio isocrtico H2O0,5%HOAc/MeOH (65:35) a
319 nm com fluxo de 1 ml/min.
= 254 nm
18.864
m AU
500
Mc-8R sem cido actico 0,5 %
400
30.731
30.195
31.205
25.803
26.549
10.803
100
9.579
1.917
200
13.728
300
33.747
31.600
24.872
30.117
50
25
= 319 nm
28.896
22.603
Mc-8R com cido actico 0,5 %
34.312
34.600
34.904
32.256
m AU
32.768
33.056
31.600
31.885
28.896
16.445
250
26.179
19.355
500
30.120
24.872
Mc-8R com cido actico 0,5 %
750
= 254 nm
22.605
m AU
-2 5
5
10
15
20
25
30
35
M i n u te s
Figura 5: Cromatogramas em grad. explorat. do extrato Mc-8R (H2O/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40 em C-18
O extrato AcOEt Mc-8R foi submetido anlise em CLAE analtico acertando a sua
melhor condio utilizando sistema de eluio isocrtico H2O0,5%HOAc/MeOH (65:35) a 320
nm, em coluna Fenil-hexil (Esquema 7, p. 53).
Esta condio foi transportada para CLAE preparativo em Fenil-Hexil com fluxo de
20 mL/min., resultando em oito fraes codificadas Pa1-Pa8. A frao Pa2 apresentou pureza
analtica suficiente para realizao de experimentos de RMN possibilitando a identificao do
cido Pirenochatico C (4) (Esquema 7, p. 53). As fraes Pa.3, 4 e 5 por apresentarem perfil
cromatogrfico semelhante foram reunidas e submetidas a fracionamento via CLAE
preparativa nas mesmas condies utilizadas para purificao do extrato citado no pargrafo
anterior, resultando no isolamento da citreopirona (1). As fraes Pa.6, 7 e 8 tambm foram
reunidas e submetidas CLAE preparativo nas mesmas condies citadas anteriormente,
resultando no isolamento da Pirenocina E (2) (Esquema 7, p. 53).
As substncias isoladas tiveram suas estruturas elucidadas atravs de tcnicas
espectromtricas RMN de 1H, 13C, gHMQC, gHMBC, gCOSY, NOESY 1D e EM.
Mc-8R
320,0 mg
Sol. H2O/MeOH (5:95) clean up C-18
CLAEprep. Phenyl-hexil, H2O0,5%HAc/MeOH (65:35)
Fluxo de 20ml/min a 319 nm
Pa 1
11,2mg
Pa 3
19,9mg
Pa 2
60,0mg
cido
Pirenochatico C 4
Pa 5
9,5mg
Pa 7
5,8mg
Pa 6
19,0mg
Pa 4
8,6mg
Pa 3
Pa 8
76,2mg
Pa 6
CLAE prep.
MeOH/H2O0,5%, (65:35)
Fluxo 20ml/min
319 nm
CLAE prep.
MeOH/H2O0,5%, (65:35)
Fluxo 20ml/min
319 nm
P5
9,6mg
Pirenocina E 2
P 4.1
5,5mg
Citreopirona A 1
Esquema 7: Separao Cromatogrfica do Extrato de Mc-8R obtido no crescimento em CDB via CLAE.
3.6.2 Fracionamento do Extrato Mc-8R XAD Saco via CLAE.

O extrato Mc-8R XAD Saco foi submetido a fracionamento via CLAE preparativo
utilizando sistema de eluio isocrtico H2O0,5%HOAc/MeOH (65:35) a 320 nm, em coluna C18 (Esquema 8, p. 53). As fraes isoladas foram analisadas por experimentos de RMN de
1
H e 13C, possibilitando a identificao das Pirenocinas A (1), B (3) e E (2).

Extrato Bruto
Mc-8R XAD Saco
436,7mg
CLAEpre p. C-18- MeOH/H2O0,5%HA c (35:65)
Fluxo de 20ml/min a 320 nm
XAD Saco 1
28,5 mg
Mistura (3)+(1)
XAD Saco 2
63,0 mg
Mistura (3)+(2)+(1)
XAD Saco 3
10,1 mg
Mistura (2)+(1)
Esquema 8: Separao Cromatogrfica do Extrato Mc-8R XAD Saco via CLAE
3.6.3 - Fracionamento via CC do Extrato Mc-8R Obtido em CDB

Uma parte do extrato de Mc-8R (1,6 g) foi submetida CC em fase reversa C-18 sob
presso reduzida, utilizando como eluente (H2O0,5%HOAc/MeOH 95:5 a 0:100), fornecendo 12
fraes de aproximadamente 100 mL cada, codificadas Mc-8R.1-10 e submetidas a CLAE em
gradiente exploratrio, utilizando como fase estacionria C-18, seguindo o procedimento
citado no item 3.2.2, p. 39 adicionando-se 0,5% de HOAc a H2O. (Esquema 9, p. 54).
Extrato Mc-8R
(1,6 g)
CC (C18) Gradiente
H2O0,5% HAc/MeOH 5:95 a MeOH 100%
Evaporao dos Solventes
Mc-8R1
125,0 mg
Mc-8R3
221,8 mg
Mc-8R2
217,6 mg
Mc-8R5
218,1 mg
Mc-8R4
86,8 mg
Mc-8R7
243,3 mg
Mc-8R6
46,7 mg
Mc-8R9
107,3 mg
Mc-8R8
83,5 mg
Mc-8R11
99,1 mg
Mc-8R10
22,4 mg
Mc-8R12
35,7 mg
Reunio de fraes
Mc-8R4
304,9 mg
Esquema 9: Fracionamento em coluna comatrogrfica do Extrato Mc-8R obtido no crescimento em CDB
M c-8R 1
M c-8R 2
M c-8R 3
Figura 6: Cromatogramas em grad. explorat. das fraes Mc-8R1, Mc-8R2, e Mc-8R3 obtidas do fracionamento
cromatogrfico do extrato AcOEt de Mc-8R (H2O0,5%HOAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40, com fluxo de 1,0
mL/mim. a 254 nm).
25.787
24.496
26.285
27.619
M c-8R 3
25.352
27.680
29.888
M c-8R 4
29.037
29.787
M c-8R 5
10
20
30
40
29.787
cromatogrfico do extrato AcOEt de Mc-8R (H2O0,5% HOAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40, com fluxo de 1,0
mL/mim. a 254 nm).
29.037
M c-8R 5
30.245
M c-8R 6
31.525
34.173
M c-8R 7
10
20
30
40
cromatogrfico do extrato AcOEt de Mc-8R (H2O0,5% HOAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40, com fluxo de 1,0
mL/mim. a 254 nm).
34.173
31.851
32.197
32.696
33.051
33.405
33.776
31.576
M c-8R 8
34.256
31.525
M c-8R 7
10
20
30
39.773
36.603
37.248
M c-8R 10
37.227
35.381
36.312
36.597
34.613
34.907
33.773
32.701
32.984
31.568
31.851
32.197
34.328
M c-8R 9
40
Figura 9: Cromatogramas em grad. explorat. das fraes Mc-8R7, Mc-8R8, Mc-8R9 e Mc-8R10 obtidas do
fracionamento cromatogrfico do extrato AcOEt de Mc-8R (H2O0,5% HOAc/MeOH; 95:5 a 0:100 em 40, com
fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm).
Aps a analise em CLAE as fraes Mc-8R 3, 4 e 5 foram escolhidas por

apresentarem um bom perfil cromatogrfico e foram submetidas a CCDC utilizando a
metodologia citada no item 3.2.3; p. 39. A melhor condio acertada foi: [75% Hexano + 3%
HOAc + 22% da (Sol A) = (CHCl3/ISP 90:10)] em tripla eluio.
A frao Mc-8R.3 foi fracionada em CC utilizando com fase estacionria Slica Gel
Acros, e sistema de eluente em gradiente iniciando a Hex/(Sol A)/HAc (80:17:3) a (Sol
A)/HOAc (97:3) com posterior limpeza em MeOH 100% (Esquema 10, p. 57), resultando em
20 fraes que foram analisadas em CCDC com a fase mvel, Hex/(Sol A)/HOAc (75:22:3)
sendo reunidas em 7 fraes (Mc-8R.3.1-3.7) (Esquema 10, p. 57). Destas, a frao Mc8R.3.4 (34,3 mg) foi enviada para fazer espectros de RMN, possibilitando a identificao do
cido Pirenochatico B (6).
As fraes Mc-8R.3.6 e 3.7 foram reunidas (42,5 mg) e fracionadas por CC, utilizando
com fase estacionria Slica Gel Acros e sistema de eluio Hex/(Sol A)/HOAc (60:37:3) em
gradiente at (Sol A)/HOAc (97:3) com posterior limpeza em MeOH 100% (Esquema 10, p.
57). O fracionamento resultou em 10 fraes, que foram reunidas em 6. (Esquema 10, p. 57).
Destas, a frao Mc-8R.3.6.6 apresentou
alto grau de pureza em CCDC, sendo ento
submetida a experimentos de RMN uni e bidimensionais sendo identificada como a cido

Pirenochatico Indito (7).
Mc-8R3
221,8 mg
CC Slica Gel, Gradiente Hex/(Sol A)/HAc (80:17:3)
a 97% (Sol A) + 3% HAc Evaporao do Solvente
Mc-8R3.1
26,3 mg
Mc-8R3.2
34,5 mg
Mc-8R3.3
40,7 mg
Mc-8R3.5
27,5 mg
Mc-8R3.6
11,9 mg
Mc-8R3.4
cido Pirenochatico B (6)
34,3 mg
Mc-8R3.7
30,6 mg
Reunio de Fraes
Mc-8R3.6
42,5 mg
CC Slica Gel gradiente Hex/(Sol A)/HAc (60:37:3) a

(Sol A)/HAc (97:3), Evaporao do solvente
Mc-8R3.6.1
1,3 mg
Mc-8R3.6.2
7,5 mg
Mc-8R3.6.3
9,7 mg
Mc-8R3.6.4
9,3 mg
Mc-8R3.6.5
2,5 mg
Mc-8R.3.6.6
Substncia (7)
11,9 mg
Esquema 10: Fracionamento Cromatogrfico Frao Mc-8R.3
As fraes Mc-8R4 e Mc-8R5 (Esquema 9, p. 54) foram reunidas por apresentarem

mesmo perfil cromatogrfico e renomeadas como Mc-8R.4. Foi realizado o fracionamento por
CC, utilizando com fase estacionria Slica gel Acros e sistema de eluio em Hex/(Sol
A)/HAc (85:12:3) em gradiente at (Sol A)/HOAc (97:3) com posterior limpeza em MeOH
100% (Esquema 11, p. 58). O fracionamento resultou em 35 fraes, que aps anlise por
CCDC foram reunidas em 7 e codificadas Mc-8R.4.1 a 4.7 (Esquema 11, p. 58).
Destas, a frao Mc-8R.4.3 apresentou alto grau de pureza e foi submetida a

experimentos de RMN uni e bidimensionais permitindo a identificao do cido
Pirenochatico A (5).
A frao Mc-8R4.2 foi avaliada por RMN de 1H e
13
C e aps anlise dos espectros
obtidos identificou-se a cido Pirenochatico indito (8).

Mc-8R4
304,9 mg
CC Silica Gel, Gradiente Hex/(Sol A)/3% HAc (85:12:3)
a 97% (Sol A)+ 3% HAc, Evaporao do solvente
Mc-8R4.1
7,4 mg
Mc-8R 4.3
cido Pirenochatico A (5)
111.2 mg
Mc-8R 4.2
Substncia (8)
9,4 mg mg
Mc-8R4.5
8,4 mg
Mc-8R4.4
31,0 mg
Mc-8R4.7
29,7 mg
Mc-8R4.6
14,5 mg
Esquema 11: Fracionamento Cromatogrfico de Mc-8R4
3.6.4 Purificao da Frao Mc-8R Milho Hex.

A frao Mc-8R Milho Hex (1,10 g) foi submetida a CC, utilizando com fase
estacionria Slica gel Acros e sistema de eluio em Hex/(Sol A)/HOAc (86:11:3) em
gradiente at (Sol A)/HOAc (97:3), resultando em 44 fraes, sendo reunidas por CCDC em
21 fraes e codificadas Mc-8R Milho hex.1 a 21 (Esquema 12, p. 59). Destas a frao Mc8R Milho Hex.10 (12,0 mg) apresentou alto grau de pureza e foi submetida a experimentos de
RMN uni e bidimensionais identificando do Perxido de Ergosterol (10).
Frao Mc-8R
Milho Hex
(1,1g)
CC, Slica gel Hex/(Sol A)/HAc (86:11:3)
at (Sol A)/HAc (97:3)
Evaporao do Solvente
Mc-8R Milho
Hex.1-9
4,3 mg
Mc-8R Milho
Hex.10
Perxido de
Ergosterol
(10)
12,0 mg
Mc-8R Milho
Hex.11 -21
29,5 mg
Esquema 12: Fracionamento Cromatogrfico Frao Mc-8R Milho Hex
3.7 Cultivo do Fungo Mc-7F com CDB em Larga Escala.

O fungo Colletotrichum gloeosporioides (Mc-7F) foi cultivado em 18 L de CDB
divididos em 6 frascos de 4 litros com 3 litros cada de acordo com os procedimentos citados
no item 3.4; p. 45, obteve-se 3,0 g de extrato (Esquema 13, p. 59).
Mc-7F
Colletotrichum gloeosporioides
Crescimento (18,0 L (CDB), 28 dias,
Agitao Orbital, Filtrao
Miclio Descarte
Filtrado
Partio (10X 4,0 L (AcOEt)
Extrao
AcOEt
Frao aquosa
Descarte
Extrato Mc-7F
3,0g
Esquema 13: Extrato obtido do crescimento de Colletotrichum Gloeosporioides (Mc-7F) em CDB
3.8 - Fracionamento do Extrato Mc-7F Obtido em CDB

Parte do extrato produzido pelo fungo Mc-7F, obtido em larga escala (1,60 g) foi
submetido a fracionamento cromatogrfico em CC, utilizando slica de fase reversa (C-18) e
sistema de eluentes em forma de gradiente iniciando em H2O0,5%HOAc/MeOH (95:05) at
100% MeOH sob presso reduzida obtendo-se 11 fraes que foram codificadas Mc-7F.1 a 11
(Esquema 14, p. 60). Estas foram submetidas anlise por RMN de 1H (Figura 67-Figura
87, pgs. 132-142) e CLAE, utilizando-se como fase estacionria slica de fase reversa C-18,
conforme o procedimento citado no item 3.2.2, p. 39 adicionou-se 0,5% de HOAc a gua
(Figura 66-Figura 86, pgs. 132-142). Destas as fraes Mc-7F.5 e Mc-7F.9 apresentaram
espectros de RMN de 1H de substncias puras, sendo submetidos a experimentos de RMN uni
e bidimensionais possibilitando a identificao dos derivados indlicos (18) e (19).
Extrato AcOEt
Mc-7F (1,6 g)
CC (C18) Gradiente
H2O0,5% HAc/MeOH 5:95 a MeOH 100%
Mc-7F.1
235,4 mg
Mc-7F.3
437,8 mg
Mc-7F.5
Subst (18)
70,6 mg
Mc-7F.7
48,1 mg
Mc-7F.9
Subst (19)
51,7 mg
Mc-7F.11
39,5 mg
Mc-7F.8
Mc-7F.10
Mc-7F.2
Mc-7F.4
Mc-7F.6
52,4
mg
49,3 mg
379,3 mg
49,7 mg
48,1 mg
Esquema 14: Fracionamento Cromatogrfico do Extrato Mc-7F em C-18
3.8.1 - Fracionamento em CLAE das Fraes Mc-7F.1 e Mc-7F.2

Nesta etapa do trabalho foram testadas em CLAE, quatro condies de eluio:
H2O/MeOH, H2O/ACN, com e sem 0,5%HOAc em duas fases estacionrias C-18 e FenilHexil. Destas a frao Mc-7F.1 demonstrou melhor resoluo em C-18 e a frao Mc-7F.2
demonstrou melhor resoluo em Fenil-Hexil ambas com 0,5% de HOAc misturado a gua.
As Fraes Mc-7F.1 e Mc-7F.2 tiveram otimizadas suas separaes em CLAE isocrtico, nas
condies H2O0,5%HOAc/MeOH (83:17) a 320 nm para Mc-7F.1 e (80:20) a 320 nm para Mc7F.2 ambas com fluxo de 1 ml/min. Estas condies foram transportada para CLAE
preparativo com fluxo de 20 mL/min. (Esquema 15 e Esquema 16, pgs. 61 e 61). Este
fracionamento resultou em oito fraes para Mc-7F.1 e Mc-7F.2, posteriormente analisadas
por espectros de RMN de 1H.
Frao Mc-7F.1
(235 mg)
CLAE prep..C-18 MeOH/H2O0,5% , (17:83)
Fluxo 20ml/min 320 nm
Mc-7F.1.1
Uracila (11)
16,7 mg
Mc-7F.1.5
5,0 mg
Mc-7F.1.3
5,9 mg
Mc-7F.1.2
11,9 mg
Mc-7F.1.7
Subst. (13)
53,2 mg
Mc-7F.1.8
6,8 mg
Mc-7F.1.6
Subst. (12)
28,5 mg
Mc-7F.1.4
4,8 mg
Esquema 15: Fracionamento Cromatogrfico em C-18 do Extrato Mc-7F.1
Aps analises de RMN de 1H, as fraes (Mc-7F.1.1, 1.4, 1.6, 1.7 e Mc7F.2.1, 2.2,
2.4, 2.6) foram submetidas a tcnicas espectromtricas RMN
13
C, gHMQC, gHMBC,
gCOSY, NOESY 1D e EM, sendo possvel identificar as substncias Uracila (11), ciclo-(S*Pro-S*-Tyr) (12), ciclo-(S*-Pro-S*-Val) (13), cido-(2-Amino-fenil)-actico (14), cido-(4Hidroxi-fenil)-actico (15), 4-Hidroxi-benzamida (16) e cido-(2-Hidroxi fenil)-actico (17).
Frao Mc-7F.2
(379,3 mg)
CLAE prep..C-18 MeOH/H2O 0,5% , (20:80)
Fluxo 20ml/min 320 nm
Mc-7F.2.1
Subst.(14)
16,7 mg
Mc-7F.2.3
Subst. (15)
5,9 mg
Mc-7F.2.2
Subst. (16)
11,9 mg
Mc-7F.2.5
5,0 mg
Mc-7F.2.4
Subst. (13)
4,8 mg
Mc-7F.2.7
53,2 mg
Mc-7F.2.6
Subst. (17)
28,5 mg
Mc-7F.2.8
6,8 mg
Esquema 16: Fracionamento Cromatogrfico Extrato Mc-7F.1
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. _________________________________4 Resultados e Discusses 62
4 - RESULTADOS E DISCUSSES.
4.1 Triagem Qumica e Biolgica dos Extratos dos Fungos Endofticos Isolados de
Michelia champaca.
Os extratos produzidos pelos oito fungos endofticos em CDB (Tabela 3: p. 62) foram
analisados por RMN de 1H (Figura 43-Figura 51, pgs. 121-124) (Tabela 6: p. 63) para
avaliao do perfil qumico. Foram submetidos aos ensaios de bioautografia contra os fungos
fitopatognicos Cladosporium cladosporioides e C. sphaerospermum para deteco do
potencial antifngico (Tabela 4: p. 62), com Saccharomyces cerevisiae para deteco da
atividade antitumoral (Tabela 5: p. 63), e com a enzima acetilcolinesterase para a avaliao
da atividade anticolinestersica.
Tabela 3: Rendimento dos extratos dos fungos endofticos fermentados em 500 ml de CDB
Cdigo do Fungo
Fungos Identificados
Mc-1C
Mc-2C
Mc-3C
Xylaria sp.
Mc-4F
Mc-5F
Phomopis stipata
Mc-6F
Colletotrichum gloeosporioides
Mc-7F
Mc-8R
Massa (mg)
15,6
7,2
91,3
5,2
8,7
30,5
15,0
48,5
Tabela 4: Resultados das atividades antifngicas dos extratos produzidos pelos endofticos isoldos de M.
champaca.
Bioautografia em camada delgada
Cdigo Concentrao
Cladosporium
Cladosporium
Fungo
sphaerospermum
cladosporioides
g
rf
Potencial
rf
Potencial
Mc-1C
200
0,26/ rastro
**/ *
0,28/ 0,51/ 0,6
**/ */ *
Mc-2C
200
Origem/ rastro
*/ *
Origem/rastro
*/ *
0,38/ rastro
***/ *
0,38
***
Mc-3C
200
0,42/ 0,61
*/ *
0,46/ 0,59
**/ *
Mc-4F
200
0,51/ 0,59
*/ *
0,24/ 0,51/ 0,6
*/ **/ **
Mc-5F
200
200
Origem/0,07
**/ **/ */
Mc-6F
Origem/08/0,31/0,37/0,51
**/**/**/**/**
/rastro/0.61
***
Mc-7F
200
0,66
*
Origem/ 0,62
**/ **
Origem/ 0,2/
**/ ***/
Mc-8R
200
Origem/0,17/0,49/0,59
***/***/***/***
0,48
***
Nistatina
100
***
***
*= atividade fraca **= atividade mdia ***= atividade forte
Tabela 5: Resultados obtidos no ensaio com S. cerevisiae dos extratos produzidos pelos endofticos isolados de
M. champaca.
Halo de Inibio (mm)
Extrato do fungo
Concentrao da Amostra (g/mL)
Rad+
Rad 52Y
Rad 321
Mc-1C
2000,0
Mc-2C
2000,0
Mc-3C
2000,0
Mc-4F
2000,0
Mc-5F
2000,0
Mc-6F
2000,0
15
13
Mc-7F
2000,0
13
Mc-8R
2000,0
14
Padro 1 estreptonigrina
4,0
20
Padro 2 camptotecina
200,0
19
Padro 3 camptotecina
5,0
17
-
Tabela 6: Resultados obtidos no ensaio ensaios de inibio da acetilcolinesterase para os extratos dos
endofticos isolados de M. champaca.
Extrato do fungo
rf
Concentrao (g/mL)
Mc-1C
200
Mc-2C
200
0,49/ 0,02
Mc-3C
200
0,51/ 0,39
Mc-4F
200
0,03
Mc-5F
200
0,52/ 0,02
Mc-6F
200
0,54
Mc-7F
200
0,7/ 0,47/ 0,3
Mc-8R
200
0,7/ 0,53/ 0,44
Os fungos Mc-8R e Mc-6F apresentaram forte atividade no ensaio de bioautografia e

foram submetidos novamente ao mesmo ensaio para verificao do limite de deteco
(Tabela 7: p. 64).
Os resultados observados nas Tabela 4:, Tabela 5: e Tabela 6: evidenciam a
potencialidade dos endofticos na produo de metablitos secundrios bioativos, que aliados
aos dados observados nos espectros de RMN de 1H, nos conduziram seleo dos fungos
codificados como Mc-7F e Mc-8R para crescimento em larga escala e estudo qumico/
biolgico.
Tabela 7: Resultados do limite de deteco em bioautografia dos extratos Mc-6F e Mc-8R.

Cladosporium sphaerospermum
Cladosporium cladosporioides
Concentrao
Fator de reteno
Potencial
Fator de reteno
Potencial
Mc-6F
400 ug
0,14/ 0,40/ 0,65
**/ */ **/ *
0,04/ 0,14/ 0,37
***/ ***/ **/ **
200 ug
0,14/ 0,40/ 0,65
**/ */ */ *
0,14/ 0,37
***/ */ *
100 ug
0,14/ 0,40/ 0,65
**/ */ */ *
0,14/ 0,38
**/ */ *
10 ug
Origem
*
i
1ug
I
i
Nistatina
***
***
Mc-8R
400 ug
0,18/ 0,43/ 0,63 **/ ***/ ***/ *** 0,18/ 0,32/ 0,42/ 0,49/ 0,62 **/ ***/ ***/ ***/ ***/ **
200 ug
0,18/ 0,43/ 0,63
*/ ***/ ***/ *
0,18/ 0,32/ 0,42/ 0,49/ 0,62
*/ ***/ **/ ***/ **/ *
100 ug
0,18/ 0,43/ 0,63
*/ ***/ ***/ *
0,18/ 0,32/ 0,42/ 0,49/ 0,62
*/ ***/ */ ***/ **/ *
50 ug
0,18/ 0,43/ 0,63
**/ ***/ *
0,18/ 0,32/ 0,42/ 0,49
*/ ***/ */ ***/ *
10 ug
0,18/ 0,43
*/ ***
0,18/ 0,42
***/ ***
1ug
0,18/ 0,43
*/ **
0,18/ 0,42
**/ **
Nistatina
***
***
*= atividade fraca **= atividade mdia ***= atividade forte
4.1.1 Fungos Endofticos Isolados dos Caules de Michelia champaca.

A experincia adquirida no crescimento de endofticos em larga escala, permitiu
estabelecer que a quantidade mnima de extrato produzida para cada 500 mL de meio de
cultura CDB fosse de 30 mg. Abaixo desta quantidade foi considerado um rendimento baixo e
o dobro desta quantidade considerado um rendimento alto. Estes dados em conjunto com
seus respectivos espectros de RMN de 1H permitiram fazer algumas consideraes:
Mc-1C: (15,6 mg) este fungo tem uma produo metablica baixa, mas o espectro de
RMN de 1H apresentou grande quantidade de sinais abrangendo toda regio espectral,
destacando-se sinais caractersticos de metoxilas, metilas e hidrognios aromticos (Figura
43, p. 121). O extrato produzido por este endoftico apresentou fraca atividade frente aos
fungos fitopatognicos C. sphaerospermum e C. cladosporioides (Tabela 4: p. 62), no
apresentou atividade contra as linhagens mutantes de S. cerevisiae (Tabela 5: p. 63) e de
inibio da acetilcolinesterase (Tabela 6: p. 63).
Mc-2C: (7,2 mg) No cultivo deste fungo obteve-se um rendimento muito baixo. A
anlise do espectro de RMN de 1H (Figura 44, p. 122) mostrou sinais caractersticos de
hidrognios aromticos, metilnicos, olefnicos e de metoxilas. Os ensaios biolgicos
demonstram que este fungo inativo frente Saccharomyces cerevisiae (Tabela 5: p. 63),
apresentou atividade fraca frente Cladosporium sphaerospermum e C. cladosporioides
(Tabela 4: p. 62), e inibidora da acetilcolinesterase (Tabela 6: p. 63).
Mc-3C: (91,3 mg) Este fungo apresentou um timo rendimento metablico. O espectro
de RMN de 1H (Figura 45, p. 122) mostrou a existncia de uma substncia majoritria que
aps experimentos de RMN, uni e bidimensionais, foi identificada como sendo o cido 2hexilideno-3-metilsuccnico (20) (Figura 38, p. 106). Este fungo foi classificado como
Xylaria sp. gnero j estudado pelo grupo, do qual se isolou o mesmo dicido identificado no
extrato e este dicido isolado apresentou atividade antifngica frente Cladosporium
sphaerospermum e C. cladosporioides (CAFU, et al. 2005). Esta atividade tambm foi
encontrada no extrato produzido por Mc-3C (Tabela 4: p. 62), entretanto no se observou
nenhuma atividade antitumoral frente s linhagens mutantes de Saccharomyces cerevisiae
(Tabela 5: p. 63), mas apresentou atividade inibidora da acetilcolinesterase (Tabela 6: p. 63).
4.1.2 Fungos Endofticos Isolados das Folhas de Michelia champaca.
Mc-4F: (5,2 mg) Este fungo no apresentou um bom endimento, mas uma anlise do
espectro de RMN de 1H (Figura 46, p.122) evidenciou sinais de metilas e metoxilas alifticas,
hidrognios olefnicos e carbinlicos. O extrato produzido por este fungo apresentou fraca
atividade frente C. sphaerospermum, atividade mdia frente C. cladosporioides (Tabela 4: p.
62) e nenhuma atividade contra Saccharomyces cerevisiae (Tabela 5: p. 63), mas apresentou
atividade inibidora da acetilcolinesterase (Tabela 6: p. 63).
Mc-5F: (8,7 mg) Apesar do baixo rendimento metablico, o espectro de RMN de 1H

(Figura 47, p. 123) apresentou vrios sinais de hidrognios metlicos, metoxlicos,
carbinlicos e poucos sinais de hidrognios aromticos e olefnicos. Nos ensaios biolgicos, o
endoftico apresentou fraca atividade frente Cladosporium sphaerospermum e mdia atividade
frente C. cladosporioides (Tabela 4: p. 62), sendo inativo frente Saccharomyces cerevisiae
(Tabela 5: p. 63), mas apresentou atividade inibidora da acetilcolinesterase (Tabela 6: p. 63).
Mc-6F: (30,5 mg) Este endoftico apresentou o mnimo rendimento metablico
necessrio e foi identificado como Phomopsis stipata, Uma cuidadosa avaliao do espectro
de RMN de 1H do extrato deste endfito, evidenciou uma substncia predominante. Podendo
ser identificado a presena do cido 3-nitropropinico (21) atravs dos sinais caractersticos
em H 3,00 (2H, t, J = 6,0 Hz) e 4,63 (2H, t, J = 6,0 Hz) (Figura 206, p. 261). A confirmao
da presena desta substncia foi atravs do espectro de massas de baixa resoluo (Figura
207, p. 262), obtido atravs da tcnica ESI-MS (+), e observado o pico do on m/z 98
indicando a formao do fragmento [M+H-CO2]+.
Esta mesma substncia j foi isolada do fungo Phomopis sp. e apresentou atividade
frente 15 tipos de micobactrias de plantas (CHOMEHEON, et al., 2005).
O extrato produzido por Mc-6F apresentou atividade forte frente aos fungos
Cladosporium sphaerospermum e atividade mdia com C. cladosporioides (Tabela 4: p. 62).
Este extrato tambm apresentou atividade frente s linhagens mutantes de Saccharomyces
cerevisiae (Tabela 5: p. 63) e nos ensaios de inibio da acetilcolinesterase (Tabela 6: p. 63).
Mc-7F: (15,0 mg) Esta linhagem foi identificada como Colletotrichum gloeosporioides,
apresentando um rendimento metablico baixo, mas o espectro de RMN de 1H (Figura 49, p.
124) apresentou muitos sinais de hidrognios aromticos e metoxilas, algumas metilas
aromticas e alifticas.
Nos ensaios biolgicos, o endoftico apresentou fraca atividade frente ao fungo

Cladosporium sphaerospermum, mdia frente C. cladosporioides (Tabela 4: p. 62) e
atividade seletiva frente Saccharomyces cerevisiae (Tabela 5: p. 63), apresentou tambm
atividade inibidora da acetilcolinesterase (Tabela 6: p. 63). Apresar do baixo rendimento
metablico, estes resultados motivaram a seleo deste fungo para estudo qumico.
4.1.3 Fungos Endofticos Isolados das Razes de Michelia champaca
Mc-8R: (48,5 mg) Apresenta um rendimento metablico razovel. O espectro de
RMN de 1H (Figura 50, p.124) mostrou sinais abrangendo toda regio espectral. O extrato
produzido por este fungo mostrou forte atividade antifngica frente ao fungo Cladosporium
sphaerospermum e C. cladosporioides (Tabela 4: p. 62), alm de atividade seletiva em
Saccharomyces cerevisiae, onde atingiu 70% da atividade do padro utilizado
(estreptonigrina) (Tabela 5: p. 63). Nos ensaios de inibio da acetilcolinesterase tambm
apresentou atividade (Tabela 6: p. 63) estes resultados fizeram com que este fungo fosse
escolhido para o estudo qumico.
4.2 Cultivo do Endoftico Mc-8R em Diferentes Meios de Cultura.
Os fungos endofiticos Mc-8R e Mc-7F se mostraram excelentes produtores de
metablitos potencialmente bioativos e com uma diversidade estrutural notvel. Considerando
estes fatos, e que a produo metablica de microrganismos altamente dependente das
condies e meios de cultivo, nos propusemos a avaliar a produo metablica de Mc-8R em
outros meios.
Com este procedimento, objetivvamos a obteno de outros metablitos secundrios,
talvez mais bioativos que os inicialmente obtidos.
Levando-se em considerao que cada meio de cultura tem concentraes diferentes
estabelecemos a relao de massa de extrato produzido em (mg) para cada (grama) de
substrato utilizado, estes dados esto apresentados na Tabela 8: p. 68.
Tabela 8: Relao produtiva dos fungos por quantidade de meio de cultura

Meio
Conc. g/L
Quant. gramas (g) p/
Massa extrato
500 ml
(mg)
24
12,0
48,8
CDB
20
10,0
148,8
ME
21
10,5
30,4
YM
8
4,0
13,4
Nutriente
35
17,5
25,3
Czapek
90
Slido = 90
1910,0
Milho
90
Slido = 90
1900,0
Arroz
90
Slido = 90
810,0
Milho ACN
90
Slido = 90
930,0
Arroz ACN
24 CDB
12
436
XAD 2 Saco
24 CDB
12
105
XAD 2 Solto
Massa de extrato/Meio de
cultura (mg/g)
4,07
14,88
2,89
3,35
1,44
21,22
21,11
9,00
10,33
36,33
8,75
O cultivo em diferentes meios forneceu massa de extrato bruta distintas o que pode ser
obserado Figura 10, Grfico 01, p. 68 evidenciando que em XAD 2 saco, a massa obtida
apresentou melhor rendimento.
Considerando a natureza de mdia a alta polaridade das substncias extradas pela
partio com AcOEt, foi de fundamental importncia a submisso dos extratos e fraes
CLAE, verificando a adequao desta tcnica cromatogrfica no trabalho experimental, e
contribuiu para o conhecimento da natureza qumica das substncias presentes.
Estes dados em conjunto com seus respectivos espectros de RMN de 1H permitiram
fazer algumas consideraes:
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
CDB
ME
YM
Nutriente Czapek
Milho
Arroz
Milho
ACN
Arroz
ACN
XAD 2
Saco
XAD 2
Solto
Figura 10: Grfico 01: variao metablica de Mc-8R com vrios meios de culturas e condies de crescimento
Czapek: O fungo apresentou baixa produo metablica neste meio de cultura (25,3
mg) (1,44 mg/g). O cromatograma em gradiente exploratrio deste extrato (Figura 51, p. 125)
mostrou poucos picos de baixa mdia absorvncia. Observou-se no espectro e RMN de 1H
(Figura 52, p. 125) a presena de sinais caractersticos de pironas e a ausncia dos sinais
aromticos caractersticos de cidos pirenochaticos.
YM: Neste meio o fungo produziu a quantidade de (30,4 mg) mas sua massa
proporcional foi de (2,89 mg/g), se apresentando intermedirio em comparao com os meios
Czapek e Nutriente. O cromatograma em gradiente exploratrio (Figura 55, p. 127)
apresentou cinco picos com maior absorvncia, indicando mdia variao metablica. Uma
anlise do espectro de RMN de 1H (Figura 56, p. 127) mostrou sinais caractersticos de
pironas mais intensos do que os de cidos pirenochaticos, portanto, pode-se concluir que este
meio tambm favorece a produo de pironas.
Nutriente: O cultivo de Mc-8R neste meio apresentou o menor rendimento em massa
(13,4 mg), mas um rendimento proporcional (3,35 mg/g) maior que em Czapek. Uma anlise
do cromatograma em gradiente exploratrio deste extrato (Figura 53, p. 126) confirma a
baixa produo metablica devido presena de apenas trs picos. No espectro de RMN de
1
H (Figura 54, p. 126), observaram-se poucos sinais caractersticos de cido pirenochatico
no se observando sinais de pironas. Aparentemente, este meio de cultura favorece a produo

dos cidos em relao s pironas, ao contrrio meio Czapek.
CDB: Este meio de cultura o mais utilizado para crescimento de fungos endofticos
tanto na literatura como nos trabalhos de nosso grupo. Seria de se esperar que este meio fosse
o meio que apresentasse o maior rendimento metablico, mas para este fungo em questo isso
no observado, apresentando uma produo de (48,8 mg), com a produo proporcional de
(4,0 mg/g) demonstrando ter uma produo pouco maior do que no meio Nutriente.
No espectro de RMN de 1H (Figura 50, p.124), observaram-se poucos sinais caractersticos

de cido pirenochatico e observando sinais de pironas em maior intensidade. Aparentemente,
este meio de cultura favorece a produo de pironas em relao aos cidos pirenochaticos.
Extrato de Malte: De todos os meios de cultura lquidos, este apresentou o maior
rendimento em massa (148,8 mg) e em massa proporcional (14,9 mg/g). Uma anlise do
cromatograma em gradiente exploratrio (Figura 57, p. 128) revelou vasta produo
metablica apresentando vrios picos abrangendo toda a extenso do cromatograma. O
espectro de RMN de 1H (Figura 58, p. 128 apresentou sinais caractersticos de pironas mais
intensos que os sinais de cidos pirenochaticos, indicando que a produo de pironas
favorecida neste meio de cultura.
Arroz: Em meio slido a produo de extrato foi de 1,90 g e a produo proporcional
foi de (21,2 mg/g). Anlise do espectro de RMN de 1H deste extrato revelou uma grande
quantidade de triglicerdeos, que atrapalham a visualizao de outros metablitos. Para
contornar este problema o extrato foi submetido a uma partio lquido/lquido com
Hex/ACN retirando material apolar.
Este processo resultou em 0,93 g de extrato Hexnico e 0,93 g de extrato ACN, ou
seja, 50% do extrato total de natureza graxa, no podendo ser analisado em CLAE de fase
reversa. O cromatograma em gradiente exploratrio do extrato ACN/Arroz (Figura 59, p.
129) revelou uma vasta variao metablica, com picos abrangendo toda a regio do
cromatograma. O espectro de RMN de
H (Figura 60, p. 129), apresentou sinais
caractersticos de pironas e de cidos pirenochaticos, sendo estes mais intensos, sugerindo

uma maior produo de cidos pirenochaticos do que de pironas.
Milho: O extrato produzido neste meio slido foi submetido ao mesmo procedimento
que o extrato obtido em Arroz, resultando em 1,10 g de extrato Hexnico e 0,81g de extrato
ACN. O cromatograma em gradiente exploratrio do extrato ACN/Milho (Figura 61, p. 130),
apresentou-se semelhante ao do extrato ACN/Arroz, apenas diferenciando-se na intensidade

de alguns sinais. Apesar dos extratos obtidos em milho e arroz serem muito parecidos pode-se
observar uma pequena diferena na produo metablica de Mc-8R quando cultivado nestes
dois meios. Uma anlise dos dados de RMN de 1H (Figura 62, p. 130) mostra sinais
caractersticos de pironas e cidos pirenochaticos, onde os cidos esto em maior quantidade.
Os Extratos hexnicos obtidos das culturas de Arroz e Milho foram submetidos
CCDC (Figura 65, p. 131), onde se observa a semelhana na constituio qumica destes. Os
espectros de RMN 1H (Figura 63 e Figura 65, p. 131 e 131) dos extratos Hexnicos
confirmaram essa similaridade. Se observou tambm sinais caractersticos de ergosterol (9),
substncia encontrada no resduo insolvel obtido a partir do extrato Hex/Milho (Figura 136,
p. 191).
XAD 2 Saco: Esta uma variao metodolgica por estar utilizando o meio de cultura
CDB juntamente com XAD 2 acondicionados em sacos de tecido sinttico.
Esta tcnica foi desenvolvida nica e exclusivamente por mim e apresentou resultados
surpreendentes. Seria de se esperar que por estar utilizando o meio de cultura CDB o
rendimento fosse estar prximo aos (4,0 mg/g), mas este rendimento passou para a ordem de
(36,3 mg/g), isso demonstra que a idia de o XAD 2 estar seqestrando do meio de cultura os
metablitos produzidos pelo fungo verdico e pode ser observado no cromatograma que
apresenta apenas a produo de 3 substncias.
XAD 2 Solto: Nesta variao metodolgica o procedimento adotado foi o de se
adicionar XAD 2 solto no meio de cultura CDB. Seria de se esperar um rendimento
metablico parecido com o XAD 2 Saco, mas se observou uma produo bem menor. No
experimento observado que o XAD 2 Solto atrapalha o desenvolvimento micelar do fungo
onde verifica-se o miclio todo triturado juntamente com o XAD 2 no meio. Sugerimos este
o motivo deste experimento ter apresentado o rendimento metablico de (8,0 mg/g). Apesar
de ser bem inferior a XAD 2 Saco este ainda apresenta um rendimento duas vezes maior que o
crescimento apenas em CDB.
No cromatograma observada uma variao metablica muito grande, podemos
sugerir que neste experimento o XAD 2 no tem a mesma eficincia quanto comparado com
este estando acondicionado em sacos de tecido sinttico.
Aparentemente no se observa variao no crescimento de Mc-8R utilizando vrios
meios, tendo por base apenas o volume de miclio obtido no momento da filtrao, seria
intuitivo imaginar que houvesse a mesma relao de produo de extrato nos vrios meios.
No entanto observa-se que o meio onde se obteve a menor produo foi o meio mais artificial
contendo vrios sais e um acar como nutrientes (Czapek). O meio rico em aucares e pobre
em fonte de nitrognio (YM), apresenta-se com um rendimento um pouco maior, o meio que
tem fonte de carbono na foram de aucares e nitrognio na forma de protenas (Nutriente)
vem com uma produo um pouco maior que os anteriores. Mas os meios que realmente so
favorveis a este fungo em questo, so os de origem natural sem aditivos, como CDB extrato
de malte, milho e arroz.
Destes ltimos dois existe a possibilidade de se extrair leos que j fazem parte da
constituio das sementes milho e arroz, podendo resultar em uma constatao errnea, mas
mesmo se utilizando dos dados do extrato sem a parte graxa, a produo muito mais
significativa quando comparado aos outros meios de cultura lquidos, chegando a ser da
ordem de 3 vezes mais extrato. Seguindo neste raciocnio ainda podemos estar cometendo o
erro de desconsiderar e existncia de uma produo metablica de carter apolar que pode ser
produzida pelo fungo. Exemplo disso foi a identificao dos ergosteris (9) e (10) muito
encontrados em fermentados de fungos endofticos.
Algumas consideraes que podem ser feitas com relao variao que
aparentemente no houve uma grande alterao na produo de metablitos secundrios tendo
por base apenas os sinais de RMN de 1H caractersticos das pironas e cidos pirenochaticos.
Observando os cromatogramas pode-se constatar que em alguns casos ocorre uma
variao na quantidade de picos sugerindo uma maior variao metablica.
Este estudo serviu para nos concluirmos que, tomando por base as anlises realizadas
nesta triagem, este endoftico deva produzir estruturas com pelo menos os mesmos esqueletos
das substncias j identificadas.
4.3 Elucidao Estrutural das Substncias Isoladas.
4.3.1 Elucidao Estrutural das Substncias Produzidas por Mc-8R.
4.3.1.1 Identificao Estrutural da Citreopirona (Pirenocina A) (1).
A substncia (1) foi submetida anlise por espectrometria de massas (Figura 93, p.
148), utilizando-se a tcnica ESI-MS-MS (+) e apresentou o pico base m/z 209, referente
formao do on quasi molecular [M+H]+. A massa calculada foi de 208, sugerindo frmula
molecular C11H12O4.
O espectro de RMN de 1H (Tabela 9: p. 75, Figura 88, p. 143) mostrou um singleto em
H 5,46 (1H, s, H-3), dois duplos quartetos em H 6,30 (1H, dq, J= 1,6 e 15,5 Hz, H-10) e H
6,78 (1H, dq, J = 6,9 e 15,5 Hz, H-11), caractersticos de hidrognios olefnicos, onde a
constante de acoplamento de 15,5 Hz aponta para uma dupla ligao em trans. O
deslocamento observado em H 1,95 (3H, dd, J= 1,6 e 6,9 Hz, H-12) refere-se metila ligada
a insaturao. Estas posies so confirmadas pelas constantes de acoplamento e
multiplicidade caractersticas. O espectro apresentou ainda sinais de metoxila em H 3,79 (3H,
s, H-8) e metila ligada a carbono olefnico em H 2,16 (3H, s, H-7).
O espectro de RMN de
13
C (Tabela 9: p. 75, Figura 89, p. 144) apresentou sinais em
161,5 (C-6), 114,0 (C-5), 133,1 (C-10), 147,2 (C-11), 168,7 (C-4) e 87,7 (C-3)
correspondentes aos carbonos olefnicos. O sinal observado em C 163,0 (C-2) caracterstico

de carbonila de lactona e o sinal em C 190,5 (C-9) caracterstico de cetona ,-insaturada. O
espectro de RMN de
13
C apresentou ainda sinais em C 18,5 (C-12) e C 18,2 (C-7)
correspondentes aos carbonos metlicos.

Pela anlise conjunta dos dados de RMN de 1H,
13
C e os mapas de contorno gHMQC
(correlaes diretas 1H x 13C - gHMQC - 1JCH) (Tabela 9: p. 75, Figura 90, p. 145) todos os
hidrognios foram atribudos aos respectivos tomos de carbono.
Os experimentos bidimensionais de gHMBC (Figura 91, p.146) a curta e longa
distncia 2JCH, 3JCH e 4JCH, mostraram correlao entre a metoxila H-8C-3 e H-7C-6. O
hidrognio desprotegido em 5,46 s H-3C-4/C-2 sugere um anel caracterstico de pironas.
Uma anlise adicional dos mapas de contorno bidimensionais de gHMBC (Figura 91,
p.146) evidenciou as correlaes H-11C-12/C-9.
A correlao entre H-10 C-5 no foi observada nos experimentos de gHMBC, mas
um levantamento na literatura conduziu estrutura da citreopirona (Pirenocina A), um
metablito
produzido
por
Penicillium
citreo-viride
B.
(SHIZURI;
KOSEMURA;
YAMAMURA, 1984) permitindo atribuir a estrutura (1) para a pirona em anlise (Figura 11,
p.74).
Verificou-se que Pirenochaeta terrestris, tambm produz esta substncia e apresenta
alta atividade citotxica frente germinao de alface (SATO; KONOMA; SAKAMURA,
1981) e atividade citotxica frente girassol (TAL; ROBESON, 1986).
8
H3C
O
4
O
5
Correlao de gHMBC
10
11 CH3
12
6
CH3
O
7
1
Figura 11: Estrutura da Citreopirona (Pirenocina A) (1)
O
Tabela 9: Dados de RMN de 1H e 13C da Pirenocina A (1) (CDCl3 a 11,7 T)

1
N
H ppm (multip. J= Hz)
2
3
5,46 (s)
4
5
6
7
2,16 (s)
8
3,79 (s)
9
10
6,30 (dq, 1,6/15,5)
11
6,78 (dq, 6,9/15,5)
12
1,95 (dd, 1,6/6,9)
13
C (ppm)
163,0
87,7
168,7
114,0
161,5
18,2
56,3
190,5
133,1
147,2
18,5
4.3.1.2 Identificao Estrutural da Pirenocina E (2).

A substncia (2) foi submetida anlise por espectrometria de massas de baixa
resoluo (Figura 99, p. 154) utilizando-se a tcnica ESI-MS-MS (+) e apresentou o pico
base m/z 263 indicando a formao do aduto com sdio [M+Na]+ e o fragmento em 209 [MCH3O]+. A massa calculada foi de 240, sugerindo frmula molecular C12H16O5.
Os espectros de RMN de 1H e de 13C (Tabela 9: e Tabela 10: p. 75 e 76, Figura 88 e
Figura 89 (1) e Figura 94e Figura 95, (2), pgs. 143 e 144, 149 e 150), gHMQC (Figura 90 e
Figura 96 pgs. 145 e 151) e gHMBC (Figura 91 e Figura 97, pgs. 146 e 152) mostraram
muita semelhana entre (1) e (2) evidenciado o desaparecimento dos hidrognios olefnicos
H-10 e H-11 e o aparecimento dos hidrognios diastereotpicos carbonila em H 2,72 (1H,
dd, J= 4,9 e H 15,8 Hz, H-10) e H 2,92 (1H, dd, J= 8,2 e 15,8 Hz, H-10) e uma metoxila
aliftica em H 3,26 (3H, s, H-13), indicando que a estrutura parcial B perdeu a conjugao.
A anlise dos dados de
13
C (Tabela 10: p. 76, Figura 95, p. 150) desta parte da
estrutura permitiu confirmar o desaparecimento dos carbonos olefnicos e o aparecimento dos

carbonos em C 51,6 (C-10), 73,7 (C-11) e 56,1 (C-13) caractersticos de um carbono
carbonlico, com influencia de desproteo e dos carbonos metnico e metlico, ambos ligado
a oxignio.
As correlaes observadas nos espectros de RMN de gHMBC (Figura 97, p. 152) a
curta e longa distncia 2JCH e 3JCH, mostraram correlao entre H-13C-11 confirmando a
presena da metoxila em C-11. Esta informao possibilitou propor a estrutura para a

substncia (2). Uma comparao com dados da literatura permitiu atribuir, sem ambigidades,
a estrutura da pirona (2) como sendo a Pirenocina E (Figura 12, p. 76).
Uma pirona produzida por Penicillium waksmanii, e que apresentou atividade citotxica
(AMAGATA, et al., 1998).
8
H3C
O
4
O
5
6
O
O
1
10
OCH3
13
Correlao de gHMBC
11 CH3
12
CH3
7
Figura 12: Estrutura da Pirenocina E (2)
Tabela 10: Dados de RMN de 1H e 13C da Pirenocina E (2) (CDCl3 a 11,7 T)

1
N
H (multip. J= Hz)
2
3
5,46 (s)
4
5
6
7
2,23 (s)
8
3,84 (s)
9
10
2,72 (dd, 4,9/15,8)
2,92 (dd, 8,2/15,8)
11
3,81 (tq 1,3/4,9/6,0/8,2)
12
1,18 (d, 6,0)
13
3,26 (s)
13
C (ppm)
162,6
87,6
168,4
115,9
163,4
18,3
56,3
199,3
51,6
73,7
18,9
56,1
4.3.1.3 Identificao Estrutural da Pirenocina B (3).

A substncia (3) foi isolada em mistura com (1) e (2) devido a pouca quantidade de
material optamos pela determinao estrutural de (3) em mistura. Esta foi submetida
espectrometria de massas de baixa resoluo (Figura 104, p. 159), utilizando-se a tcnica
ESI-MS-MS (+) e apresentou o pico base m/z 249 indicando a formao do aduto com sdio
[M+Na]+. A massa calculada foi de 226, sugerindo frmula molecular C11H12O4.
Comparao dos dados de RMN de 1H e 13C e gHMQC Tabela 11: p. 77, (Figura 94 e
Figura 95 (2), Figura 100 e Figura 101 (3), pgs. 149 e 150, 155 e 156) e gHMBC (Figura
97 e Figura 102, pgs. 152 e 157) de (2) e (3) mostram muitas semelhanas entre as
substncias (1) e (2). Entretanto, a diferena observada entre (2) e (3) ocorre com o
desaparecimento dos hidrognios da metoxila em H 3,26 (3H, s, H-13) e o deslocamento do
hidrognio carbinlico em H 3,81 (1H, qt, 1,3/4,9/6,0 e 8,2 Hz, H-11) de (2) para H 4,01
(1H, m, H-11) de (3) evidenciando que ocorreu a desmetilao da hidroxila em C-11.
Uma comparao com dados da literatura permitiu atribuir sem ambigidades a
estrutura da pirona (3) como sendo a Pirenocina B, uma pirona produzida por Penicillium
citreo-viride B e Pyrenochaeta terrestris (SHIZURI; KOSEMURA; YAMAMURA, 1984)
(Figura 13, p. 77). Esta substncia apresentou atividade citotxica ao girassol (TAL;
ROBESON, 1986).
H 3C
O
4
9
6
OH
10 11
Correlao de gHMBC
CH 3
12
CH 3
7
Figura 13: Estrutura da Pirenocina B (3)
Tabela 11: Dados de RMN de 1H e 13C da Pirenocina B (3) (DMSO-d6 a 11,7 T)

1
N
H (multip. J= Hz)
2
3
5,66 (s)
4
5
6
7
2,13 (s)
8
3,84 (s)
9
10
2.72 (d, 3,0)
2.74 (s)
11
4,01 (m)
12
1.08 (d, 6,2)
13
C (ppm)
162,2
87,5
168,4
115,4
162,0
18,2
56,8
200,1
53,4
63,4
23,7
4.3.1.4 Identificao Estrutural do cido Pirenochatico C (4)

A substncia (4) foi submetida espectrometria de massas de baixa resoluo (Figura
111, p. 166), utilizando-se a tcnica ESI-MS (+) e apresentou o pico em m/z 259 (100%)
indicando a formao do aduto com sdio [M+Na]+ e o on quasi molecular em 237 [M+H]+.
A massa calculada foi de 236, sugerindo frmula molecular C13H16O4.
O espectro de RMN de 1H (Tabela 12: p. 80, Figura 105, p. 160) apresentou sinais em
H 3,81 (3H, s, H-11) e 2,15 (3H, s, H-12), caractersticos de metoxila e metila aromticas
respectivamente, alm de dois singletos em H 7,38 (1H, s, H-2) e H 7,42 (1H, s, H-6),
evidenciando a presena de um anel tetrasubstitudo.
13
C (Tabela 12: p. 80, Figura 106, p. 161) apresentou seis
carbonos aromticos (quatro quaternrios), trs carbonos metlicos, sendo um ligado a

oxignio, dois carbonos metilnicos, alm de uma carbonila de cetona e outra de cido
carboxlico.
(correlaes diretas 1H x
13
13
C - gHMQC - 1JCH) (Tabela 12: p. 80, Figura 107, p. 162), foi
possvel atribuir todos os hidrognios aos respectivos tomos de carbono.

Atravs das correlaes observadas nos experimentos bidimensionais de gHMBC
(Tabela 12: p. 80, Figura 108, p. 163) a longa distncia 2JCH e 3JCH, foi possvel visualizar as
interaes entre os hidrognios aromticos entre H-2C-6/C-13 e H-6C-2/C-5/C-12/C-13
e atribuir a estrutura parcial A para a substncia (4) (Figura 14, p.79). A localizao dos
substituintes no anel foi estabelecida com base nas informaes obtidas no espectro
unidimensional de NOESY-1D (Tabela 12: p. 80, Figura 110, p. 165).
11
OCH3
3
2
HO
4
1
13
CH3
12
Figura 14: Estrutura parcial A para substncia (4)
Uma anlise adicional do mapa de contorno gHMBC (Figura 108, p. 163) evidenciou as
correlaes a longa distncia 2JCH e 3JCH de H-8 C-7/C-10/C-12, H-9 C-8/ C-7/C-10 e H10C-9/C-8. Observou-se ainda a mesma constante de acoplamento (7 Hz) entre os
hidrognios H-8 e H-9 o que juntamente com as multiplicidades apresentadas permitiram
sugerir a estrutura parcial B (unidade no aromtica) para a substncia (4) (Figura 15, p. 79).
O
9
CH3
10
Figura 15: Estrutura parcial B para substncia (4)
8
A conexo entre as estruturas parciais A e B foi determinada com base nos

experimentos de NOESY-1D (Tabela 12: p. 80, Figura 110, p. 165), onde foi verificada a
interao espacial entre H-8H-10/H-9/H-12/H-11.
Estas informaes, aliadas aos dados da literatura permitiu identificar a substncia em
questo como sendo o cido Pirenochatico C (4), tambm produzido pelo fungo
Pyrenochaeta terrestris (Figura 16, p. 79), e com alta atividade citotxica frente
germinao de alface (SATO; KONOMA; SAKAMURA, 1981).
11
OCH3
3
2
HO
13
O
4
5
Correlao de gHMBC
9
7
CH3 10
CH3
12
Figura 16: Estrutura do cido Pirenochatico C (4)
Tabela 12: Dados de RMN de 1H, 13C, gHMBC e NOESY 1D do cido Pirenochatico C (4) (DMSO-d6 a 11,7
T).
1
13
N
H ppm (multip., J= Hz)
C (ppm)
gHMBC
NOESY 1D
1
134,5
2
7,38 (s)
109,3
C-6/C-5/C-13
H-11
3
155,6
4
5
134,6
6
7,42 (s)
123,7
C-1/C-2/C-12/C-13
H-12
7
206,5
8
2,69 (t, 7,0)
45,4
C-7 / C-10 / C-12
H-9/H-10/H-11/H-12
9
1,58 (sex, 7,0)
16,4
C-7 / C-8/ C-10
10
0,90 (t, 7,0)
13,4
C-8/C-9
11
3,81 (s)
55,8
C-3
H-6
2,15 (s)
18,2
C-5/C-6
H-6/H-8
12
13
166,7
-
4.3.1.5 Identificao Estrutural do cido Pirenochatico A (5).

117, p. 172), utilizando-se a tcnica ESI-MS (+) e apresentou o pico base m/z 257 indicando a
formao do aduto [M+Na]+ e o on pseudo molecular em 235 [M+H]+. A massa calculada foi
de 234 sugerindo frmula molecular C13H14O4.
As semelhanas observadas entre os dados de RMN de 1H e
13
C (Tabela 13: p. 81,
Figura 105 e Figura 106 (4), Figura 112 e Figura 113 (5), pgs. 160 e 161, 167 e 168),
gHMQC (Figura 107 e Figura 114, pgs. 162 e 169) e gHMBC (Figura 108 e Figura 115,
pgs. 163 e 170) de (4) e (5) apontam para a mesma estrutura parcial A (Figura 14, p.79).
Entretanto, observa-se o aparecimento de dois duplos dubletos em H 6,35 (1H, dq, J= 1,5 e
15,5 Hz, H-8) e H 6,55 (1H, dq, J= 7,0 e 15,5 Hz, H-9), caractersticos de hidrognios
olefnicos, e constante de acoplamento (J= 15,5 Hz) correspondente a dupla ligao em trans
na unidade no aromtica, sugerindo a estrutura parcial B (Figura 17, p. 80).
O
9
7
10
Figura 17: Estrutura parcial B para a substncia (5)
Comparao com dados da literatura permitiu atribuir estrutura de (5) como sendo o
cido Pirenochatico A (Figura 18, p. 81), tambm produzido por Pyrenochaeta terrestris e
apresentando uma alta atividade citotxica frente germinao de alface (SATO; KONOMA;
SAKAMURA, 1981).
11
OCH3 O
3
2
HO
13
Correlao de gHMBC
CH3
10
CH3
12
Figura 18: Estrutura do cido Pirenochatico A (5)
4.3.1.6 Identificao Estrutural do cido Pirenochatico B (6)
O espectro de massas de (6) (Figura 123, p. 178), foi obtido utilizando-se a tcnica ESIMS (+) em baixa resoluo, apresentou o pico em m/z 275 indicando a formao do aduto
[M+Na]+. A massa calculada foi de 252, sugerindo fmula molecular (C13H16O5)
13
gHMQC (Figura 114 e Figura 120 pgs. 169 e 175) e gHMBC (Figura 115 e Figura 121
pgs. 170 e 176) de (5) e (6) apontam para a mesma estrutura parcial (A). Entretanto, na
unidade no aromtica, observa-se o desaparecimento dos hidrognios olefnicos H-8 e H-9 e
o aparecimento de um carbono carbinlico em C 62,8 (C-9) que desloca o valor da metila C10 para C 23,7. De acordo com estas consideraes e anlise dos experimentos
bidimensionais de gHMBC (Figura 121 p. 176), foi possvel determinar a estrutura parcial B
para a substncia (6) (Figura 19, p. 81).
O
7
OH
8
10
Tabela 13: Dados de RMN de 1H e 13C dos cidos Pirenochaticos A, B, 7 e 8 (DMSO-d6 e CDCl3, a 11,7 T)
Apesar da conexo das estruturas parciais A e B no serem visualizada nos

experimentos de gHMBC, um levantamento na literatura, para a substncia (6) pode-se
identific-la como cido Pirenochatico B (Figura 20, p. 83), tambm produzido pelo
fitopatgeno Pyrenochaeta terrestris, com alta atividade citotxica frente germinao de
alface (SATO; KONOMA; SAKAMURA, 1981)
11
OCH3
HO
13
5
6
OH
Correlao de gHMBC
9
8
CH3
10
CH3
12
Figura 20: Estrutura do cido Pirenochatico B (6)
4.3.1.7 Elucidao Estrutural do cido Pirenochatico (7)
O espectro de massas de (7) foi obtido utilizando-se a tcnica ESI-MS (+) em alta
resoluo (Figura 129, p. 184), apresentou o pico base em m/z 275,0894 correspondendo ao
aduto com sdio [M+Na]+, o pico em 235,097 correspondendo perda de gua [M-H2O+H]+.
A massa calculada foi de 252,0997 sugerindo a frmula molecular (C13H16O5).
13
gHMQC (Figura 120 e Figura 126, pgs. 175 e 181) e gHMBC (Figura 121 e Figura 127,
pgs. 176 e 182 de (6) e (7) apontam para a mesma estrutura parcial A (Figura 14, p.79).
Entretanto, na unidade no aromtica, observa-se o aparecimento do sinal em H 1,71 (2H,
dddd, J= 6,0/6,5/7,3 e 14,3 Hz, H-9) referente aos hidrognios metilnicos H-9. Observou-se
ainda o desaparecimento da metila terminal. O espectro de
13
C observa-se a desproteo do
carbono em C 59,9 (C-10), sugerindo o aparecimento de uma hidroxila nesta posio. A

anlise do espectro de gCOSY (Figura 128, p. 183), revelou a correlao do hidrognio H9H-8/H-10, possibilitando sugerir uma nova estrutura parcial B (Figura 21, p. 84).
O
8
OH
A substncia (7) foi identificada como sendo um cido Pirenochatico de estrutura

ainda no descrita, atravs da anlise dos dados espectromtricos e comparao com similares
da literatura (SATO; KONOMA; SAKAMURA, 1981), pde-se atribuir a estrutura da
substncia (7) (Figura 22, p. 84). Esta apresentou forte atividade biolgica frente aos fungos
fitopatognicos Cladosporium cladosporioides e C. sphaerospermum e atividade inibidora da
acetilcolinesterase. O levantamento bibliogrfico foi realizado utilizando-se o sistema
SciFinder Scholar na data de 10 de Agosto de 2007.
11
OCH3
3
HO
13
Correlao de gHMBC
O
4
9
8
OH
10
CH 3
12
Figura 22: Estrutura da substncia (7)
4.3.1.8 Elucidao Estrutural do cido Pirenochatico (8)
A substncia (8) foi identificada atravs da anlise dos dados espectromtricos e

comparao com similares da literatura (SATO; KONOMA; SAKAMURA, 1981), como
sendo um cido Pirenochatico tambm de estrutura desconhecida, com frmula molecular
C12H14O4, sugerida pelo espectro de massas de alta resoluo, obtido pela tcnica ESI-MS (+)
(Figura 135, p. 190), que apresentou o pico com m/z 262,035, sugerindo ser a molcula com
seu hidrognio cido trocado por deutrio proveniente do solvente deuterado nos
experimentos de RMN formando o aduto com potssio [M+K]+.
13
gHMQC (Figura 107 e Figura 132, pgs 162 e 187) e gHMBC (Figura 108 e Figura 133,
pgs. 163 e 188) de (4) e (8) apontam para a mesma estrutura parcial A (Figura 14, p.79).
Entretanto, na regio no aromtica, observa-se o desaparecimento da metila em C 13,4 (C10) de (4) e o surgimento de uma metila protegida em C 7,0 (C-9) sugerindo que esta se
encontra em posio cetona. Observou-se ainda a desproteo do carbono C-8 em C 29,8
(C-8), evidenciando sua posio carbonila. No espectro de gCOSY (Figura 134, p. 189)
observou-se apenas uma correlao entre H-8H-9 confirmando as observaes acima. De
acordo com estas consideraes foi possvel propor a estrutura parcial B visualizada abaixo na
Figura 23, p. 85.
O
8
Comparao com dados da literatura (SATO, 1981) permitiu identificar a substncia (8)
(Figura 24, 85) como sendo um cido Pirenochatico de estrutura ainda no descrita e
similar a do cido pirenochatico C (4). A substncia (8) tambm apresentou uma forte
atividade biolgica frente os fungos fitopatognicos Cladosporium cladosporioides e C.
sphaerospermum e atividade inibidora da acetilcolinesterase. O levantamento bibliogrfico foi
realizado utilizando-se o sistema SciFinder Scholar na data de 10 de agosto de 2007.

10
OCH3
3
2
HO
12
Correlao de gHMBC
9
8
CH3
11
Figura 24: Estrutura da substncia (8)
4.3.1.9 Identificao Estrutural de Ergosterol (9)
O espectro de RMN de 1H de (9) (Figura 136, p. 191) apresenta sinais de hidrognios

alifticos, metlicos, carbinlicos. No espectro de RMN de 13C (Tabela 14: p. 87, Figura 137,
p. 192) foi possvel observar a presena de 28 tomos de carbono. A comparao dos dados
da literatura (SHIRANE, et al., 1996) com os dados de RMN de 1H e
13
C da substncia (9)
sugeriu tratar-se do ergosterol, um esteride comum em fungos (Figura 25, p. 87).

No espectro de RMN de 13C (Tabela 14: p. 87, Figura 137, p. 192) foram observados
seis carbonos olefnicos em C 139,8 (C-5), 119,6 (C-6), 116,3 (C-7), 141,3 (C-8), 135,6 (C22) e 132,0 (C-23) e um carbinlico em C 70,4, (C-3).
No espectro de RMN de 1H, (Figura 136, p. 191) foram observados sinais de metilas,
hidrognios carbinlicos e olefnicos. O multipleto em H 3,62 (1H, m, H-3) foi atribudo ao
hidrognio carbinlico, um duplo dubleto em H 5,55 (1H, dd, J= 2,3 e 5,6 Hz, H-7) e um
multipleto em H 5,33 (1H, m, H-6) pertencentes dos hidrognios olefnicos do dieno e um
duplo quarteto em H 5,19 (2H, dq, 7,0/7,7 e 15,5 Hz) pertence aos hidrognios do sistema
olefnico H-22 e H-23.
Na regio entre H 0,5-1,0 observa-se a presena de dois singletos e quatro dubletos,
sendo que dois destes coalescem se apresentando como um tripleto com constantes de
acoplamento diferentes. Os singletos foram atribudos aos hidrognios metlicos H-18 e H-19
em H 0,93 (3H, s) e 0,62 (3H, s), respectivamente; os dubletos que coalescenram esto em H
0,81-0,82 (3H, d, J= 7,1 Hz, H-26), 0,82-0,83 (J= 6,9 Hz H-27) e os dubletos em H 1,02
(3H, d, J= 6,6 Hz, H-28) e H 0,90 (3H, d, J= 6,8 Hz, H-21) foram atribudos aos hidrognios
metlicos H-28 e H-21 respectivamente (SHIRANE, et al., 1996).
Os valores dos deslocamentos qumicos dos tomos de carbono do ergosterol
encontram-se na Tabela 14: p. 87 esta substncia muito comum em fungos e segundo
SUBBIAH; ABPLANALP, 2003 o ergosterol tem atividade inibidora de clulas cancergenas

em ensaios realizados in vitro.
21
18
19
2
3
HO
11
12
9
6 10
5
20
23
13
14
28
22
17
16
15
24
26
25
27
Figura 25: Estrutura da do Ergosterol (9)
Tabela 14: Dados de RMN de 13C do Ergosterol (9) (CDCl3 a 11,7 T) e dados de RMN de 13C literatura para o
Ergosterol (SHIRANE, et al., 1996).
(9) 13C
(SHIRANE, et al.., 1996) 13C
(9) 13C
(SHIRANE, et al., 1996) 13C
N
N
(ppm)
(ppm)
(ppm)
(ppm)
1
38,4
38,3
15
23,0
23,0
2
31,9
32,0
16
28,3
28,2
3
70,4
70,4
17
55,7
55,7
4
40,7
40,8
18
12,0
12,0
5
139,8
139,8
19
16,3
16,2
6
119,6
119,6
20
40,4
40,4
7
116,3
116,3
21
21,1
21,1
8
141,3
141,3
22
135,6
135,5
9
46,3
46,2
23
132,0
132,0
10
37,0
37,0
24
42,8
42,8
11
21,1
21,1
25
33,0
33,1
12
39,1
39,1
26
19,9
19,9
13
42,8
42,8
27
19,6
19,6
14
54,6
54,5
28
17,6
17,6
4.3.1.10 Identificao Estrutural do Perxido de Ergosterol (10)
O espectro de RMN de 1H de (10) (Tabela 15: p. 88, Figura 138, p. 193) apresenta
sinais de hidrognios alifticos, metlicos, carbinlicos e vinlicos. A presena de um duplo
duplo duplo dubleto em H 3,96 (1H, dddd, J= 5,1/6,5/11,0 e 11,5 Hz, H-3), evidencia o
hidrognio metnico carbinlico. Os dois dubletos em H 6,23 (1H, d, J= 8,5 Hz, H-6) e H
6,48 (1H, d, J= 8,5 Hz, H-7) apresentam constantes de acoplamento caracterstica de dupla
ligao em cis, enquanto os dois duplos dubletos em H 5,21(1H, dd, J= 7,5 e 15,6 Hz, H-22)
e 5,14 (1H, dd, J= 8,1 e 15,6 Hz, H-23), apresentam constantes de acoplamento caracterstica
de dupla ligao em trans. Na regio entre H 0,75-1,10 pode-se observar a presena de dois
singletos e quatro dubletos. Os singletos em H 0,87 (3H, s, H-18) e 0,81 (3H, s, H-19) e os
dubletos em H 0,90 (3H, d, J= 6,8 Hz, H-21), 0,80-0,81 (3H, d, J= 6,8 Hz, H-26), 0,82-0,83
(J= 6,8 Hz, H-27) e 1,02 (3H, d, J= 6,6 Hz, H-28), foram atribudos aos hidrognios metlicos
No espectro de RMN de
13
C (Tabela 15: p. 88, Figura 139, p. 194) foi possvel
observar 28 tomos de carbono, sendo que quatro so olefnicos C 135,2 (C-6), 130,7 (C-7),
135,4 (C-22) e 132,3 (C-23) e trs carbinlicos C 70,4 (C-3), 82,1 (C-5) e 79,4 (C-8).
Comparao dos dados da literatura (YUE, et al, 2001) com todos os valores
encontrados no espectro de RMN de 1H e 13C da substncia 10, sugeriu tratar-se do Perxido
de Ergosterol (Figura 26, p. 88), um esteride comum em fungos (SUBBIAH;
ABPLANALP, 2003) e com atividade inibidora de clulas cancergenas em ensaios realizados
in vitro.
21
19
11
12
9
2
10
13
14
28
22
18
20
17
16
15
24
23
25
26
27
3
5
O 7
4
HO
6
Figura 26: Estrutura do Perxido de Ergosterol (10)
Tabela 15: Dados de RMN de 13C do Perxido de Ergosterol (10) (CDCl3 a 11,7 T) e dados de RMN de 13C
literatura para o Perxido de Ergosterol (YUE, J. M. et al, 2001)
1
H ppm (multip., J=
(10) 13C YUE, J. M.
YUE, J. M.
1
H ppm (multip., J=
(10) 13C
N
N
Hz)
(ppm)
et al, 2001
et al, 2001
Hz)
(ppm)
13
13
C (ppm)
C (ppm)
1
30,1
30,2
15
1,48 (m)
23,4
23,4
2
1,67 (m)
34,7
34,8
16
1,31 (m)
28,6
28,6
3,96 (oct,
66,5
56,3
3
66,5
17
1,20 (m)
56,3
5,1/6,5/11,0/11,5)
4
1,21 (m)
39,4
39,4
18
0,81 (s)
12,9
12,9
5
82,1
82,1
19
0,87 (s)
18,2
18,2
6
6,23 (d, 8,5)
135,2
135,2
20
1,92 (m)
39,7
39,6
7
6,48 (d, 8,5)
130,7
130,8
21
0,90 (d, 6,9)
20,9
20,9
8
79,4
79,4
22
5,21 (dd, 7,5, 15,6)
135,4
135,4
9
1,47 (m)
51,1
51,2
23
5,14 (dd, 8,1, 15,6)
132,3
132,4
10
37,0
37,0
24
1,83 (m)
42,8
42,8
11
0,98 (d, 6,6)
20,6
20,7
25
2,30 (m)
33,1
33,1
12
2,0 (m)
36,9
37,03
26
0,80 (d, 6,8)
19,6
19,6
13
44,6
44,6
27
0,82 (d, 6,8)
19,9
19,9
14
1,57 (m)
51,7
51,8
28
1,00 (d, 6,6)
17,5
17,6
4.3.2 Elucidao Estrutural das Substncias Produzidas por Mc-7F

4.3.2.1 Identificao Estrutural da Uracila (11)
O espectro de RMN de 1H de (11) (Tabela 16: p. 89, Figura 142, p. 197) apresentou
apenas dois sinais em H 5,43 (1H, d, J= 7,5 Hz, H-5), e 7,35 (1H, d, J= 7,5 Hz, H-6).
A grande diferena de deslocamento qumico observado para estes dois hidrognios
sugere que estejam em vizinhana qumica muito diferenciada, como em hidrognios
localizados nas posies , de uma carbonila , insaturada, com constantes de
acoplamento caractersticas de uma dupla ligao em cis.
O espectro de RMN de 13C (Tabela 16: p. 89, Figura 143, p. 198) observados sinais em
C 151,5 (C-2), 164,3 (C-4), 100,2 (C-5) e 142,1 (C-6) destes, dois so quaternrios e dois
metnicos.
13
13
C - gHMQC - 1JCH), (Tabela 16: p. 89, Figura 144, p. 199), foi

Atravs dos mapas de contorno dos experimentos de gHMBC (Figura 145, p. 200),
onde foi possvel visualizar as correlaes a curta e longa distncia 2JCH e 3JCH entre H-5C4/C-6 e H-6C-2/C-4, comparao com dados da literatura (BLICHARSKA; KUPKA, 2002)
permitiu atribuir para a substncia (11) a estrutura da uracila (Figura 27, p. 89). Existe uma
vasta literatura sobre atividades biolgicas da uracila, mas sempre associada a outras
molculas como acares, aminocidos, protenas etc. Nos ensaios biolgicos realizados no
foi detectada nenhuma atividade.
O
5
6
3N
Figura 27: Estrutura da Uracila (11)
Tabela 16: Dados de RMN de 1H, 13C, gHMBC e gCOSY da Uracila (11) (DMSO-d6 a 11,7 T)
1
13
N
C
gHMBC
NH-1
10,95 (s)
2
151,5
NH-3
10,79 (s)
4
164,3
5
5,43 (d, 7,5)
100,2
C-4/C-6
6
7,35 (d, 7,5)
142,1
C-2/C-4/C-5
gCOSY
H-6
H-5
4.3.2.2 Identificao Estrutural do ciclo-(S*-Pro-S*-Tyr) (12)
O espectro de RMN de 1H de (12) (Tabela 17: p. 92, Figura 147, p. 202) apresentou
dois dubletos em H 7,03 (2H, d, J= 8,1 Hz, H-2) e 6,62 (2H, d, J= 8,3 Hz, H3) indicando
um sistema de anel aromtico para-dissubstitudo. A presena do sinal em C 155,8 (C-4).
No espectro de RMN de 13C (Tabela 17: p. 92, Figura 148, p. 203) indicou a presena de um
grupo (OH) ligado a carbono do anel aromtico, evidenciando a presena do resduo do
aminocido Tirosina (Tyr). O espectro de gCOSY (Figura 151, p. 206) apresentou
correlaes entre os hidrognios benzlicos H-10H-9 (H
2,94 e 4,23), demonstra a
possibilidade da presena da unidade de Tyr. Considerando que os hidrognios H-10 so

diastereotpicos, a multiplicidade esperada seria de dois duplos dubletos o que visualizado
no espectro de RMN de 1H (Tabela 17: p. 92, Figura 147, p. 202), tal fato suportado pela
observao em gHMQC duas correlaes para este mesmo valor de carbono.
O espectro de RMN de 13C (Tabela 17: p. 92, Figura 148, p. 203) apresentou sinais em
C 165,0 (C-1) e 168,0 (C-7) indicando os grupos (CONH), que aliado aos deslocamentos
qumicos de RMN de 1H em H 4,03 (1H, ddl, J= 6,4 e 9,3 Hz, H-6) e 4,23 (1H, t, J= 4,2 Hz,
H-9) conduziram a presena de um anel dicetopiperaznico (JAYATILAKE, et al., 1996)
Anlise detalhada dos experimentos de RMN de 1H,
13
C, gHMQC, gCOSY e gHMBC
(Figura 147 a Figura 150, pgs.202 a 205) evidenciaram a presena do resduo Prolina (Pro)
nesta molcula (JAYATILAKE, H. et al., 1996).
A analise dos mapas de contorno gHMQC de (12) permitiu atribuir os hidrognios aos
respectivos tomos de carbono (Tabela 17: p. 92,Figura 149, p. 204).
O sinal em H 7,78 (s) no experimento de RMN de 1H foi atribudo ao (NH-8) uma vez
que no apresentou correlao direta com o tomo de carbono em gHMQC, mas mostra
correlao a longa distncia por gHMBC com C-6 (C 58,3) e C-1 (C 165,0)
A configurao relativa de (12) foi atribuda com base na interao espacial observada
no experimento de NOESY-1D (Tabela 17: p. 92, Figura 152, p. 207), entre H-6H-9
colocando-os no mesmo plano da molcula.
O espectro de massas de baixa resoluo (Figura 153, p. 208), obtido atravs da tcnica
ESI-MS (+) apresentou o on m/z 283, correspondente ao aduto [M+Na]+ e o on quasi
molecular m/z 261, [M+H]+. A massa calculada foi de 260, sugerindo frmula molecular
C14H16N2O3.
Os dados espectrais foram comparados com a literatura (JAYATILAKE, H. et al., 1996)
e permitiram identificar a substncia (12) como ciclo-(S-Pro-S-Tyr). Esta substncia
relatada como metablito de diversos fungos e bactrias como por ex., Pseudomonas
aeruginosa, uma bactria associada esponja marinha Isodictya seteira (JAYATILAKE, et
al., 1996). Os ensaios biolgicos realizados apontam para uma atividade inibidora da
acetilcolinesterase, mas sem atividade observada frente aos fungos fitopatognicos.
O
H
3
2
N
9
8N
10
2'
1'
3'
6'
5'
4'
OH
Figura 28: Estrutura ciclo-(S*-Pro-S*-Tyr) substncia (12)
Tabela 17: Dados de RMN de 1H, 13C, gHMBC e NOESY 1D da ciclo-(S*-Pro-S*-Tyr) (12) (DMSO-d6 a 11,7
T).
1
13
C
gHMBC
NOESY 1D
N
1
165,0
3
3,24 (qui, 5,7/6,5/11,5)
44,5
C-4
3,40 (dt, 8,0/11,5)
4
1,70 (m)
21,8
C-3/C-5
5
1,40 (sext, 9,3/9,7/11,0/12,5)
27,8
C-3
1,99 (sext, 5,1/6,3/6,4/12,5)
6
4,03 (ddl, 6,4/9,3)
58,3
C-5/C-7
H-5/H4//H-9
7
168,8
9
4,23 (tl, 4,5)
56,0
C-10/C-1/C-1
H-10/H-6/H2/NH-8
10
2,90 (dd, 4,5/14,0)
34,7
C-9/C-2/C-1/C-1
2,94 (dd, 4,5/14,0)
1
127,0
2
7,03 (d, 8,1)
130,7
C-4/C-6/C-3e 5/C-10
3
6,62 (d, 8,3)
114,7
C-1/C-4
4
155,8
5
6,62 (d, 8,3 Hz)
114,7
C-1/C-4
6
7,03 (d, 8,1Hz)
130,7
C4/C-2/C-3e 5/C-10
NH-8
7,78 (s)
C-6
4.3.2.3 Identificao Estrutural do ciclo-(S*-Pro-S*-Val) (13)
A substncia (13) foi submetida anlise detalhada dos espectros de RMN de 1H e 13C
(uni e bidimensionais) e os hidrognios foram atribudos aos respectivos tomos de carbono
pela anlise de gHMQC (Figura 156, p. 211).
A anlise dos espectros de RMN de 1H e 13C mostrou a presena de dois hidrognios
em H 4,10 (C 58,2; 1H, tl, J= 7,5 Hz, H-6) e H 3,89 (C 59,4; 1H, sl, H-9) e duas carbonilas
em C 165,1 e 170,1 caractersticos de anel dicetopiperaznico.
A presena de trs multipletos (3,33; 3,40 e 1,75-1,85) referentes aos hidrognios
metilnicos, observados no espectro de RMN de 1H (Tabela 18: p. 94, Figura 154, p. 209),
aliado as correlaes em gCOSY (Figura 158, p. 213) entre H-3H-4H-5 indicaram a
presena do resduo de aminocido Prolina na estrutura (FDHILA et al., 2003).
O espectro de RMN de 1H (Tabela 18: p. 94, Figura 154, p. 209) apresentou ainda
dois dubletos em H 0,84 (3H, d, J= 6,7 Hz) e 1,00 (3H, d, J= 7,2 Hz), que foram atribudos
aos hidrognios metlicos (H-11 e H-12) em multipleto em H 2,30-2,36 (m, H-10) que foi
atribudo a H-10. O espectro de gCOSY (Figura 158, p. 213), mostrou correlao dos
hidrognios metlicos (H-11 e H-12) com um hidrognio metnico em H 2,30-2,36 (m, H-10;
C 27,7) e evidenciou uma unidade isopropila , indicando o aminocido Valina como um dos
componentes desta substncia (13).

A ausncia de correlao gHMQC (Figura 156, p. 211) do sinal em H 7,91,
evidenciou que este hidrognio esteja ligado a tomos de nitrognio ou oxignio.
As correlaes a longa distncia observadas em gHMBC (Tabela 18: p. 94, Figura 157, p.
212) de H 7,91 com os carbonos em C-6 58,2 e C-7 165,1, permitiram atribuir este
deslocamento ao (NH-8).
Baseando-se nos espectros e nas correlaes e nas correlaes observadas nos
experimentos uni e bidimensionais, foi proposto que a substncia (13) uma dicetopiperazna
constituda pelos aminocidos Prolina (Pro) e Valina (Val).
A configurao relativa de (13) foi determinada pela anlise do espectro de NOESY1D (Tabela 18: p. 94, Figura 159, p. 214) onde foi observada a interao espacial entre os
hidrognios H-9H-6 colocando-os no mesmo plano espacial da molcula. Comparao com
dados da literatura (FDHILA, et al., 2003), confirmou esta proposta.
O espectro de massas de baixa resoluo ESI-MS (+) (Figura 160, p. 215), apresentou o
pico do on pseudo molecular com m/z 197 [M+H]+ e pico em m/z 219, correspondente a
formao do aduto com sdio [M+Na]+. A massa calculada foi de 196, sugerindo frmula
molecular C10H16N2O2 esto coerentes com a estrutura proposta (Figura 29, p. 93)
confirmando.
11
O
2
1
7
H
9
8
10
12
NH
O
Figura 29: Estrutura da ciclo-(S*-Pro-S*-Val) para substncia (13)
H relato (GARCIA-PAJN; COLLADO, 2003) da produo deste metablito pelo

fungo Colletotrichum gloeosporioides exatamente o mesmo fungo de onde foi isolada esta
substncia, e por outros fungos deste gnero. Esta substncia relatada como fitotxica e
como um bioerbicida em potencial. Nossos ensaios biolgicos apontam para uma atividade
inibidora da acetilcolinesterase e uma atividade mediana frente aos fungos fitopatognicos C.
cladosporioides e C. sphaerospermum.
Tabela 18: Dados de RMN de 1H, 13C, gHMBC e NOESY 1D da ciclo-(S*-Pro-S*-Val) (13) (DMSO-d6 a 11,7
T)
1
13
C ppm
gHMBC
NOESY 1D
N
1
170,1
3
3,33 (m)
44,5
C-4/C-5/C-6
3,40 (m)
4
1,75-1,85 (m)
22,0
C-5/C-3/C-6
5
1,75-1,85 (m)
27,8
C-4/C-3/C-6
6
4,10 (tl, 7,5)
58,2
C-5/C-1
3,89/2,10
7
165,1
9
3,89 (sl)
59,4
C-12/C-10/C-7
4,10/2,30/1,00/0,84
2,10-2,15 (m)
27,7
C-12/C-11/C-1
10
2,30-2,36 (m)
11
1,00 (d, 7,2)
18,2
C-12/C-10/C-9
12
0,84 (d, 6,7)
16,4
C-11/C-10/C-9
NH-8
7,90
C-6/C-7
4.3.2.4 Identificao Estrutural de cido-(2-Amino-fenil)-actico (14)
A substncia (14) foi submetida espectrometria de massas (Figura 166, p. 221),

utilizando-se a tcnica ESI-MS (+) e apresentou o pico base m/z 107 indicando a formao do
fragmento [M+H-CO2]+. A massa calculada foi de 151, sugerindo frmula molecular
C8H9NO2.
O espectro de RMN de 1H (Tabela 19: p. 95, Figura 161, p. 216) apresentou dois duplo
tripletos em H 7,15 (1H dt, J= 7,7 e 1,1 Hz, H-4) e 6,89 (1H, dt, J= 7,5 e 0,7 Hz, H-5),
caracterstico de sistema aromtico orto substitudo, ainda nesta regio do espectro apresentou
dois dubletos em H 7,28 (1H, d, J= 7,4 Hz, H-3) e 6,75 (1H, d, J= 7,8 Hz, H-6) confirmando
a existncia do sistema aromtico. Foi observado tambm um sinal em H 2,73 (2H, d, J=
15,0 Hz H-7), caracterstico de grupo metilnico vizinho a carbonos quaternrios.
13
C (Tabela 19: p. 95, Figura 162, p. 217) apresentou um
sinal em C 178,2 (C-8) caracterstico de carbonila cida, e sinais dos carbonos aromticos em
C 134,0 (C-1), 142,2 (C-2), 123,8 (C-3), 128,7 (C-4), 121,1 (C-5), e 109,2 (C-6). O espectro
mostrou ainda um sinal em C 41,8 (C-7) caracterstico de carbono benzlico carbonlico.

13
(correlaes diretas 1H x 13C - gHMQC - 1JCH), (Tabela 19: p. 95), pudemos atribuir todos os
hidrognios aos respectivos tomos de carbono.
Atravs dos experimentos bidimensionais de gHMBC (Tabela 19: p. 95, Figura 164,
p. 219) foi possvel visualizar as correlaes a curta e longa distncia 2JCH e 3JCH entre H3C-2/C-4, H-4C-3/C-2, H-5C-1/C-6, H-6C-1/C-5 e H-7C-8. Estes dados aliados
aos deslocamentos dos carbonos e hidrognios permitiram propor a estrutura da substncia
(14) como sendo o cido-(2-Amino-fenil)-actico (Figura 30, p. 95). Nenhum relato de
atividade biolgica foi encontrado na literatura, sendo que em nossos ensaios tambm no foi
observada nenhuma atividade frente aos fungos patognicos, mas a apresentou atividade
inibidora da acetilcolinesterase.
NH 2
3
4
2
5
1
6
OH
8
Figura 30: Estrutura da cido-(2-Amino-fenil)-actico para substncia (14)
Tabela 19: Dados de RMN de 1H, 13C e gHMBC cido-(2-Amino-fenil)-actico (14) (DMSO-d6 a 11,7 T).
1
13
N
C, ppm
gHMBC
1
134,0
2
142,2
3
7,28 (d, 7,4)
123,8
C-2/C-4
4
7,15 (ddd, 7,6/7,8/1,1)
128,7
C-2/C-3
5
6,89 (ddd, 7,4/7,6/0,7)
121,1
C-1/C-6
6
6,75 (d, 7,8)
109,2
C-1/C-5
7
2,73 (d, 15,0)
41,8
C-8
8
178,2
4.3.2.5 Identificao Estrutural de cido-(4-Hidroxi-fenil)-actico (15)
A substncia (15) foi submetida espectrometria de massas baixa resoluo (Figura

172, p 227), utilizando-se a tcnica ESI-MS (+) e apresentou o pico com m/z 175,
correspondente ao aduto com sdio [M+Na]+, o pico em 197 (100%) pode corresponder a
troca do hidrognio cido por sdio apresentando-se como um sal sdico formando aduto com
sdio [NaM+Na]+. A massa calculada foi de 152 sugerindo a frmula molecular C8H8O3.
O espectro de RMN de 1H (Tabela 20: p. 97, Figura 167, p. 222) apresentou dois
dubletos em 7,02 (2H, d, J= 8,5 Hz, H-2/H-6) e 6,68 (2H, d, J= 8,5 Hz, H-3/5),
caractersticos de sistema aromtico para-substitudo. O espectro apresentou ainda um
singleto em H 3,40 (s) que foi atribudo a um metileno benzilico com ajuda do experimento
de DEPT (Figura 169, p. 224)
13
C (Tabela 20: p. 97, Figura 168, p. 223), apresentou um
sinal em C 156,0 (C-4) caracterstico de carbono fenlico, dois sinais em C 130,2 (C-2/6) e
C 115,1 (C-3/5) atribudos a dois carbonos metnico sp2 e uma carbonila em C 173,2 que foi
visualizada no experimento de gHMBC (Tabela 20: p. 97, Figura 171, p. 226).

13
13

As correlaes observadas nos experimentos bidimensionais de gHMBC (Tabela 20:
p. 97, Figura 171, p. 226), a curta e longa distncia 2JCH e 3JCH entre H-7C-1/C-2/C-8, e H2/6(C-3/5)/C-4/C-7 e H-3/5C-1/C-4, permitiu propor a estrutura da substncia (15)
(Figura 31, p. 97) como sendo o cido-(4-Hidroxi-fenil)-actico. Esta substncia avaliada em
conjunto com mais 20 substncias extradas da planta Vulpia myuros, apresenta atividade
aleloptica mediana e colabora para a atividade do extrato da planta 2,63% de atividade (AN;
PRATLEY; HAIG, 2001).
3
4
HO
2
5
1
6
OH
Figura 31: Estrutura da cido-(4-Hidroxi-fenil)-actico para substncia (15)
Tabela 20: Dados de RMN de 1H, 13C e gHMBC cido-(4-Hidroxi-fenil)-actico (15) (DMSO-d6 a 11,7 T)
1
13
N
C, ppm
gHMBC
1
125,2
2
7,02 (d, 8,5)
130,2
C-3 e 5/C-4/C-6/C-7
3
6,68 (d, 8,5)
115,1
C-1/C-4/C-5
4
156,0
5
6,68 (d, 8,5)
115,1
C-1/C-3/C-4
6
7,02 (d, 8,5)
130,2
C-2/C-3 e 5/C-4/C-7
7
3,40 (s)
40,1
C-1/C-2/C-8
8
173,2
-
4.3.2.6 Identificao Estrutural de 4-Hidroxi-benzamida (16)
dubletos em H 6,79 (2H, d, J= 8,5 Hz, H-3/5) e 7,76 (2H, d, J= 8,6 Hz, H-2/6), com
multiplicidades e constantes de acoplamento caractersticas de sistema aromtico para
substitudo.
13
C (Tabela 21: p. 98, Figura 174, p. 229), apresentou um
sinal em C 161,3 (C-4) caracterstico de carbono fenlico. Os sinais dos carbonos em C

131,3 (C-2/6) e 115,0 (C-3/5) apresentaram o dobro da intensidade, confirmando a presena
de um sistema aromtico para-substitudo.
Pela anlise do experimento de gHMBC (Tabela 21: p. 98, Figura 176, p. 231) foi
visualizado um carbono C 167,1 atribudo a uma carbonila de amida.
13
13

p. 98, Figura 176, p. 231), permitiu visualizar as correlaes a curta e longa distncia 2JCH e
3
JCH entre H-2/6C-4/C-7 e entre H-3/5C-1/C-4 apontando a presena de um carbono
aromtico em C 122,0 (C-1), Estes dados em conjunto com os deslocamentos dos carbonos e
hidrognios, permitiu propor a estrutura da substncia (16) como sendo a 4-Hidroxibenzamida (Figura 32, p. 98). Segundo Thakur, et al., 2004 esta substncia tem atividade
media frente clulas leucmicas in vitro confirmando a atividade terica em QSAR.
HO
NH2
1
Figura 32: Estrutura da 4-Hidroxi-benzamida para substncia (16)
Tabela 21: Dados de RMN de 1H, 13C e gHMBC 4-Hidroxi-benzamida (16) (DMSO-d6 a 11,7 T)
1
13
N
C
gHMBC
COSY
1
122,0
C-4/C-6/C-7
H-3 e 5
2
7,76 (d, 8,6)
131,3
C-1/ C-4/C-5
H-2 e 6
3
6,79 (d, 8,5)
115,0
4
5
6,79 (d, 8,5)
161,3
115,0
C-1/C-3/C-4
H-2 e 6
6
7
7,76 (d, 8,6)

-
131,3
167,1
C-2 e 6/C-4/C-7
H-3 e 5
4.3.2.7 Identificao Estrutural do cido-(2-Hidroxi fenil)-actico (17)

182, p. 237), utilizando-se a tcnica ESI-MS (+), e apresentou o pico com m/z 191, indicando
a formao do aduto com potssio [M+K]+, foi observado ainda a formao do aduto com
sdio em 175 [M+Na]+ e a presena do sal sdico com aduto com sdio em 197 (100%)
[NaM+Na]+. A massa calculada foi de 152 sugerendo a frmula molecular C8H8O3.
O espectro de RMN de 1H (Tabela 22: p. 100, Figura 177, p. 232) apresentou um duplo
dubleto em H 7,07 (1H, dd, J= 1,2 e 7,5 Hz, H-3), um duplo tripleto em H 7,03 (1H, dt, J=
1,6 e 7,5 Hz, H-4), um tripleto em H 6,70 (1H, t, J= 7,5 Hz, H-5) e um dubleto em H 6,76
(1H, d, J= 7,5 Hz, H-6), caractersticos de sistema aromtico orto-substitudo. O espectro

apresentou ainda um singleto em H 3,45 (2H, s, H-7) o que com o auxlio dos experimentos
de RMN de
13
C e DEPT (Figura 179, p. 234) demonstrou se tratar de um CH2, carbinlico
benzlico.
13
C (Tabela 22: p. 100, Figura 178, p. 233) apresentou um
sinal em C 172,8 (C-8) caracterstico de carbonila de cido, quatro carbonos metnicos sp2
em C 131,0 (C-3), 127,7 (C-4), 114,8(C-5) 118,7 (C-6) e dois carbonos quaternrios em C
121,9 (C-1) e 155,4 (C-2) caractersticos de anel aromtico orto-substitudo. Foi visualizado
tambm um metileno em C 35,5 atribudo C-7.
13
(correlaes diretas 1H x 13C - gHMQC - 1JCH), (Tabela 22: p. 100, Figura 180, p. 235), foi
p. 100, Figura 181, p. 236), permitiu visualizar as correlaes a curta e longa distncia 2JCH e
3
JCH entre H-3C-2/C-4, H-4 C-2/C-3, H-5C-1/C-4, H-6C-1/C-2/C-7 e H-7 C-1/C-
2/C-3/C-8. Estes dados, em conjunto com os deslocamentos e multiplicidades caractersticas

dos carbonos e hidrognios permitiu propor a estrutura da substncia (17) como sendo o
cido-(2-hidroxi-fenil)-actico (Figura 33, p. 99). Apesar de no se ter encontrado dados
sobre atividade biolgica desta substncia na literatura esta apresentou uma forte atividade
frente Cladosporium sphaerospermum e C. cladosporioides e atividade inibidora da
acetilcolinesterase.
OH
3
4
2
5
1
6
OH
8
Figura 33: Estrutura da cido-(2-Hidroxi fenil)-actico para substncia (17)
Tabela 22: Dados de RMN de 1H, 13C e gHMBC cido-(2-Hidroxi fenil)-actico (17) (DMSO-d6 a 11,7 T)
1
13
N
C
gHMBC
1
121,9
2
155,4
3
7,07 (dd, 1,6 e 7,5)
131,0
C-2/C-4
4
7,03 (dt, 1,6 e 7,5)
127,7
C-2/C-3
5
6,70 (t, 7,5)
114,8
C-1/C-4
6
6,76 (d, 8,0)
118,7
C-1/C-2/C-7
7
3,45 (s)
35,5
C-1/C-2/C-3/ C-8
8
172,8
-
4.3.2.8 Elucidao Estrutural de (18)
A substncia (18) foi submetida espectrometria de massas de alta resoluo (Figura

190, p. 245), atravs tcnica ESI-MS (+) e apresentou o pico do on molecular m/z 265,119
sugerindo ser o ion quasi molecular [M+H]+, e a fragmentao em 212,080 sugerindo que o
fragmento formou aduto com potssio [C10H9N2O+K]+. A massa calculada foi de 264,126
sugerindo a frmula molecular C17H16N2O.
dubletos em H 7,36 (1H, d, J= 8,0 Hz, H-6) e 7,49 (1H, d, J= 8,0 Hz, H-9) e dois tripletos
largos em H 7,08 (1H, tl, J = 7,6 Hz, H-7) e 6,99 (1H, tl, J = 7,6 Hz, H-8), que foram
atribudos a um anel aromtico dissubstitudo em posio orto.
Os outros sinais em H 7,27 (2H, m, H-14/18), 7,30 (2H, m, H-15/17), e 7,24 (1H, m,
H-16), foram atribudos ao sistema aromtico mono-substitudo. Foram observados ainda dois
singletos em H 3,74 (3H, s, H-11) com valor caracterstico de hidrognio metlico ligado ao
nitrognio e H 3,60(2H, s, H-12), atribudo ao hidrognio metilnico ligado a carbono
carbonlico de amida anel aromtico. O singleto em H 10,90 (s), foi atribudo a NH.
13
C (Tabela 23: p. 102, Figura 184, p. 239) apresentou 18
sinais de carbonos sendo 12 auferidos aos anis aromticos com deslocamentos em C 129,7
(C-4), 136,1 (C-5), 111,4 (C-6), 121,0 (C-7), 118,5 (C-8), 118,4 (C-9), 130,2 (C-13), 129,7
(C-14/18), 128,3 (C-15/17), 124,0 (C-16). Observou-se ainda um sinal em C 172,0 (C-10)
pode ser de carbonila de amida e outros sinais em C 51,5 (C-12) e 30,5 (C-11) que com o
auxlio dos experimentos de DEPT (Figura 185, p. 240) demonstrou se tratar de uma metila
ligada a nitrognio e um CH2 carbonila de amida.
13
(correlaes diretas 1H x 13C - gHMQC - 1JCH) (Tabela 23: p. 102, Figura 186, p. 241) todos
os hidrognios foram atribudos aos respectivos tomos de carbono.
Com base em todos os dados obtidos e uma criteriosa anlise nos mapas de contorno dos
experimentos bidimensionais gHMBC (Tabela 23: p. 102, Figura 187, p. 242), foi possvel
propor as estruturas parciais A e B para a substncia (18) (Figura 34, p. 101).
11
CH3
9
4
N
10
5
6
Estrutura Parcial A
12
14
15
13
16
18
17
Estrutura Parcial B
Figura 34: Estruturas Parciais A e B da Substncia (18)
A conexo entre as estruturas parciais A e B foi realizada com auxilio do experimento

bidimensional gHMBC (Tabela 23: p. 102, Figura 187, p. 242) com o qual foi possvel
visualizar a correlao a longa distncia 2JCH e 3JCH entre H-11C-10 e H-11C-3/C-2.
Deste modo foi possvel propor para a substncia (18) (Figura 35, p. 102) como sendo uma
substncia indita de acordo com o sistema SciFinder Scholar na data de 10 de agosto de
2007.
A localizao dos hidrognios H-11 e H-12 foi estabelecida com base nas informaes
obtidas no espectro unidimensional de NOESY-1D e gHMBC (Tabela 23: p. 102, Figura
189, p. 244 e Figura 187, p. 242).
11
CH3
9
4
8
7
5
6
3
1
14
12
10
15
13
18
16
17
Figura 35: Principais correlaes observadas em gHMBC para a substncia (18)

Tabela 23: Dados de RMN de 1H, 13C e gHMBC da Substncia (18) (DMSO-d6 a 11,7 T)
13
N 1H ppm (multip., J= Hz)
C
gHMBC
NOESY 1D
2
7,24 (m)
127,0
C-3/C-5
3
107,0
4
129,7
5
136,1
6
7,36 (d, 8,0)
111,4
C-2/C-8
7
7,08 (tl,7,6)
121,0
C-5/C-9
8
6,99 (tl, 7,6)
118,5
C-2/C-6
9
7.49(d, 8,0)
118,4
C-5/C-7
10
172,0
11
3,74 (s)
30,5
C-3/ C-2/C-10
H-2/H-9
12
3,60 (s)
51,5
C-10/C-14/C-18
13
130,2
14
7,27 (m)
129,2
C-15
15
7,30 (m)
128,3
16
7,24 (m)
124,0
17
7,30 (m)
128,3
18
7,27 (m)
129,2
10,90 (s)
N
C-2/C-3/C-5
H-2/H-6
4.3.2.9 Elucidao Estrutural de (19)
A substncia (19) foi submetida espectrometria de massas de alta resoluo (Figura

198, p. 253) utilizando-se a tcnica ESI-MS (+) e apresentou o pico m/z 302,134 (100%)
sugerindo a formao do aduto com sdio [M+Na]+. A massa calculada foi de 279,125
sugerindo a frmula molecular C18H17NO2.
tripletos em H 6,97 (1H, t, J = 7,5 Hz, H-8) e H 7,08 (1H, t, J = 7,5 Hz, H-7) e dois dubletos
em H 7,42 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-9) e H 7,37 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-6) atribudos ao anel
aromtico dissubstitudo em posio orto da parte indlica da molcula. Os dubletos H 7,14
(2H, d, J = 6,7 Hz, H-15/19) e H 7,26 (2H, d, J = 7,5 Hz, H-16/18) foram atribudos ao
sistema aromtico mono-substitudo, nesta regio observou-se ainda os multipletos em H
7,18 (1H, m, H-17) e H 7,22 (1H, m, H-10). O singleto em H 3,70 (3H, s, H-10) corresponde
aos hidrognios metilnicos carbonila, o tripleto em H 2,87 (2H, t, 6,8 Hz, H-13),
corresponde ao metileno benzlico um duplo tripleto em H 4,24 (2H, dt J= 1,2 e 6,8 Hz, H12), corresponde a outro metileno com deslocamento caracterstico de hidrognios ligados a
carbono carbinlico. Observou-se ainda o singleto H 10,90, atribudo a -NH.
13
C (Tabela 24: p. 104, Figura 192, p. 247) apresentou 19
sinais de carbono onde 6 foram auferidos a anel aromtico orto substitudo em C 126,3 (C-4),
136,1 (C-5), 111,4 (C-6), 121,0 (C-7), 118,50 (C-8) e 118,4 (C-9) e 6 foram auferidos ao anel
aromtico mono-substitudo em C 138,0 (C-14), e 124,0 (C-17) destes, dois com intencidades
duplicadas correspondendo aos carbonos em C 128,8 (C-15/19), 128,3 (C-16/18). O espectro
apresentou ainda um sinal em C 171,4 (C-11) sugerindo ser uma carbonila de ster e um sinal
em C 64,6 (C-12), caracterstico de carbono metilnico ligado a oxignio. Os sinais em C
34,3 (13) e 30,8 (10) correspondem aos grupos metilnico e metlico ligados em carbonos sp2,
com o auxlio dos experimentos de DEPT (Figura 193, p. 248) foi possvel atribuir todos os
carbonos metilnicos.
Pela anlise conjunta dos dados de RMN de 1H, 13C e os mapas de contorno gHMQC
(correlaes diretas 1H x 13C - gHMQC - 1JCH) (Tabela 24: p. 104, Figura 194, p. 248) todos
os hidrognios foram atribudos aos respectivos tomos de carbono. Com base em todos os
dados obtidos e uma criteriosa anlise nos mapas de contorno dos experimentos
bidimensionais gHMBC (Tabela 24: p. 104, Figura 195, p. 250) foi possvel visualizar a
correlao a longa distncia 2JCH e 3JCH entre H-12C-11, e definiu a conexo entre as
estruturas parciais A e B (Figura 36, p. 104). Deste modo foi possvel propor para a
substncia em questo a estrutura (19) (Figura 37, p. 104), indita segundo o sistema
SciFinder Scholar, na data de 10 de agosto de 2007
A localizao dos hidrognios H-2, H-10 e H-12 foi estabelecida com base nas
informaes obtidas no espectro unidimensional de NOESY-1D (Tabela 24: p. 104, Figura
197, p. 252)
9
8
10
11
7
6
15
14
16
12
13
H
Estrutura Parcial A
19
17
18
Estrutura Parcial B
Figura 36: Estruturas Parciais A e B da Substncia (19)
9
8
10
11
13
14
15
16
12
7
6
19
17
18
H
Figura 37: Principais correlaes observadas em gHMBC para a substncia (19)
Tabela 24: Dados de RMN de 1H, 13C e gHMBC da Substncia (19) (DMSO-d6 a 11,7 T)
1
13
N
C
gHMBC
NOESY 1D
2
7,18 (m)
127,0
C-10
3
106,9
4
126,3
5
136,1
6
7,35 (d, 8,0)
111,4
C-2/C-8
7
7,08 (t, 7,5)
121,0
C-5/C-8
8
6.97 (t, 7,5)
118,5
C-4/C-6
9
7.42 (d, 8,0)
118,4
C-5/C-7
10
3,70 (s)
30,8
C-2/C-3/C-11
H-2/H-9
11
171,4
12
4,24 (dt,1,2/6,8)
64,6
C-11/C-13/C-14
H-13/H-15
13
2,87 (t, 6,8)
34,4
C-12/ C-14/C-15/C-19
H-12/H-2
14
138,0
15
7,14 (d, 6,7)
128,8
C-13/C-15 e 19
16
7,26 (d, 7,5)
128,3
C-14/C-16 e 18
17
7,18 (m)
124,0
18
7,26 (d, 7,5)
128,3
C-14/C16/C-18
19
7,14 (d, 6,7)
128,8
C-13/C-15/C-19
10,90 (s)
N
C-6
H-2/H-6
4.3.3 Elucidao Estrutural da Substncia Produzida por Mc-3C Xylaria sp.

4.3.3.1 Identificao Estrutural do dicido cido 2-hexilideno-3-metilsuccnico (20)
A substncia (20) foi submetida espectrometria de massas (Figura 205, p. 260) com a
tcnica ESI-MS (+) e apresentou o pico m/z 237 (100%) indicando a formao do aduto
[M+Na]+. A massa calculada foi de 214 sugerindo a frmula molecular C11H18O4.
O espectro de RMN de 1H (Tabela 25: p. 106, Figura 199, p. 254) apresentou sinais
em H 1,28 (2H, m, H-2) e H 2,20 (2H, m, H3) referentes aos hidrognios alifticos, um
tripleto em H 0,87 (3H, t, J= 7,1 Hz, H-6) referente metila terminal e um quinteto em H
1,47 (2H, qui, J= 7,2 Hz, H-4) pertencente cadeia lateral hexilideno. O quarteto em H 3,59
(1H, q, J = 7,1 Hz, H-3) e o dubleto em H 1,32 (3H, d, J= 7,0 Hz, H-Me (3)) tem
multiplicidades e constantes de acoplamento caractersticos as posies onde foram
atribudos.
A configurao da insaturao 2,1 foi estabelecida com base na frmula de Pascual
(PASCUAL; MEIER; SIMON, 1966) que atribuiu valores de deslocamento qumico para o
hidrognio olefnico em aproximadamente H 6,8 e H 6,2 ppm que correspondem as formas E
e Z, respectivamente (ANDERSON; EDWARDS; WHALLEY, 1985). Para (20), o
deslocamento qumico de H-1 em H 6,97, sugere a configurao E.
O espectro de RMN de 13C (Tabela 25: p. 106, Figura 200, p. 255) mostraram sinais
caractersticos de carbonilas cidas em C 171,0 (C-1) e 179,0 (C-4). Os sinais em C 31,5 (C2), 28,8 (C-3), 28,1 (C-4) e 22,4 (C-5), foram atribudos as suas posies, baseado em seus
deslocamentos e dados obtidos nos espectros de DEPT (Figura 201, p. 256), os sinais em C
15,5 (MeC-3) e 13,9 (C-6) tem valores e multiplicidades caractersticos de metila vicinal a
carbono metnico e metilnico respectivamente.
13
(correlaes diretas 1H x 13C - gHMQC - 1JCH (Tabela 25: p. 106, Figura 202, p. 257) todos
os hidrognios foram atribudos aos respectivos tomos de carbono.
Com base em todos os dados obtidos e uma criteriosa anlise nos mapas de contorno
dos experimentos bidimensionais gHMBC (Tabela 25: p. 106, Figura 203, p. 258) foi
possvel visualizar a correlao a longa distncia 2JCH e 3JCH entre H-3C-Me (3)/C-2/C1/C-1/C-4 e H-Me (3)C-3/C-2/C-4 o confirma a posio do carbono metlico Me(3).
Observou-se ainda as correlaes entre H-1 C-1/ C-2/ C-3/C-4, H-3C-4/C-2/C-1, H4C-1/C-6 e H-6C-5/C-2.
Uma anlise das correlaes feitas a partir das correlaes citadas e gCOSY (Tabela
25: p. 106, Figura 204, p. 259) permitiu propor a estrutura para este dicido (20) como sendo
o cido 2-hexilideno-3-metilsuccnico (Figura 38, p. 106).
OH
4
3
2'
HO 1 2
1'
4'
3'
6'
5'
O
Figura 38: Estrutura do cido 2-hexilideno-3-metilsuccnico (20)
Tabela 25: Dados de RMN 1H, 13C, gHMBC, e gCOSY do cido 2-hexilideno-3-metilsuccnico (20) (CDCl3, a
11,7 T)
1
13
C (ppm)
gHMBC
COSY
N
1
171,0
2
131,3
3
3,59 (q, 7,1)
37,5
C-Me(3)/C-2/C-1/C-1/C-4
H-4/H-2
4
179,0
1
6,97 (t, 7,7)
146,9
C-4/C-3/-2/-1
H-3
2
1,28 (m)
31,5
3
2,20 (m)
28,8
C-4/C-2/C-1
H-4
4
1,47 (qui, 7,2)
28,1
C-6/C-1
H-3
5
1,27 (m)
22,4
6
0,87 (t, 7,1)
13,9
C-5/C-2
H2
Me (3)
1,32 (d, 7,1)
15,5
C-3/C-2/C-4
-
4.4 Atividade Biolgica das Fraes e Substncias Isoladas de Mc-7F e Mc-8R.

4.4.1 Avaliao da Atividade Antifngica de (1) a (19) Frente aos Fungos
Fitopatognicos Cladosporium cladosporioides e C. sphaerospermum
As substncias de (1) a (19) foram isoladas do extrato do fungo Mc-7F (Colletotrichum

gloeosporioides) e Mc-8R e testadas contra aos fungos fitopatognicos Cladosporium
cladosporioides e C. sphaerospermum, (Tabela 26: p. 107). As substncias (1), (2), (3), (5),
(6) e (8) apresentaram forte atividade contra os dois fungos, enquanto a substncia (7) e (4)
apresentaram forte atividade frente C. cladosporioides e mdia frente C. sphaerospermum, a
substncia (9) mostrou-se inativa. As substncias (16), (17) e (18) apresentaram forte
atividade frente os fungos fitopatognicos, substncia (15) apresentou forte atividade apenas
com C. cladosporioides e mdia frente C. sphaerospermum, a substncia (19) apresentou
atividade mdia com ambos os fungos e a substncia (13) apresentou fraca atividade tambm
com ambos os fungos, todas as outras substncias foram inativas (Tabela 26: p. 107) o que
pode ser melhor visualizado no Grfico 02 (Figura 39:, p. 108).
Tabela 26: Resultados da atividade antifngica das substncias isoladas do extrato de Mc-7F Colletotrichum
gloeosporioides e Mc-8R.
Substncia
Quantidade
C .cladosporioides
C. sphaerospermum
Potencial
Potencial
***/***
***/***
Pirenocinas A e B (1) e (3)
100 g
Pirenocinas A, E e B (1), (2) e (3)
***/***
***/***
100 g
Pirenocinas A, e E (1) e (2)
***/***/*
***/***/*
100 g
c Pirenochatico C (4)
***/***/*
**
100 g
c Pirenochatico A (5)
**/***
**/***
100 g
***/*/***
***/*/***
100 g
cido Pirenochatico (7)
***
**
100 g
**
***/***/*
100 g
Ergosterol (9)
i
i
100 g
Uracila (11)
i
i
100 g
ciclo-(S*-Pro-S*-Tyr) (12)
i
i
100 g
ciclo-(S*-Pro-S*-Val) (13)
*
*
100 g
cido-(2-Amino-fenil)-actico (14)
*
i
100 g
cido-(4-Hidroxi-fenil)-actico (15)
***
**
100 g
4-Hidroxi-benzamida (16)
***
***
100 g
cido-(2-Hidroxi fenil)-actico (17)
***
***
100 g
Indita (18)
***
***
100 g
Indita (19)
***
***
100 g
***
***
Nistatina
100 g
Atividade fraca = * Mdia atividade = ** Atividade forte = *** inativo = i
C.cladosporioides
2,5
C.sphaerospermum
2
1,5
0,5
0
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
(7)
(8)
(9)
0,1
(11)
(12)
(13)
(14)
(15)
(16)
(17)
(18)
(19) Ni stati n a
0,1 mg 0,1 m g 0,1 m g 0,1 mg 0,1 m g 0,1 m g 0,1 mg 0,1 m g
m g 0,1 mg 0,1 m g 0,1 m g 0,1 mg 0,1 m g 0,1 m g 0,1 m g 0,1 m g 0,1 m g 0,1m g
Figura 39: Grfico 2: Atividade antifngica das substncias (1) a (19) frente os fungos Cladosporium
cladosporioides e C. sphaerospermum
Atravs destes resultados as Substncias (13), (15), (16), (17), (18) e (19) foram
submetidas aos ensaios frente os fungos Cladosporium cladosporioides e C. sphaerospermum
em limite de deteco, estes resultados demonstraram quantidade mnima inibitria de cada
substncia. Verificou-se que as substncias (18) e (19) apresentaram as atividades
promissoras, podendo ser melhor visualizadas nas Tabela 27: e Tabela 28: pgs. 108 e 109,
Grficos 03 e 04 (Figura 40: e Figura 41:, pgs. 108 e 109).
Tabela 27: Resultados da atividade antifngica em limite de deteco das substncias isoladas do extrato de Mc7F frente o fungo Cladosporium cladosporioides
Amostras
100 g
50 g
25 g
10 g
5 g
1 g
*
i
I
i
i
i
**
i
I
i
i
i
***
*
I
i
i
i
***
**
*
i
i
i
Indita (18)
***
***
**
**
**
i
Indita (19)
**
**
*
*
*
*
Nistatina
***
***
***
***
***
***
3
2,5
2
0,1 mg
0,05 mg
0,025 mg
0,010 mg
0,005 mg
0,001 mg
1,5
1
0,5
0
13
15
16
17
18
19
Nist at ina
Figura 40: Grfico 3: Atividade antifngica das substncias isoladas de Mc-7F frente os fungos Cladosporium
cladosporioides em limite de deteco
Tabela 28: Resultados da atividade antifngica em limite de deteco das substncias isoladas do extrato de Mc7F frente o fungo Cladosporium sphaerospermum
Amostras
100 g
50 g
25 g
10 g
5 g
1 g
*
i
I
i
i
i
**
i
I
i
i
i
***
**
*
i
i
i
***
**
*
i
i
i
Indita (18)
***
***
***
***
**
*
Indita (19)
***
***
**
*
*
*
***
***
***
***
***
***
Nistatina
3
2,5
2
0,1 mg
0,05 mg
0,025 mg
0,010 mg
0,005 mg
0,001 mg
1,5
1
0,5
0
13
15
16
17
18
19
Nistatina
Figura 41: Grfico 4: Atividade antifngica das substncias isoladas de Mc-7F frente os fungos Cladosporium
sphaerospermum em limite de deteco
4.4.2 Avaliao da Atividade Inibidora da Acetilcolinesterase de (1) a (19) de

Mc-7F (Colletotrichum gloeosporioides) e Mc-8R.
Das substncias isoladas de Mc-8R (1) a (9) 60% apresentaram atividade inibidora da
acetilcolinesterase. Estes resultados indicam que o fungo em questo pode ser promissor na
produo de substncias bioativas e sero melhor visualizados na (Tabela 29: p. 110);
Grfico 05 (Figura 42:, p. 110). Para as substncias de (11) a (19) isoladas de Mc-7F os
resultados mostraram-se ainda mais promissores e 80% das substncias apresentaram
atividade inibidora da acetilcolinesterase. Estes resultados so visualizados na (Tabela 29: p.
110); Grfico 06 (Figura 42:, p. 110).
Tabela 29: Resultados dos ensaios de inibio da acetilcolinesterase das substncias isoladas.
Substncias
rf
Dose g
Pirenocinas A e B (1) e (3)
200
Pirenocinas A, E e B (1), (2) e (3)
200
200
Pirenocinas A, e E (1) e (2)
c Pirenochatico C (4)
200
0,15
200
0,14
c Pirenochatico A (5)
200
0,14
200
0,03
200
0,03
Ergosterol (9)
200
200
Uracila (11)
ciclo-(S*-Pro-S*-Tyr) (12)
200
0,93
200
0,89
200
0,92
cido-(2-Amino-fenil)-actico (14)
200
0,84
200
0,86
200
0,69
200
0,89
Indita (18)
Indita (19)
200
0,92 / 0,86
Atividade Inibidora da
Acetilcolinesterase Mc-8R
11%
Atividade Inibidora da
Acetilcolinesterase Mc-7F
44%
56%
Ativas
Inativas
Grfico 5
Ativas
89%
Inativas
Grafico 6
Figura 42: Grfico 5 e 6: Atividade inibidora da acetilcolinesterase das substncias isoladas de Mc-8R e Mc-7F
Aps analise de todos os resultados das atividades biolgicas pode-se observar que
tanto o fungo Mc-8R quanto o fungo Mc-7F so endofticos com um potencial grande na
produo de metablitos bioativos. Observa-se que a produo de cidos uma ocorrncia
comum nos endofticos isolados de Michelia champaca.
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. __________________________________5 Consideraes Finais 111
5 CONSIDERAES FINAIS
O trabalho desenvolvido com a espcie vegetal de M. champaca conduziu ao

isolamento e purificao de oito fungos endofticos, que foram cultivados em meio liqudo
CDB e forneceram os respectivos extratos brutos. A metodologia para triagem, desenvolvida
pelo grupo, para avaliar o perfil qumico por RMN1H e CLAE-DAD e a bioatividade frente
aos ensaios especficos, foi fundamental para a seleo dos extratos brutos estudados.
Todos os extratos brutos apresentaram atividade, variando de fraca a forte, contra os
fungos fitopatognicos Cladosporium sphaerospermum e C. cladosporioides, 40%
apresentaram atividade seletiva frente s linhagens mutantes de Saccharomyces cerevisiae e
87,5% atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase.
A triagem qumica e biolgica do fungo endoftico Mc-8R, seguido do estudo qumico
resultou no isolamento de substncias com diversidade estrutural notvel como as pironas,
Pirenocina A (1), E (2), B (3), dos cidos Pirenochaticos C (4), A (5), B (6), (7) e (8), os
dois ltimos inditos, do Ergosterol (9) e Perxido de Ergosterol (10). Do endfito Mc-7F,
foram isolados e identificados a Uracila (11), as dicetopiperazinas, ciclo-(S*-Pro-S*-Tyr) (12)
e ciclo-(S*-Pro-S*-Val) (13), cido-(2-Amino-fenil)-actico (14), cido-(4-Hidroxi-fenil)actico (15), 4-H droxi-benzamida (16) e cido-(2-Hidroxi fenil)-actico (17), e dois
derivados indlicos, ainda no descritos na literatura (18) e (19). Tambm foi possvel
identificar nos extratos brutos produzidos por Mc-3C e Mc-6F, os cidos 2- hexilideno-3metilsuccnico (20) e o cido 3-nitropropinico (21), respectivamente.
Os resultados obtidos com o estudo qumico biomonitorado dos fungos endofticos
selecionados Mc-8R (ainda no identificado) e Mc-7F (Colletotrichum gloeosporioides)
foram muito bons, pois das substncias isoladas 80% e 66% apresentaram atividades
antifngica, 56% e 89% apresentaram atividade inibidora da acetilcolinesterase,
respectivamente.
A identificao de Mc-8R no foi possvel pela taxonomia clssica, talvez este possa
ser um fungo pertencente ao gnero Pyrenochaeta. Esta observao baseada em dados da
literatura, onde encontrou-se que o fungo patognico Pyrenochaeta terrestris, produz
substncias da mesma classe qumica que as isoladas de Mc-8R.
O fungo endoftico Colletotrichum gloeosporioides (Mc-7F) o responsvel pela
antracnose, doena de plantas frutferas, devastando plantaes por todo o mundo. curioso
averiguar que este no causa nenhum mal a Michelia champaca, pois esta se encontra
saudvel, evidenciando a robustez da espcie.
Um levantamento bibliogrfico da literatura mostrou que os cidos Pirenochaticos
A, B, C e Pirenocina A, atuam como fitotoxinas inibindo a germinao de sementes de alface
e crescimento de mudas de arroz e cebola. As pirenocinas A, B e E so fitotxicos ao girassol
e inibem a germinao da alface.
Considerando a forte atividade antifngica contra os fungos fitopatognicos C.
cladosporioides e C. sphaerospermum apresentada pelo extrato bruto do fungo Mc-8R,
sugerimos que este possa estar atuando na proteo de M. champaca contra microrganismos
fitopatognicos a esta espcie vegetal ou ento, impedindo a entrada de outros
microrganismos.
Estes resultados so relevantes e promissores, pois evidenciam os fungos endofticos
como uma fonte de substncias com diversidade estrutural e potencialmente bioativas,
justificando a necessidade do estudo qumico desta classe de microrganismos. Esta
observao condizente com a teoria ecolgica a qual prediz que microrganismos que vivem
sob alto nvel de stress ambiental e intensas e freqentes interaes com outros
microrganismos, apresentam alta diversidade metablica.
O estudo da variao na produo metablica de Mc-8R quando cultivado em diferentes

meios liqudos e condies, indicou que o meio CDB em XAD 2 ensacado, produziu uma
excelente massa e evidenciou por RMN 1H uma variao na produo metablica (PM).
Observou-se uma PM de aproximadamente 9 vezes maior que o padro CDB, com a presena de
apenas trs substncias, quando avaliado por CLAE-DAD. Esta observao permite inferir que o
polmero XAD-2 ensacado, agiu como adsorvente, seqestrando os principais compostos
produzidos pelo endfito. Este fato impediu a biotransformao dos mesmos, pela enzinas
excretadas no meio de cultivo, resultando em uma melhor especificidade metablica.
Os dois extratos obtidos (XAD Saco e XAD Solto) apresentaram diferenas na
constituio metablica, por CLAE-DAD. Foi observado melhor desenvolvimento, maior
quantidade de miclio e massa de extrato e especificidade de substncias, quando o polmero foi
acondicionado em cartuchos de tecido. Pode-se sugerir que o microrganismo se desenvolveu
melhor na presena de uma superfcie onde possa se instalar.
De acordo com o livro Evolution and Classification of Flowering Plants, 1988, a famlia
Magnoliaceae considerada a mais primitiva de todos os vegetais encontrados no angiosperma.
Assim, Michelia champaca (Magnoliaceae) uma espcie considerada primitiva, o que pode ser
constatado pela no alterao de suas caractersticas morfolgicas durante a evoluo vegetal em
milhares de anos. Ser possvel sugerir, que o fato desta espcie no ter evoludo, esteja de algum
modo, relacionado com os microrganismos endofticos associados? Ser que as bioatividades
observadas pelas substncias isoladas de M. champaca colaboraram para robustez da espcie?
Outro fato a ser considerado, que esta espcie vegetal encontra-se monitorada e
permanece saudvel desde o isolamento dos endfitos. Nenhuma patologia, aparente, foi
constatada neste individuo, sugerindo uma relao de simbiose entre o hospedeiro e o

microrganismos (comensalismo ou mutualismo).
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ______________________________________________Curriculo 114
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Ioanis Hcristos Leptokarydis

DADOS PESSOAIS.
Endereo residencial.
Rua Dr. Luiz Nougues n 681
Tel (residencial): (019) 81366560.
E-mail: ioanlept@itelefonica.com.br
FORMAO ACADMICA.
Ps-graduao (Mestrado) em Qumica Orgnica Estudo Fitoqumico Biomonitorado
de Michelia champaca (Magnoliaceae). UNESP Araraquara, 2003.

Bacharel em Qumica (Instituto de Qumica). UNESP Araraquara, 2000.
EXPERINCIA PROFISSIONAL.
Empresa: Asca Brinquedos ind e com de brinquedos ltda
Funo: Responsvel pelas atividades relacionadas a P&D, gesto da qualidade e controle
de qualidade, certificao e incluso dos produtos junto aos rgos certificadores
Perodo: 06/2006 (emprego atual)
Empresa: Anaber Cosmticos ind e com de cosmticos ltda
Funo: Responsvel pelo departamento de P&D de novos produtos, treinamento de
tcnicos, certificao e incluso dos produtos junto aos rgos certificadores
Perodo: 03/2004 - 02/2007
Instituio: Escola Estadual Professora Lea de Freitas Monteiro
Disciplina: Qumica e Matemtica.
Perodo: 07/2003 12/2003
o Professor do Ensino Mdio.
Instituio: Escola Estadual Bento de Abreu - EEBA.
Disciplina: Qumica, Fsica e Matemtica.
Perodo: 02/2003 12/2003
o Estgio de Docncia.
Instituio: Instituto de Qumica da UNESP Araraquara.
Curso: Qumica Orgnica Experimental.
Perodo: 02/2001 07/2001.
o Monitor em Qumica Orgnica I
Instituio: Instituto de Qumica da UNESP Araraquara.
Curso: Qumica Orgnica I e II.
Perodo: 02/2000 12/2000.
IDIOMAS.
Ingls: avanado.
Espanhol: avanado.
CONHECIMENTO EM INFORMTICA.
Sistemas Operacionais: MS-DOS e WINDOWS (todos) Iniciante em LINUX.
Programas do Office: Excel, Front Page, Power Point e Word.
Outros programas: Corel Draw, ACDLabs 1D e 2D, Text Bridge, Chemwin, Chem
Office Win Zip, Vrus Scan, Adobe Acrobat, ChemSketch, Conhecimento sobre rede,
formatao e configurao de micros.
TRABALHOS DE CONCLUSO DE CURSO TCC.
Estudo
Fitoqumico
Biomonitorado
das
Sementes
de
Michelia
champaca
(Magnoliaceae), 2000.
CURSOS NA REA QUMICA
Teia do saber Titulo A gua - UNESP 2004
O Cotidiano do Ensino Mdio UNESP 2003
Didtica no Ensino Mdio UNESP, 2000.
Qumica Medicinal UNESP, 2000.
Diversidade Qumica de Plantas de Serrado e mata Atlntica e seu Potencial Biolgico
UNESP, 1999.
Lixiviao de Metais por Bactria UNESP, 1999.
Cristais Lquidos UNESP, 1997.
Cuidados no Manuseio de Substncias Qumicas em Laboratrio UNESP, 1996.
Tpicos de Produtos Naturais (1Parte) Produo de Metablitos secundrios atravs de
clulas e tecidos de plantas (2 Parte) UNESP, 1996.
PRMIOS & HONRARIAS.
Premiao por melhor trabalho da rea de Cincias Exatas do Congresso de Iniciao
Cientfica da UNESP UNESP, 2000.
Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ______________________________________________Anexos
ANEXOS
120
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
1.89
1.97
2.34
2.09
1.60
1.24
4.0
3.5
3.5
3.0
3.0
2.5
2.5
2.0
2.0
1.5
0.87
1.31
4.5
2.66
3.65
3.65
5.0
2.99
3.94
5.5
3.48
3.87
6.0
3.31
3.82
6.5
4.43
5.33
7.25
7.0
6.08
7.04
7.46
7.5
6.49
7.15
7.78
7.76
Figura 43: Espectro de RMN de 1H de Mc-1C (CDCl3 a 11,7 T)

8.0
6.76
8.00
4.53
4.83
4.31
4.92
5.17
5.05
5.41
5.88
6.14
6.49
6.68
7.39
7.68
7.67
0.98
3.02
4.62
2.01
2.18
3.47
6.78
1.64
1.34
1.30
1.24
1.33
2.64
2.63
3.91
1.05
1.08
2.15
2.06
1.31
2.07
1.07
3.92
7.25
1.5
1.0
121
Chloroform-d
1.0
0.5
0.5
122
1.30
1.33
0.87
1.31
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.0
1.5
0.86
1.0
0.5
8.0
7.5
7.0
6.0
5.5
5.0
4.0
Figura 46: Espectro de RMN de 1H de Mc-4F (CDCl3 a 11,7 T)
3.5
3.0
2.67
2.66
2.61
3.01
2.97
3.48
4.43
4.5
4.21
3.77
6.5
4.92
5.96
8.28
8.5
5.35
7.16
7.02
6.91
8.00
7.76
7.46
1.60
2.34
2.08
1.30
2.22
0.87
3.65
1.24
2.5
7.25
1.28
1.48
1.47
1.45
6.98
6.95
2.23
2.21
2.20
2.19
3.61
3.59
1.29
6.97
0.89
7.25
Chloroform-d
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
123
1.35
3.04
3.01
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
1.26
1.66
1.51
1.64
1.90
1.78
4.24
2.90
1.07
2.43
4.72
4.63
4.60
4.53
6.50
7.04
7.46
7.67
7.5
2.16
2.14
2.03
1.94
2.33
4.44
3.80
3.79
3.45
3.44
1.92
3.47
1.31
1.16
1.44
7.25
Chloroform-d
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.86
2.99
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
1.49
2.05
2.44
3.42
5.82
5.70
6.49
7.91
7.83
4.51
2.20
0.87
4.64
3.00
4.62
3.01
4.62
4.64
3.00
4.63
1.25
4.63
1.24
2.66
7.25
Chloroform-d
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
124
6.0
5.0
0.90
0.88
1.06
1.60
1.78
0.06
3.48
5.5
4.43
5.41
6.5
2.92
1.97
7.0
4.87
5.96
6.48
6.89
7.5
2.08
3.93
7.20
7.04
7.46
7.36
7.60
7.77
8.00
8.0
2.40
3.64
3.82
1.21
1.19
1.24
7.25
Chloroform-d
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
2.15
2.25
3.78
3.85
7.0
6.5
5.5
4.5
1.07
0.63
1.69
2.27
2.42
3.63
4.05
4.0
Figura 50: Espectro de RMN de 1H de Mc-8R (CDCl3 a 11,7 T)
1.35
1.95
1.95
1.94
1.94
5.0
4.27
4.56
6.0
2.94
2.71
2.81
5.47
6.30
6.27
6.79
6.17
6.12
7.87
7.80
7.53
7.42
7.5
1.41
1.06
1.40
1.23
1.22
7.25
Chloroform-d
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
125
Figura 51: Cromatograma em CLAE-DAD de Mc-8R Czapek com deteco monitorada em 254nm.
1.22
2.49
1.09
1.07
0.66
2.74
2.72
3.56
6.32
6.26
6.87
6.81
6.79
7.0
1.49
2.26
5.65
1.91
1.91
1.89
0.84
3.84
2.13
2.50
2.48
2.06
3.77
3.32
DMSO-d6
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
Figura 52: Espectro de RMN de 1H de Mc-8R Czapek (DMSO-d6 a 11,7 T)
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
126
Figura 53: Cromatograma em CLAE-DAD de Mc-8R Nutriente com deteco monitorada em 254nm.
7.0
6.5
6.0
5.5
2.90
5.0
3.65
5.08
4.39
4.28
5.38
7.5
1.81
3.89
7.26
8.12
8.03
7.96
8.0
0.89
0.88
2.77
0.87
0.84
1.22
2.49
2.49
3.32
DMSO-d6
4.5
4.0
3.5
3.0
Figura 54: Espectro de RMN de 1H de Mc-8R Nutriente (DMSO-d6 a 11,7 T)
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
127
Figura 55: Cromatograma em CLAE-DAD de Mc-8R YM com deteco monitorada em 254nm.

0.84
1.28
1.22
1.20
2.25
2.49
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
1.46
0.57
3.95
5.63
5.58
5.94
6.15
6.11
6.39
7.42
7.38
7.26
8.72
7.78
7.75
2.72
3.81
2.35
1.88
1.99
5.30
3.33
DMSO-d6
5.0
4.5
4.0
3.5
Figura 56: Espectro de RMN de 1H de Mc-8R YM (DMSO-d6 a 11,7 T)
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
128
Figura 57: Cromatograma em CLAE-DAD de Mc-8R Extrato de Malte com deteco monitorada em 254nm.
2.06
2.49
3.38
8.5
8.0
7.5
7.0
5.5
5.0
2.88
4.01
4.25
4.5
4.0
1.57
1.43
2.30
6.0
4.99
5.86
5.30
5.16
4.43
6.26
6.5
0.89
3.04
6.32
9.0
6.62
7.12
9.5
6.45
7.38
6.86
6.84
6.81
6.79
8.28
10.10
10.0
1.86
2.72
2.18
5.66
2.74
5.65
2.41
1.07
1.89
1.22
1.09
1.88
3.75
2.13
2.50
3.84
3.77
DMSO-d6
3.5
3.0
2.5
Figura 58: Espectro de RMN de 1H de Mc-8R Extrato de Malte (DMSO-d6 a 11,7 T)
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
129
Figura 59: Cromatograma em CLAE-DAD de Mc-8R Arroz ACN com deteco monitorada em 254nm.
2.15
1.24
2.12
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
2.5
1.5
0.83
1.0
0.81
0.95 0.92
1.30
1.29
0.91
0.84
2.0
1.20
1.88
1.86
1.72
1.71
1.70
2.73
2.81
2.80
3.0
Figura 60: Espectro de RMN de 1H de Mc-8R Arroz ACN (DMSO-d6 a 11,7 T)
1.47
2.23
2.74
3.12
3.41
5.30
3.50
3.42
5.31
7.5
2.11
3.76
3.67
7.38
7.43
7.36
8.0
1.12
1.10
3.79
2.19
3.82
2.48
3.81
1.22
2.49
2.49
3.31
DMSO-d6
0.5
130
Figura 61: Cromatograma em CLAE-DAD de Mc-8R Milho ACN com deteco monitorada em 254nm.
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
2.5
Figura 62: Espectro de RMN de 1H de Mc-8R Milho ACN (DMSO-d6 a 11,7 T)
2.0
1.5
1.14
1.12
1.10
0.85
0.84
0.91
1.0
0.75
0.66
1.07 1.09
2.01
1.88 1.88 2.00
1.87
1.86
1.71
1.70 1.48
1.47
1.35 1.33
2.31
2.26
2.23
2.74
2.73
2.80
3.0
2.71
2.81
3.13
3.09
3.50
3.67
4.08
4.06
5.32
7.43
5.31
5.30
3.41
7.38
0.98
0.97
0.86
0.83
0.83
0.76
2.11
1.31
3.76
1.30
3.12
2.19
1.24
3.82
2.15
3.81
2.50
1.22
2.49
2.49
3.31
DMSO-d6
0.5
131
6.0
5.5
5.0
4.5
3.5
3.0
2.5
2.0
0.80
1.0
0.00
0.74
0.83
0.85
0.75
0.78
1.55
1.5
0.5
0.0
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
0.83
0.79
0.61
0.00
1.54
1.97
2.21
2.29
2.70
3.59
4.25
4.24
4.21
4.20
4.10
4.08
4.06
4.04
5.25
7.20
7.5
2.27
2.24
5.30 5.29
5.27
0.82
0.81
1.23
1.19
Figura 63: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-8R Arroz Hex (CDCl3 a 11,7 T )
1.29
1.30
1.56
1.54
1.97
1.95
1.93
1.92
2.00
1.98
2.24
2.22
2.25
2.26
2.23
2.27
2.70
4.0
2.27
4.08
4.07
4.06
4.09
4.22
4.23
4.24
5.29
5.27
6.5
5.26
5.30
7.0
5.27
7.19
2.24
1.27
1.26
3.59
0.82
0.81
1.23
1.19
2.5
2.0
Figura 64: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-8R Milho Hex (CDCl3 a 11,7 T)
1.5
1.0
0.5
0.0
Figura 65: CCDC das fases Hexnicas do Milho, Arroz e Arroz hex ppt, com eluente em 86% Hex 3% HAc 11
% (Soluo A) em tripla eluio.
-0.5
132
7.80
2.11
2.08
2.07
3.01
6.54
2.49
1.96
DMSO-d6
4.02
5.34
8.89
2.82
4.27
3.60
7.74
8.15
7.76
2.12
4.52
7.79
8.12
8.13
Figura 66: Cromatograma em grad. explorat. do extrato AcOEt Mc-7F.1 (H2O+0,5% HAc/MeOH; 95:5 a 0:100
em 40, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm)
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
Figura 67: Espectro de RMN de 1H do extrato de Mc-7F.1 (DMSO-d6 a 11,7 T)
3.5
3.0
2.5
2.0
133
3.42
0.86
7.24
6.70
0.87
1.91
6.70
6.81
7.09
7.08
7.03
7.05
3.19
6.72
3.47
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
1.02
1.80
2.53
2.49
3.57
7.89
3.79
DMSO-d6
2.0
1.5
1.0
134
11.0
2.50
7.08
6.99
7.10
10.87
7.52
7.50
7.37
7.35
7.31
7.27
7.23
3.56
3.65
10.5
10.0
9.5
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
135
4.11
2.74
6.69
6.67
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
1.97
1.90
1.83
1.78
2.53
2.75
2.73
3.5
3.17
3.52
7.24
7.5
2.49
DMSO-d6
4.13
4.10
7.02
7.00
1.96
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
136
11.0
1.14
1.10
1.09
1.01
1.00
2.54
2.50
3.49
6.98
3.64
7.09
7.00
6.67
10.93
7.10
7.38
7.36
7.50
7.25
3.75
3.61
10.5
10.0
9.5
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
137
3.52
1.99
1.91
0.90
0.89
3.17
2.99
4.23
3.72
3.64
2.73
6.67
6.65
7.24
7.26
7.22
11.0
10.66
10.90
10.83
7.75
7.17
7.66
4.13
7.06
6.98
6.97
1.78
2.49
DMSO-d6
10.5
10.0
9.5
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
138
3.70
6.96
4.16
3.62
6.98
3.48
2.49
2.85
2.74
4.21
3.18
7.20
6.67
6.70
6.65
7.28
10.91
10.83
10.66
0.89
1.91
7.30
7.00
7.26
7.22
DMSO-d6
12.0
11.5
11.0
10.5
10.0
9.5
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
-0.5
-1.0
139
7.20
2.85
4.21
3.53
11.0
3.61
2.87
2.84
2.49
3.47
4.19
1.91
10.83
7.41
6.72
7.05
5.95
4.22
7.06
4.06
7.26
7.25
7.18
2.49
DMSO-d6
10.5
10.0
9.5
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
140
2.50
2.89
2.86
4.26
4.23
7.08
6.97
1.92
10.91
3.36
7.44
7.36
7.18
7.26
2.87
7.19
4.24
3.71
11.0
10.5
10.0
9.5
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
141
7.29
7.28
4.24
7.19
2.86
3.62
Figura 84: Cromatograma em grad. explorat. do extrato AcOEt Mc-7F.10 (H2O+0,5% HAc/MeOH; 95:5 a
0:100 em 40, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm)
0.93
10.90
10.83
1.23
2.88
2.85
3.32
4.25
4.23
2.49
7.17
DMSO-d6
11.0
10.5
10.0
9.5
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
142
3.33
3.50
1.23
Figura 86: Cromatograma em grad. explorat. do extrato AcOEt Mc-7F.11 (H2O+0,5% HAc/MeOH; 95:5 a
0:100 em 40, com fluxo de 1,0 mL/mim. a 254 nm)
1.48
5.32
10.87
10.83
11.0
2.17
4.04
7.23
3.17
0.84
2.49
DMSO-d6
10.5
10.0
9.5
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
7.0
6.32
6.28
6.28
6.5
6.0
5.5
Figura 88: Espectro de RMN de 1H de (1) (DMSO-d6 a 11,7 T)

5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.09
1.37
2.21
2.53
2.28
2.28
2.92
2.88
3.78
1.24
1.23
1.19
1.18
3.48
1.96
1.96
1.95
1.95
2.26
3.26
2.0
1.95
1.95
1.96
1.96
3.86
3.94
6.28
6' O
1
6.28
6.28
6.29
4'
6.31
6.32
6.31
5'
6.32
6.76
6.77
6.79
6.81
H3 C
7' O
4.06
5.46
6.75
6.78
6.79
6.82
5.47
6.32
6.81
6.79
6.77
6.76
2.16
3.79
7.25
Chloroform-d
O
CH3
7
CH3
8
1.5
1.0
77.00
Chloroform-d
H3 C
7' O
3
5'
2
6' O
1
CH3
8
190
180
170
160
150
140
130
Figura 89: Espectro de RMN de 13C de (1) (DMSO-d6 a 11,7 T)
120
110
100
90
80
70
60
50
22.74
40
30
18.64
52.83
51.61
56.45
64.37
190.48
163.06
168.74
114.26
114.02
161.46
147.18
18.47
18.23
87.71
133.10
CH3
7
56.34
4'
20
10
2 .0 0
6 .2 5
2 .2 5
6 .5 0
2 .5 0
6 .7 5
2 .7 5
7 .0 0
3 .0 0
p p m (f1
3 .2 5
1 5 0 .0 1 4 7 .5 1 4 5 .0 1 4 2 .5 1 4 0 .0 1 3 7 .5 1 3 5 .0 1 3 2 .5 1 3 0 .0
3 .5 0
H3 C
7' O
4'
5'
3 .7 5
O
3
4
2
6' O
1
4 .0 0
CH3
7
4 .2 5
CH3
8
4 .5 0
4 .7 5
5 .0 0
5 .2 5
5 .5 0
p p m (f1
9 0 .0
8 5 .0
8 0 .0
7 5 .0
7 0 .0
6 5 .0
6 0 .0
Figura 90: Mapa de contorno gHMQC de (1) (DMSO-d6 a 11,7 T)
5 5 .0
5 0 .0
4 5 .0
4 0 .0
3 5 .0
3 0 .0
2 5 .0
2 0 .0
1 5 .0
1 .5 0
2 .0 0
2 .5 0
3 .0 0
3 .5 0
4 .0 0
4 .5 0
H3 C
7' O
4'
5'
O
3
4
2
6' O
1
5 .0 0
CH3
7
5 .5 0
CH3
8
6 .0 0
6 .5 0
7 .0 0
p p m (f1
188
175
163
150
138
125
Figura 91: Mapa de contorno gHMBC de (1) (DMSO-d6 a 11,7 T)
113
100
88
75
63
50
38
25
13
1 .0
2 .0
3 .0
4 .0
5 .0
H3 C
7' O
4'
5'
O
3
2
O
6' O
1
CH3
7
6 .0
CH3
8
7 .0
p p m ( f1
7 .5 0
7 .0 0
6 .5 0
6 .0 0
5 .5 0
Figura 92: Espectro de RMN de gCOSY de (1) (DMSO-d6 a 11,7 T)
5 .0 0
4 .5 0
4 .0 0
3 .5 0
3 .0 0
2 .5 0
2 .0 0
0.0
x10 4
+MS2(209.1000), 5eV, Profile, 0.7min #14, 100%=9465
1.25
209.1018
1.00
0.75
0.50
0.25
135.0953
0.00
149.0754
163.0923
191.0892
177.0724
+MS2(209.1000), 10eV, Profile, 1.0min #19, 100%=1785
2500
Figura 93: Espectro de Massas de (1)

H3 C
7' O
4'
5'
O
3
4
2
6' O
1
CH3
8
CH3
7
1.96
1.96
1.95
1.94
2.91
2.90
7.0
6'
5'
3
4
6.5
CH 3
6.0

5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.70
2.71
OCH3
2.07
2.16
4'
2.74
2.73
7'
2.74
2.71 2.73
2.70
2.94
3.78
H3 C
5.46
7.25
Chloroform-d
5
7
2.0
1.5
2.91
1.18
1.17
2.90
2.93
2.94
3.79
3.80
3.80
3.83
3.79
3.80
3.81
3.81
3.82
3.82
3.82
3.83
3.84
2.23
3.26
3.84
3.78
3.84
7'
O
4'
5'
O
3
77.25
77.00
76.75
Chloroform-d
H3 C
OCH3
5
6
CH 3
8
51.59
18.93
190
180
170
160
150
140
130
Figura 95: Espectro de RMN de 13C de (2) (DMSO-d6 a 11,7 T T)
120
87.68
115.91
163.44
162.60
199.28
200
114.26
168.39
73.69
56.15
18.93
18.30
56.15
162.60
163.44
56.33
56.33
87.64
18.30
6'
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
1 .0 0
3 .8 0 0
1 .5 0
3 .8 5 0
2 .0 0
3 .9 0 0
p p m (f1
7 5 .0
7 0 .0
6 5 .0
6 0 .0
5 5 .0
5 0 .0
2 .5 0
4 5 .0
3 .0 0
3 .5 0
H3 C
7'
O
4'
5'
O
3
OCH3
4 .0 0
5
6
6'
O
1
4 .5 0
CH 3
8
5 .0 0
5 .5 0
6 .0 0
p p m (f1
200
175
150
125
100
75
50
25
1 .2 5
1 .5 0
1 .7 5
2 .0 0
2 .2 5
2 .5 0
2 .7 5
3 .0 0
3 .2 5
3 .5 0
3 .7 5
4 .0 0
4 .2 5
H3 C
7'
4 .5 0
O
4'
5'
OCH3
4 .7 5
5
6
5 .0 0
6'
O
1
5 .2 5
CH 3
8
5 .5 0
.7 5(f1
p p5m
200
188
175
163
150
1 38
125
113
100
88
75
63
50
38
25
13
1 .0 0
1 .5 0
2 .0 0
2 .5 0
3 .0 0
3 .5 0
4 .0 0
4 .5 0
H3 C
7'
O
4'
5'
5
6
6'
5 .0 0
OCH3
5 .5 0
7
6 .0 0
CH 3
8
6 .5 0
7 .0 0
p p m (f1
7 .0 0
6 .5 0
6 .0 0
5 .5 0
5 .0 0
4 .5 0
Figura 98: Espectro de RMN de gCOSY de (2) (DMSO-d6 a 11,7 T)
4 .0 0
3 .5 0
3 .0 0
2 .5 0
2 .0 0
1 .5 0
1 .0 0
0 .5 0
0.0
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400
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200
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100
0
600
191.0867
+MS2(263.1000), 10eV, Profile, 2.4min #45, 100%=402
H3 C
7'
O
4'
5'
O
3
4
2
6'
O
1
CH 3
8
OCH3
5
6
4'
5'
OH
5
2.74
2.73
2.72
H3 C
7' O
2.49
3.39
DMSO-d6
1.09
1.08
1.22
4.04
4.03
4.01
1.56
5.56
1.90
2.74
5.66
2.17
3.77
2.06
3.16
3.84
2.13
2.07
CH3
8
1.08
6' O
1
2.06
2
O
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
2 .0
3 .0
4 .0
H3 C
7' O
4'
5'
O
3
OH
5
5 .0
2
O
6' O
1
CH3
8
6 .0
p p m (f1
90
80
70
60
50
40
30
20
10
1 .0 0
1 .2 5
1 .5 0
1 .7 5
2 .0 0
2 .2 5
2 .5 0
2 .7 5
3 .0 0
3 .2 5
H3 C
7' O
4'
5'
O
3
OH
5
3 .5 0
3 .7 5
2
O
6' O
1
CH3
8
4 .0 0
p p4m
.2 5(f1
200
188
175
163
150
138
125
113
100
88
75
63
50
38
25
13
1 .0 0
1 .5 0
2 .0 0
2 .5 0
3 .0 0
3 .5 0
4 .0 0
H3 C
7' O
4'
5'
4 .5 0
O
3
OH
5
5 .0 0
2
O
5 .5 0
5 .0 0
4 .5 0
4 .0 0
Figura 103: Espectro de RMN gCOSY de (3) (DMSO-d6 a 11,7 T)
3 .5 0
3 .0 0
2 .5 0
2 .0 0
6' O
1
1 .5 0
CH3
8
1 .0 0
5 .5 0
p p m (f1
x10 4
1.0
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0.6
0.4
0.2
203.0882
231.0843
0.0
1000
+MS2(249.1000), 10eV, Profile, 0.7min #14, 100%=730
H3 C
7' O
4'
5'
O
3
4
2
6' O
1
CH3
8
OH
5
0.90
2.15
3.81
0.90
2.69
1.62
1.55
0.89
1.56
0.92
1.58
1.60
2.68
1.59
2.69
2.70
11
OCH 3 O
7.42
7.38
CH 3
10
1.59
1.58
8
CH 3
12
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
1.15
1.08
3.63
3.68
3.65
2.49
2
HO
13
DMSO-d6
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
39.67
39.50
39.33
39.16
DMSO-d6
4
6
134.63
134.55
16.36
CH 3
12
13.44
CH 3
10
55.77
HO
13
3
2
45.40
11
OCH 3 O
134.0
18.19
134.5
210
200
190
180
170
160
150
140
130
113.76
120
109.27
123.70
155.56
134.63
206.46
135.0
110
100
90
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20
10
1 .0 0
1 .5 0
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2 .5 0
3 .0 0
3 .5 0
4 .0 0
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5 .0 0
5 .5 0
11
OCH 3 O
2
HO
13
4
6
6 .0 0
CH 3
10
8
CH 3
12
6 .5 0
7 .0 0
7 .5 0
p p m (f1
125
113
100
88
75
63
50
38
25
13
1 .0 0
1 .5 0
2 .0 0
2 .5 0
3 .0 0
3 .5 0
4 .0 0
4 .5 0
11
OCH 3 O
2
HO
13
4
6
5 .0 0
CH 3
10
8
CH 3
12
5 .5 0
6 .0 0
6 .5 0
7 .0 0
7 .5 0
p p m (f1
200
188
175
163
150
138
125
113
100
88
75
63
50
38
25
13
0 .5 0
1 .0 0
1 .5 0
2 .0 0
2 .5 0
3 .0 0
3 .5 0
11
OCH 3 O
2
HO
13
4
6
O
4 .5 0
4 .2 5
4 .0 0
3 .7 5
3 .5 0
3 .2 5
Figura 109: Espectro de gCOSY de (4) (DMSO-d6 a 11,7 T)
3 .0 0
2 .7 5
2 .5 0
2 .2 5
2 .0 0
1 .7 5
1 .5 0
4 .0 0
CH 3
10
4 .5 0
CH 3
12
p p5m
.0 0(f1
1 .2 5
1 .0 0
0 .7 5
0 .5 0
7.42
3.81
2.10
7.41
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
7.38
7.5
3.82
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.69
8.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
2.15
4.0
0.94
4.5
1.67
5.0
2.21
3.82
5.5
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.63
2.91
7.0
2.80
7.47
7.5
Figura 110: Espectro de NOESY 1D de (4) (DMSO-d6 a 11,7 T)
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
Intens.
x10 5
259.1198
11
OCH 3 O
3
HO
13
4
6
3
2
5
CH 3
10
8
CH 3
12
247.0825
203.0896
219.1244
237.1361
281.1039
175.1304
301.1713
0
120
140
160
M c-8R Pa 2 - ESI - POS.d: +M S, 100%=523393
180
200
220
240
260
280
300
m /z
3.82
6.52
6.53
6.55
6.51
6.54
3
6.55
6.57
6.58
11
OCH3
HO
2.22
CH3
10
CH3
12
1.93
1.93
1.92
1.92
1.91
1.93
1.93
6.33
6.33
6.36
6.33
6.33
6.36
6.36
13
0.06
1.24
7.25
6.57
6.55
6.53
6.52
6.36
6.36
6.33
6.33
7.47
7.59
Chloroform-d
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
55.97
18.52
18.80
133.44
10
CH3
Chloroform-d
77.00
76.75
CH3
12
200
190
180
170
160
150
140
114.27
130.34
134.61
171.28
197.23
147.58
136.52
156.50
77.25
13
133.44
109.65
HO
18.80
18.52
3
2
124.72
134.61
136.52
11
OCH3
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
2 .0 0
2 .5 0
3 .0 0
3 .5 0
4 .0 0
4 .5 0
5 .0 0
5 .5 0
6 .0 0
11
OCH3
3
2
HO
150
138
125
113
100
88
75
63
50
7
4
13
6 .5 0
7 .0 0
CH3
10
7 .5 0
CH3
12
8 .0 0
p p m (f1
38
25
13
2 .0 0
2 .5 0
3 .0 0
3 .5 0
4 .0 0
4 .5 0
5 .0 0
11
OCH3
3
2
HO
13
5 .5 0
CH3
10
6 .0 0
CH3
12
6 .5 0
7 .0 0
7 .5 0
p p m (f1
200
188
175
163
150
138
125
113
100
88
75
63
50
38
25
13
0 .0 0
0 .5 0
1 .0 0
1 .5 0
2 .0 0
2 .5 0
3 .0 0
3 .5 0
4 .0 0
4 .5 0
5 .0 0
5 .5 0
6 .0 0
6 .5 0
11
OCH3
3
2
HO
13
O
8 .5 0
8 .0 0
7 .5 0
7 .0 0
6 .5 0
6 .0 0
5 .5 0
5 .0 0
4 .5 0
7 .0 0
7
8
CH3
7 .5 0
10
8 .0 0
CH3
8 .5 0
p p m (f1
12
4 .0 0
3 .5 0
3 .0 0
2 .5 0
2 .0 0
1 .5 0
1 .0 0
0 .5 0
0 .0 0
Intens.
x10 6
257.1041
11
OCH3
1.25
3
2
HO
13
1.00
CH3
10
CH3
12
0.75
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200
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m /z
8.0
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2.75
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1.86
1.86
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2.81
2.80
2.76
2.75
2.85
12
2.5
2.0
1.10
1.12
2.10
2.80
2.80
2.79
2.81
4.07
2.85
6
3.75
2.83
13
8
4.08
4.05
4.09
HO
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4.04
4.10
1.12
1.10
2.18
3.82
OH
3.44
3.42
4.08
4.07
7.41
7.38
4.05
4.09
7.44
11
3.67
6.49
6.47
6.50
6.45
6.44
6.43
6.31
6.31
6.28
8.28
O CH3
CH3
1
10
CH3
DMSO-d6
1.5
1.0
200
190

180
170
160
150
140
130
109.22
6
8
123.49
135.48
13
7
123.84
134.48
132.87
2
9
CH3
120
110
100
90
80
70
23.73
62.78
OH
10
60
18.40
53.45
132.23
11
147.85
155.76
O CH3
155.96
HO
166.77
196.32
205.47
55.83
132.23
133.01
132.87
132.87
132.23
133.01
155.96
134.48
134.48
39.50
135.48
155.76
DMSO-d6
1
12
CH3
50
40
30
20
10
1 .0 0
1 .5 0
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3 .5 0
4 .0 0
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5 .0 0
5 .5 0
6 .0 0
11
O CH3
OH
CH3
10
HO
13
5
6
125
113
100
88
75
63
50
38
7 .0 0
CH3
12
7 .5 0
6 .5 0
p p m (f1
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13
1 .5 0
2 .0 0
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3 .0 0
3 .5 0
4 .0 0
4 .5 0
11
O CH3
OH
5 .0 0
9
8
CH3
10
HO
13
5 .5 0
CH3
12
6 .0 0
6 .5 0
7 .0 0
7 .5 0
p p m (f1
213
200
188
1 75
163
150
138
125
113
100
88
75
63
50
38
25
13
1 .0 0
1 .5 0
2 .0 0
2 .5 0
3 .0 0
3 .5 0
4 .0 0
4 .5 0
5 .0 0
5 .5 0
11
O CH3
3
6 .0 0
OH
9
8
6 .5 0
CH3
10
HO
13
5
6
7 .0 0
CH3
12
7 .5 0
p p m (f1
7 .5 0
7 .0 0
6 .5 0
6 .0 0
5 .5 0
5 .0 0
4 .5 0
4 .0 0
3 .5 0
3 .0 0
2 .5 0
2 .0 0
1 .5 0
1 .0 0
Intens.
x10 6
275.1172
11
O CH3
1.25
2
257.1040
CH3
10
HO
1.00
OH
13
CH3
12
0.75
0.50
0.25
235.1198
393.3359
193.0703
291.0915
340.1236
0.00
50
100
150
M c-8R 3-4 - ESI - POS.d: +M S, 100%=1391109
200
250
300
350
400
450
m /z
9
8
2.14
2.49
11
O CH3
3.81
DMSO-d6
O H
10
1
2.74
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
1.67
1.68
1.69
1.22
1.71
1.68
1.67
1.28
1.72
1.69
1.74
0.67
2.72
3.77
3.91
7.41
7.38
2.75
3.50
2.74
1.74
3.42
3.39
1.72
1.71
3.42
3.39
2.72
CH3
12
2.75
5
6
3.41
13
3.41
HO
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
11
O CH3
9
8
O H
55.77
59.91
10
HO
13
5
6
CH3
12
210
200
190
180
170
160
150
140
26.46
109.22
123.64
134.48
155.46
206.68
113.75
18.25
134.25
40.36
134.48
39.50
DMSO-d6
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
1 .5 0
11
O CH3
2 .0 0
9
8
O H
2 .5 0
10
HO
13
5
6
3 .0 0
CH3
12
3 .5 0
4 .0 0
4 .5 0
5 .0 0
5 .5 0
6 .0 0
6 .5 0
7 .0 0
7 .5 0
p p m (f1
125
113
100
88
75
63
50
38
25
1 .0 0
1 .5 0
2 .0 0
2 .5 0
3 .0 0
3 .5 0
4 .0 0
4 .5 0
11
O CH3
5 .0 0
9
8
O H
5 .5 0
10
HO
13
6 .0 0
CH3
12
6 .5 0
7 .0 0
7 .5 0
p p m (f1
213
200
1 88
175
163
150
13 8
125
113
100
88
75
63
50
38
25
13
0 .5 0
1 .0 0
1 .5 0
2 .0 0
2 .5 0
3 .0 0
3 .5 0
4 .0 0
4 .5 0
11
O CH3
5 .0 0
9
8
O H
5 .5 0
10
HO
13
CH3
6 .0 0
12
6 .5 0
7 .0 0
7 .5 0
p p m (f1
7 .5 0
7 .0 0
6 .5 0
6 .0 0
5 .5 0
5 .0 0
4 .5 0
4 .0 0
3 .5 0
3 .0 0
2 .5 0
2 .0 0
1 .5 0
1 .0 0
0 .5 0
Intens.
x10 5
449.2865
275.0894
11
O CH3
9
8
O H
10
HO
13
5
6
CH3
12
493.3139
2
235.0970
307.0256
348.0515
393.2968
0
100
200
300
M c-8R 3-6-6- ESI - POS.d: +MS, 100%=690184
400
500
600
700
800
m /z
2.39
3.82
1.19
0.06
OCH3 O
CH3
HO
1.19
1.18
1.21
2.86
2.54
0.87
2.22
3.89
2.29
2.46
3.94
7.46
7.62
3.78
2.88
2.91
7.25
2.88
CH3
2.89
Chloroform-d
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
56.21
77.00
Chloroform-d
OCH3 O
110.09
CH3
HO
CH3
200
129.39
195.74
201.44
7.00
159.04
140.64
125.72
114.29
29.80
19.54
190
180
170
160
150
140
130
120
110
100
90
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50
40
30
20
10
1 .0 0
1 .5 0
2 .0 0
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4 .0 0
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5 .5 0
6 .0 0
OCH3 O
6 .5 0
CH3
7 .0 0
HO
CH3
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p p m (f1
125
113
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13
0 .0 0
0 .5 0
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2 .0 0
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3 .5 0
4 .0 0
4 .5 0
OCH3 O
5 .0 0
CH3
5 .5 0
HO
CH3
6 .0 0
6 .5 0
7 .0 0
7 .5 0
p p m (f1
225
213
200
188
175
163
150
138
125
113
100
88
75
63
50
38
25
13
1 .0 0
1 .5 0
2 .0 0
2 .5 0
3 .0 0
3 .5 0
4 .0 0
4 .5 0
OCH3 O
5 .0 0
CH3
5 .5 0
HO
CH3
6 .0 0
6 .5 0
7 .0 0
7 .5 0
p p m (f1
7 .5 0
7 .0 0
6 .5 0
6 .0 0
5 .5 0
5 .0 0
4 .5 0
4 .0 0
3 .5 0
3 .0 0
2 .5 0
2 .0 0
1 .5 0
1 .0 0
Intens.
x10 5
273.0944
OCH3 O
CH3
1.5
HO
CH3
O
1.0
252.1431
289.0903
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346.0642
393.3274
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523.1947
0.0
100
200
Mc-8R 4-2- ESI - POS.d: +M S, 100%=166979
Figura 135: Espectros de Massas de (8)
300
400
500
m/z
7.0
6.5
Figura 136: Espectro de RMN de 1H de (9) (CDCl3 a 11,7 T)

6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
0.06
1.60
1.5
1.33
1.47
2.03
2.29
1.29
1.26
1.03
1.02
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0.62
0.81
0.82
1.0
0.62
0.93
0.83
28
0.80
1.31
1.86
0.80
0.81
26
2.76
3.65
Chloroform-d
0.83
0.83
0.91
0.93
0.90
0.87
7
27
0.85
14
24
4.27
4.15
4.14
4.13
4.11
H
23
0.89
0.90
5
8
17
16
15
5.17
4
9
20
5.16
5.14
1.00
HO
10
13
1.02
18
5.19
5.21
3
1
1.03
2
11
12
5.56
5.55
5.55
5.38
5.37
5.24
19
6.23
6.21
6.49
6.48
7.25
21
22
25
0.5
0.0
3.60
3.59
5.37
5.37
5.36
3.62
3.63
5.21
5.19
5.19
5.17
3.61
5.14
5.16
5.24
5.22
5.36
5.38
5.56
5.56
5.55
5.55
0.82
1.24
3.65
140
135
130
125
120
115
110
105
Figura 137: Espectro de RMN de 13C de (9) (CDCl3 a 11,7 T)

100
95
90
85
80
75
70
65
60
55
50
45
40
35
30
25
14.08
22.67
20
12.04
21.09
16.28
23.00
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28.26
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19.94
19.63
33.09
31.99
40.38
7
14.08
22.67
29.34
39.11
21.13
12.04
16.28
21.09
23.00
29.69
28.26
46.28
26
42.83
25
31.99
24
38.38
27
42.85
23
31.91
37.04
39.11
17
16
15
29.76
14
19.63
33.09
40.38
19.94
17.59
20
77.25
77.00
76.75
Chloroform-d
38.38
5
8
22
31.91
42.83
4
10
13
46.28
HO
55.78
54.57
3
1
37.04
2
11
40.80
19
12
116.30
119.59
132.00
135.56
18
28
40.80
70.48
141.31
139.77
21
15
10
7.0
6.5
6.0
5.5
Figura 138: Espectro de RMN de 1H de (10) (CDCl3 a 11,7 T)

5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
0.80
6
0.90
0.87
26
1.0
0.06
0.99
1.24
0.81
24
0.73
1.20 1.08 1.23

1.21
1.00
0.81
25
0.80
23
0.82
0.81
17
16
15
0.82
22
1.95
1.92
1.70 1.69 1.90
1.58 1.57
1.49
1.49
1.48
1.44
1.33
1.31
0.83
20
0.83
3.93
6.23
6.22
6.50
6.48
18
1.96
2.33
0.87
3.92
3.96
0.88
14
3.95
13
0.89
3.97
3.98
10 O
3.99
5.14
5.16
5.19
5.21
1
11
0.90
Chloroform-d
0.90
4.00
5.13
5.11
5.18
5.22
19
12
3.95
3.93
3.92
3.80
0.91
0.98
0.99
HO
3.96
5.21
5.19
5.14 5.16
0.99
1.00
5.24
4.00
3.99
3.98
3.97
5.13
5.11
5.24
6.23
6.22
6.50
6.48
7.25
21
28
27
0.5
0.0
135
22.67
56.26
130
125
120
Figura 139: Espectro de RMN de 13C de (10) (CDCl3 a 11,7 T)

115
110
105
100
95
90
85
80
75
70
65
60
55
50
45
35
30
25
14.08
40
20.88
20.64 19.93
19.63
18.17
17.55
12.88
23.41
14.08
22.67
39.38
51.71
33.08
20
12.88
23.41
20.88
20.64
19.93
19.63
18.17
17.55
28.61
30.14
34.73
36.96
39.68
42.79
30.14
28.61
33.08
27
51.16
77.25
77.00
76.75
26
29.69
8
25
31.91
O
44.58
23
39.38
51.71
14
17
16
15
56.26
13
24
36.96
51.16
66.48
HO
10 O
12
22
42.79
79.42
1
11
130.74
135.20
132.33
135.41
19
20
34.73
44.58
82.14
130.74
135.20
18
39.68
114.27
132.33
135.41
21
28
Chloroform-d
15
10
0 .5 0
0 .7 5
1 .0 0
1 .0 0
1 .2 5
1 .5 0
1 .5 0
2 .0 0
1 .7 5
2 .5 0
2 .0 0
3 .0 0
2 .2 5
6 0 .0
5 5 .0
5 0 .0
4 5 .0
4 0 .0
3 5 .0
3 0 .0
2 5 .0
2 0 .0
1 5 .0
3 .5 0
1 0 .0
4 .0 0
21
11
12
9
2
3
HO
1
4
10 O
5
13
14
20
17
16
15
24
23
5 .0 0
25
26
5 .5 0
27
28
22
18
19
4 .5 0
6 .0 0
6 .5 0
125
100
Figura 140: Mapa de contorno gHMQC de (10) (CDCl3 a 11,7 T)
75
50
25
1 .0
2 .0
3 .0
4 .0
21
19
11
12
9
2
3
HO
1
4
10 O
5
14
8
13
28
22
18
20
17
16
15
24
23
5 .0
25
26
27
6 .0
100
Figura 141: Mapa de contorno gHMBC de (10) (CDCl3 a 11,7 T)
50
2.49
3.36
DMSO-d6
O
4
6 1
3N
2
1.02
1.00
10.79
10.95
3.19
3.21
3.20
2.61
7.37
7.35
1.79
3.48
5.44
5.43
3.47
10.79
7.37
7.35
10.95
5.44
5.43
2.52
11.0
10.5
10.0
9.5
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
-0.5
-1.0
39.50
DMSO-d6
O
4
6 1
3N
2
151.45
164.31
113.78
142.13
100.19
190
180
170
160
150
140
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
2 .5 0
5 .3 5 0
5 .4 0 0
3 .0 0
5 .4 5 0
5 .5 0 0
6 1
.5 5(f1
0
p p5m
1 0 3 .0
1 0 2 .0
1 0 1 .0
1 0 0 .0
9 9 .0
3 .5 0
3N
4 .0 0
9 8 .0
4 .5 0
5 .0 0
5 .5 0
7 .3 0 0
6 .0 0
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7 .4 5 0
7 .0 0
p p m (f1
7 .5 0
1 4 4 .0
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125
100
1 4 3 .0
75
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1 4 1 .0
50
p p m (f1
25
5 .5 0
6 .0 0
O
5
6 1
3N
2
O
6 .5 0
7 .0 0
7 .5 0
p p m (f1
160
150
140
130
120
110
100
5 .2 5
5 .5 0
5 .7 5
6 .0 0
6 .2 5
2 .5
6 .5 0
6 .7 5
7 .0 0
7 .2 5
7 .5 0
p p m (f1
5 .0
7 .2 5 7 .0 0 6 .7 5 6 .5 0 6 .2 5 6 .0 0 5 .7 5 5 .5 0 5 .2 5
O
5
6 1
7 .5
3N
2
1 0 .0
p p m (f1
1 0 .0
7 .5
5 .0
2 .5
9.5
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
9.67

6.5
6.0
7
10
8N
5.5
1'
6'
5'
5.0
4'
OH
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.66
4
1
1.02
1.22
3
2
N
1.40
1.70
1.72
3.24
3.53
3.23
3.27
4.24
4.04
4.03
6.65
O
3.51
4.23
2.88
2.89
2.95
2.96
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2.32 2.33
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2.15
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6.88
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2 .7 5 0
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7.03
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3
4
HO
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112.0
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104.0
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Figura 169: Espectro de DEPT 135 de (15) (DMSO-d6 a 11,7 T)
92.0
88.0
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76.0
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5
72.0
OH
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40.0
6 .7 0
3 .5 0
6 .8 0
6 .9 0
7 .0 0
3
4
HO
2
5
1
6
OH
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O
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3 .2 5
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.5 0(f1
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p p3m
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p p7m
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1
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1.0
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0.5
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185.1205
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121.0683
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0.0
50
100
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200
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300
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7.76
7.77
7.76
6.79
6.80
2.49
DMSO-d6
NH2
1
1.23
HO
7.5
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6.5
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3.0
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1.5
131.35
39.50
114.95
DMSO-d6
NH2
1
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161.34
113.74
HO
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HO
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1
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7 .2 5
7 .5 0
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1 2 0 .0
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7 .0 0
HO
NH2
1
7 .5 0
p p m (f1
170
p p m (f2 )
16 0
150
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110
7.0
2.69
3.79
2.49
6.70
7.03
6.5
6.0

5.5
5.0
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1
6
6.79
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6.72
6.79
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7.07
7.09
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6.77
7.03
7.03
7.06
7.06
7.08
7.07
7.04
OH
8
OH
DMSO-d6
4.0
3.5
3.0
2.5
3.46
118.66
114.83
127.73
130.96
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DMSO-d6
OH
155.39
1
6
OH
172.78
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170
160
150
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120
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100
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70
60
50
40
30
114 .8 402
1 18.672 4
12 7.7450
130.98 32
OH
3
4
P PM
14 0. 0
13 0. 0
12 0. 0
Figura 179: Espectros de DEPT de (17) (DMSO-d6 a 11,7 T)
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2
5
1
6
OH
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4 .0 0
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5 .0 0
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5 .5 0
p p m (f1
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1 2 0 .0
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OH
1 1 2 .5
3
4
2
5
5 .7 5
1
6
OH
6 .0 0
6 .2 5
6 .5 0
6 .7 5
7 .0 0
7 .2 5
p p m (f1
133
117
100
83
67
50
33
3 .0 0
3 .5 0
6 .7 0
6 .8 0
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OH
3
4
2
5
1
6
6 .9 0
OH
5 .0 0
O
7 .0 0
5 .5 0
7 .1 0
p p m (f1
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1 3 5 .0
1 3 0 .0
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6 .0 0
1 1 5 .0
6 .5 0
7 .0 0
p p m (f1
175
150
125
100
75
50
Intens.
x10 4
197.0239
2.5
OH
3
4
2
5
1
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OH
8
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1.5
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175
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80
N
10
12
13
O
18
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127.07
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129.74
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DMSO-d6
11
CH3
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14
15
18
16
17
PPM
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Figura 185: Espectro de DEPT de (18) (DMSO-d6 a 11,7 T)
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11
CH3
9
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1
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10
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CH3
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p p m (f1
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CH3
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H
1 .7(f1
p p1m
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7.24
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3.74
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-1.0
Intens.
x10 5
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CH3
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N
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121.03
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128.81
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DMSO-d6
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19
17
18
PPM
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100.0
Figura 193: Espectro de DEPT de (19) (DMSO-d6 a 11,7 T)
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p p m (f1
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Intens.
x10 5
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28.1182
37.4942
146.9001
OH
4
O
HO
2'
3'
1'
6'
4'
5'
PPM
150.0
140.0
130.0
120.0
110.0
Figura 201: Espectro de DEPT de (20 (DMSO-d6 a 11,7 T)
100.0
90.0
80.0
70.0
60.0
50.0
40.0
30.0
20.0
10.0
1 .0 0
1 .0 0
1 .5 0
1 .2 5
2 .0 0
2 .5 0
1 .5 0
3 .0 0
1 .7 5
3 .5 0
4 .0 0
2 .0 0
4 .5 0
2 .2 5
p p m (f1
6 0 .0
5 5 .0
5 0 .0
4 5 .0
4 0 .0
3 5 .0
3 0 .0
2 5 .0
2 0 .0
1 5 .0
1 0 .0
5 .0 0
OH
5 .0
5 .5 0
O
HO
2'
1'
6'
4'
3'
5'
6 .0 0
6 .5 0
7 .0 0
p p m (f1
150
138
125
113
100
88
75
63
50
38
25
13
1 .0 0
1 .5 0
2 .0 0
2 .5 0
3 .0 0
3 .5 0
OH
4 .0 0
O
HO
2'
2
1'
3'
4 .5 0
6'
4'
5'
5 .0 0
O
5 .5 0
6 .0 0
6 .5 0
7 .0 0
p p m (f1
188
175
163
150
138
125
113
100
88
75
63
50
38
25
13
1 .0 0
1 .5 0
2 .0 0
2 .5 0
3 .0 0
3 .5 0
4 .0 0
4 .5 0
OH
4
HO
5 .0 0
2'
2
1'
6'
4'
3'
5'
5 .5 0
6 .0 0
6 .5 0
7 .0 0
7 .5 0
p p m (f1
7 .5 0
7 .0 0
6 .5 0
6 .0 0
5 .5 0
5 .0 0
4 .5 0
4 .0 0
3 .5 0
3 .0 0
2 .5 0
2 .0 0
1 .5 0
1 .0 0
Intens.
x10 5
237.1152
5
OH
4
O
3
HO
2'
2
1'
6'
4'
3'
5'
251.1297
0
75
100
125
MC - C 3 - POS.d: +MS, 100%=504800
150
175
200
225
250
275
300
325
m/z
2.66
7.25
Chloroform-d
NO2
0.86
2.99
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
1.49
2.05
2.44
3.42
5.70
5.82
6.49
7.91
7.83
4.51
2.20
0.87
4.64
3.00
4.62
3.01
4.62
4.64
3.00
4.63
1.25
4.63
1.24
OH
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
Intens.
157.0876
NO2
8000
OH
135.0055
6000
128.9882
237.1157
150.9795
4000
189.0123
98.9811
208.1753
223.1353
159.0010
2000
269.1771
177.0209
284.3379
0
75
100
M C - 6 F - POS.d: +MS, 100%=8947
125
150
175
200
225
250
275
m /z

TESE Fungos Endofíticos Michelia Champaca

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

Julio de Mesquita Filho

BUSCA DE SUBSTNCIAS BIOATIVAS EM FUNGOS ASSOCIADOS

IOANIS HCRISTOS LEPTOKARYDIS

Leptokarydis, Ioanis Hcristos

1. Qumica orgnica. 2. Fungos endofticos. 3. Colletotrichum

Elaborao: Servio Tcnico de Biblioteca e Documentao do Instituto de Qumica de

IOANIS HCRISTOS LEPTOKARYDIS

Busca de Substncias Bioativas em Fungos Associados com a Espcie Michelia

Tese apresentada ao Instituto de Qumica,

Orientadora: Prof. Dra. ngela Regina Arajo.

Dedico este trabalho...

minha querida Veridiana Dionzio pelo amor, constante incentivo e

A todas as pessoas que por motivos profissionais, pessoais ou acadmicos chegarem

S til o conhecimento que nos torna melhores. (Scrates)

Sbio aquele que conhece os limites da prpria ignorncia. (Scrates)

Palavras-chave: fungo endofitico, Colletotrichum gloeosporioides; Michelia champaca

Keywords: endophytic fungus; Colletotrichum gloeosporioides; Michelia champaca

Figura 128: Espectro de gCOSY de (7) (DMSO-d6 a 11,7 T)............................................................ 183

Figura 183: Espectro de RMN de 1H de (18) (DMSO-d6 a 11,7 T) ................................................... 238

4.1.1 Fungos Endofticos Isolados dos Caules de Michelia champaca.............................................. 64

Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ____________________________________________1 - Introduo 20

Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ____________________________________________1 - Introduo 21

1.2 - A Importncia Ecolgica e Biotecnolgica dos Fungos

Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ____________________________________________1 - Introduo 22

Dentre eles destacam-se os antibiticos -lactmicos das classes da Penicilina F

Figura 1: Substncias bioativas obtidas a partir de fungos

Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ____________________________________________1 - Introduo 23

1.3 - Microrganismos Endofticos

Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ____________________________________________1 - Introduo 24

Entretanto, mudanas no hospedeiro causadas por fatores de stress, podem induzir a

Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ____________________________________________1 - Introduo 25

Tabela 1: Metablitos secundrios produzidos por microrganismos endofticos.

Aspergillus niger IFB-E003

Cynodon dactylon (L.)

Cynodon dactylon (L.)

Botrytis sp. (Sclerotiniaceae)

Taxus brevifolia Nutt.

Txico para animais

Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ____________________________________________1 - Introduo 26

Tabela 1: Metablitos secundrios produzidos por microrganismos endofticos (continuao).

Ephedra fasciculata A. Nels

Cynodon dactylon (L.) Pers.

Colletotrichum sp. strain EG4

Ginkgo biloba L. (Ginkgoaceae);

Diaporthe sp. CR 146

Forsteronia spicata G. Meyer

Dothiorella sp. strain HTF3

Aegiceras corniculatum Gaertner.

Murraya paniculata (L.) Jack

Fusarium oxysporum strain

Catharanthus roseus (L.) G. Don

Mentha aVensis L. (Lamiaceae);

Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ____________________________________________1 - Introduo 27

Tabela 1: Metablitos secundrios produzidos por microrganismos endofticos (continuao).

Microsphaeropsis sp. strain

Folhas tronco pecolo

Tese de Doutorado Leptokarydis, I. H. ____________________________________________1 - Introduo 28

Tabela 1: Metablitos secundrios produzidos por microrganismos endofticos (continuao).

Fragraea bodenii Thunb.

folhas e troncos de plantas

temperate and tropical

Rhizoctonia sp. Cy064

Cynodon dactylon (L.)