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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA – CLAE (HPLC)

LAÍS BASTOS DA FONSECA

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

“Cromatografia é uma técnica utilizada na separação dos componentes de uma amostra, os quais se distribuem em 2 fases, uma estacionária e a outra móvel. A fase estacionária pode ser um sólido, um líquido retido sobre um sólido, ou um gel. A fase móvel pode ser líquida ou gasosa.” (IUPAC)

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

Cromatografia Líquida
Cromatografia
Líquida

Planar

Coluna

de Alta Eficiência Cromatografia Líquida Planar Coluna CDD CP Alta eficiência Convecional Adsorção Partição

CDD

Alta Eficiência Cromatografia Líquida Planar Coluna CDD CP Alta eficiência Convecional Adsorção Partição

CP

Eficiência Cromatografia Líquida Planar Coluna CDD CP Alta eficiência Convecional Adsorção Partição Iônica
Eficiência Cromatografia Líquida Planar Coluna CDD CP Alta eficiência Convecional Adsorção Partição Iônica

Alta eficiência

Convecional

Cromatografia Líquida Planar Coluna CDD CP Alta eficiência Convecional Adsorção Partição Iônica Exclusão
Cromatografia Líquida Planar Coluna CDD CP Alta eficiência Convecional Adsorção Partição Iônica Exclusão
Cromatografia Líquida Planar Coluna CDD CP Alta eficiência Convecional Adsorção Partição Iônica Exclusão
Cromatografia Líquida Planar Coluna CDD CP Alta eficiência Convecional Adsorção Partição Iônica Exclusão

Adsorção

Partição

Iônica

Exclusão

Cromatografia Líquido-sólido ou por adsorção (CLS)

O mecanismo de separação: competição entre moléculas da amostra e da fase móvel em ocupar os sítios ativos da fase estacionária, sólido.

Adsorventes mais utilizado: sílica.

É importante que as partículas da fase estacionária apresentem um grande número de sítios ativos ( grande área de superfície).

Fase estacionária (polar) é afetada com frequência pela retenção de moléculas de alta polaridade como álcoois, água.

Acarreta mudança nas propriedades da coluna.

Pode dar origem a pobre eficiência. Assimetria dos picos compostos

básicos Diminuindo inclusive a vida útil.

Cromatografia Líquido-líquido ou por partição (CLL)

O mecanismo de separação: baseia-se nas diferentes solubilidades que apresentam os componentes da amostra na fase móvel e na fase estacionária.

Fase estacionária: líquido adsorvido sobre um suporte sólido formando um leito não miscível com a fase móvel.

Os componentes mais solúveis na fase estacionária são seletivamente retidos, enquanto os menos solúveis são transportados mais rapidamente pela fase móvel.

Suporte sólido: sílica purificada.

O maior inconveniente desta técnica é a solubilidade da fase estacionária na fase móvel.

Cromatografia Líquida com fase ligada (CLFL)

Surgiu como conseqüência de problemas associados a CLL.

A fase estacionária (FE) está quimicamente ligada à superfície de um suporte, elimina-se o problema da solubilidade FE na FM.

Variando a natureza dos grupos funcionais da fase estacionária, é possível diferentes tipos de seletividade.

Grupo funcional de natureza polar, como o grupo amino (- NH 2 ) e o grupo Ciano (-CN), que funcionando similarmente às fases polares da CLS (SiOH), são chamadas de FASE NORMAL.

Grupo funcional de natureza apolar, como os grupos octil (- C 8 H 17 ) octadecil (- C 18 H 37 ), fenil (- C 6 H 5 ), são chamados de FASE REVERSA.

Cromatografia Líquida com fase ligada (CLFL)

FASE NORMAL: fase estacionária polar e fase móvel apolar.

FASE REVERSA: fase estacionária apolar e fase móvel polar.

Segundo o CDER, a maioria dos métodos de análises submetidos ao mesmo, são por cromatografia em fase reversa , detecção UV.

Cromatografia líquida por par iônico, é uma forma especial de CLFL.

A molécula da amostra iônica ou ionizável, forma um par de íons por associação com um contra íon orgânico, da fase móvel.

O par de íons é então distribuído entre a fase estacionária, normalmente uma de fase reversa, e a fase móvel, normalmente aquosa-orgânica, que solubiliza as espécies ionizadas.

Cromatografia por troca iônica

A fase estacionária é, normalmente, uma resina de poliestireno e divinilbenzeno, a qual são ligados grupos iônicos, como por exemplo,

- SO - 3

- CO

- 2

- NR + 3

- NH 2 R +

trocadores fortes de cátion

trocadores fracos de cátion

trocadores fortes de ânions

trocadores fracos de ânions

As colunas catiônicas são adquiridas comercialmente na forma de sais de Na + ou de íon hidroxônio (H + ) as aniônicas na forma de cloreto (Cl - ).

Cromatografia por troca iônica

Os grupos iônicos têm um contra-íon (com carga oposta) que pode ser deslocado pelos íons da fase móvel de carga similar a ele.

Para uma resina trocadora de cátions, tem-se o equilíbrio entre o contra íon Na + e o cátion da amostra, M +

M + + R-SO - 3 Na +

Na + +

entre o contra íon Na + e o cátion da amostra, M + M + +

R-SO - 3 M +

Cromatografia por exclusão

A separação é efetuada de acordo com o tamanho efetivo das moléculas.

A coluna é recheada com matéria inerte cujos poros têm tamanho controlado.

As moléculas pequenas podem penetrar na maioria dos poros da fase estacionária enquanto as maiores são excluídas.

Assim, moléculas grandes movem-se rapidamente através da coluna e as moléculas pequenas são eluídas lentamente pela fase móvel.

A CLAE necessita que a coluna seja de materiais com estruturas mais rígidas, normalmente de sílica mas também de resina.

Cromatografia por por exclusão.

A separação é efetuada de acordo com o tamanho efetivo das moléculas.

A coluna é recheada com matéria inerte cujos poros têm tamanho controlado.

As moléculas pequenas podem penetrar na maioria dos poros da fase estacionária enquanto as maiores são excluídas.

Assim, moléculas grandes movem-se rapidamente através da coluna e as moléculas pequenas são eluídas lentamente pela fase móvel.

A CLAE necessita que a coluna seja de materiais com estruturas mais rígidas, normalmente de sílica mas também de resina.

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

Sistema de CLAE

Fase Móvel Injetor
Fase
Móvel
Injetor
Coluna Detector Registrador
Coluna
Detector
Registrador

Sistema de bombeamento

Sistema de CLAE

Reservatório da Fase Móvel

Recipientes de vidro, aço inox ou plásticos inertes – 1 a 3 L.

Filtro de aço sinterizado para reter as partículas sem produzir uma queda excessiva de pressão.

A

reservatório.

Fase

Móvel

deve

ser

filtrada,

antes

de

ser

colocada

no

Sistema de filtração por membrana de 0,45 µm de porosidade.

Sistema de CLAE

Características básicas – Bomba para CLAE

Quimicamente inerte (resistentes a fase móveis agressivas).

Trabalha a altas pressões.

Fluxo contínuo, livre de pulsação.

Reprodutibilidade do fluxo.

Fluxo constante a curto e longo prazo.

Fluxos - 0,1 a 10 mL/min analíticas e até 100 mL/min preparativas

Pequeno volume interno.

Sistema de CLAE

Tipo de Bomba.

Reciprocantes. São bombas que escoam volumes constantes de forma não contínua, isto é pulsante.

Vazão pulsando pode causar perda na eficiência da coluna e instabilidade no detector.

Duplo pistão – quando um pistão succiona a fase móvel o outro expulsa o líquido para fora da bomba. A vazão (fluxo) de ambos os pistões, já quase livre de pulsações, é encaminhada à coluna.

Amortizadores de fluxo.

A principal vantagem – vazão de volume constante.

Sistema de CLAE

Sistema de bombeamento.

Isocrático:

Composição da fase móvel permanece constante. Capaz de separar um número limitado de picos.

Gradiente:

Composição da fase móvel varia durante a análise. Sistema aplicável quando a polaridade dos compostos é muito diferente. Separação de amostras complexas. A determinação de impurezas relacionadas em uma matéria-prima é um exemplo.

Sistema de CLAE

Injetores.

Não é atacado por solvente.

É reprodutível e preciso.

Opera a altas pressões.

Manual.

Automático (auto-sampler).

Opera a altas pressões. Manual. Automático (auto-sampler). Otimização do tempo de análise. Melhor reprodutibilidade

Otimização do tempo de análise.

Melhor reprodutibilidade analítica.

Sistema de CLAE

Injetor Rheodyne – Diagrama de fluxo

Sistema de CLAE Injetor Rheodyne – Diagrama de fluxo CUIDADO ! limpeza do injetor.
Sistema de CLAE Injetor Rheodyne – Diagrama de fluxo CUIDADO ! limpeza do injetor.

CUIDADO ! limpeza do injetor.

Sistema de CLAE

Detectores.

Características de um detector ideal.

Alta sensibilidade. Baixo ruído (quanto maior o ruído pior será o LD). Resposta rápida a todos os solutos. Ter uma larga faixa de linearidade. Insensibilidade à mudanças na temperatura e vazão da FM. Não provocar alargamento do pico. Não destruição do soluto.

Tipos de Detectores usados em CLAE.

UV/VIS. Índice de Refração. Fluorescência.

Condutividade Elétrica. Eletroquímico.

Sistema de CLAE

Detectores.

Características de alguns detectores de CLAE Detector por Detector por Detector por Detector por Detector
Características de alguns detectores de CLAE
Detector por
Detector por
Detector por
Detector por
Detector por
espectrofoto-
fluorescência.
índice de
eletroquímico
condutividad
metria UV.
refração.
(eletrodo Hg
elétrica.
gotejante).
Princípio
absorbância
de luz na faixa
do UV
excitação com
mudanças no
oxidação ou
condutividade
de operação
luz produz
índice de
redução em
elétrica
uma emissão
refração da
potencial fixo
devido a
fluorescente
fase móvel
presença de
íons.
Tipo
seletivo
altamente
universal
seletivo
seletivo
depende prop.
seletivo
depende prop.
depende prop.
depende prop
do composto
depende prop.
fase móvel
do composto
do composto
do composto
10 -9 e 10 -12
10 -12
Quantidade
10 -9
10 -7
10- 8
mínima de
detecção
(g/mL)
Volume de
1-20
10-25
3-15
5-10
1,5-2,5
cela (μL)

Sistema de CLAE

Detectores.

Características de alguns detectores de CLAE Detector por Detector por Detector por Detector por Detector
Características de alguns detectores de CLAE
Detector por
Detector por
Detector por
Detector por
Detector por
espectrofoto-
fluorescência.
índice de
eletroquímico
condutividad
metria UV.
refração.
(eletrodo Hg
elétrica.
gotejante).
Sensibilidade
baixa
baixa
alta
média
Média
à temperatura
Sensível à
vazão da fase
móvel
não
não
não
sim
sim
Útil com
sim
sim
não
não
não
gradientes
Aplicações
composto que
Composto ou
geral
Espécies que
Soluções
absorvem no
derivados que
oxidam ou
aquosas com
comprimento
fluorescem
reduzem
compostos
de onda
iônicos
selecionado

Sistema de CLAE

Detector UV de Arranjo de Fotodiodos.

Sistema de CLAE Detector UV de Arranjo de Fotodiodos.

Sistema de CLAE

Detector UV de Arranjo de Fotodiodos.

Sistema de CLAE Detector UV de Arranjo de Fotodiodos.
Sistema de CLAE Detector UV de Arranjo de Fotodiodos.

Sistema de CLAE

Detector UV/VIS.

Lei de Lambert-Beer.

Requer:

Luz monocromática Concentrações baixas Solução sem turbidez

A = εBC
A = εBC

Absorbância Absortividade molar Concentração molar Comprimento de percurso da célula

(A)

= εBC A a a
= εBC
A a
a

A =

a

C =

a

Absorbância da amostra

Conc. da amostra

(B)

= εBC A p p
= εBC
A p
p

Substituindo (A) em (B)

A

a

A

p

=

C

a

C

p

A =

p

C =

p

Absorbância do padrão

Conc. do padrão

A a = C × C a p A p
A
a
= C ×
C a
p
A
p

Sistema de CLAE

Fase Móvel.

Ser de alto grau de pureza.

Dissolver a amostra sem decompor os seus componentes.

Não decompor ou dissolver a fase estacionária.

Ter baixa viscosidade.

Ser compatível com o tipo do detector utilizado.

Ter polaridade adequada para permitir uma separação conveniente dos componentes da amostra.

Sistema de CLAE

O papel da Fase Móvel.

Coluna Interação Química Fase Amostra Móvel
Coluna
Interação
Química
Fase
Amostra
Móvel

A fase móvel interage com amostra e a coluna, através de sua polaridade e características químicas, assim exercendo uma grande influência na separação.

Sistema de CLAE

Fase Móvel.

Fase Reversa.

Tipicamente a fase móvel é uma mistura de um componente aquoso, freqüentemente contendo um tampão para controle de pH, e um solvente orgânico polar miscível em água.

Solventes orgânicos. Metanol e Acetonitrila, são os mais utilizados.

Tetrahidrofurano (THF) - usualmente na proporção de 5 –20% junto com acetonitrila ou metanol para melhorar a seletividade.

Fosfato é um tampão muito utilizado.

Sistema de CLAE

Fase Móvel.

Fase Reversa.

Ordenando em uma série decrescente de polaridade e crescente de poder de eluíção.

A principal desvantagem para o uso de sais inorgânicos, é que

podem precipitar nas tubulações, bomba, injetor

cromatográfico, principalmente se a proporção do solvente orgânico for alta.

do sistema

Especial atenção de ser data a limpeza do equipamento.

Sistema de CLAE

Fase Móvel.

Fase Normal.

Utiliza solventes apolares.

O problema mais freqüente neste tipo de cromatografia – desativação da coluna de sílica ou alumina por adsorção de água.

A água adsorvida é responsável por mecanismos mistos de retenção (partição e adsorção) e produz grandes variações na retenção e seletividade.

Os solventes devem apresentar baixo teor de água.

Hexano, n-Heptano, Diclorometano e n-Propanol.

Sistema de CLAE

Sistema de CLAE Fase Móvel Características FASE NORMAL FASE REVERSA Polaridade da Fase Estacionária alta

Fase Móvel

Características

FASE NORMAL

FASE REVERSA

Polaridade da Fase Estacionária

alta

baixa

Polaridade da Fase Móvel

baixa

alta

Ordem de eluíção da amostra

- polar

+ polar

+ polar

- polar

Efeito do aumento da polaridade da FM

Reduz os tempos de retenção

Aumento dos tempos de retenção

Sistema de CLAE

Sistema de CLAE Polaridade FM Retenção FASE NORMAL

Polaridade

FM

Retenção

FASE NORMAL

Sistema de CLAE Polaridade FM Retenção FASE NORMAL

Sistema de CLAE

PolaridadeSistema de CLAE FM Retenção FASE REVERSA

FM

RetençãoSistema de CLAE Polaridade FM FASE REVERSA

FASE REVERSA

Sistema de CLAE Polaridade FM Retenção FASE REVERSA

Sistema de CLAE

Fase Móvel.

O ar dissolvido na fase móvel pode:

de CLAE Fase Móvel. O ar dissolvido na fase móvel pode: Formar bolhas na cabeça da

Formar bolhas na cabeça da bomba - pressão, interrompendo

o fluxo, prejudicando a integridade do pistão de safira e selo da bomba.

A presença de bolhas no detector pode causar ruídos muito alto.

Em ambos os casos, há oscilação da linha de base, influência sobre os tempos de retenção ou aparecimento de picos adicionais.

Sistema de CLAE

Fase Móvel.

Métodos de desgaseificação.

Ultra-som (lento, pouco eficiente)Sistema de CLAE Fase Móvel. Métodos de desgaseificação. Vácuo (lento, requer agitação) Vácuo + Ultra-som (mais

Vácuo (lento, requer agitação)de desgaseificação. Ultra-som (lento, pouco eficiente) Vácuo + Ultra-som (mais eficiente) Purga de Hélio

Vácuo + Ultra-som (mais eficiente)(lento, pouco eficiente) Vácuo (lento, requer agitação) Purga de Hélio (contínua) “Degasser” (contínuo remove

Purga de Hélio (contínua)requer agitação) Vácuo + Ultra-som (mais eficiente) “Degasser” (contínuo remove o ar logo antes de entrar

“Degasser” (contínuo remove o ar logo antes de entrar na bomba) entrar na bomba)

Sistema de CLAE

Fase Estacionária.

Sílica ou Resina de Poliestireno-divinilbenzeno

Sílica ou Resina de Poliestireno-divinilbenzeno Partículas de Sílica esféricas e irregulares. Irregulares

Partículas de Sílica esféricas e irregulares.

Irregulares são menos eficientes.

Sistema de CLAE

Fase Estacionária.

Sistema de CLAE Fase Estacionária. Macroporoso Forma irregular ou esférica 15 – 100 μ Alta capacidade

Macroporoso Forma irregular ou esférica 15 – 100 μ Alta capacidade Baixa Eficiência Baixo custo Separações preparativas Limpeza da mostra Pressão baixa

Partícula macroporosa esférica de Sílica

Sistema de CLAE

Fase Estacionária.

Sistema de CLAE Fase Estacionária. Partícula microporosa esférica de Sílica. Microporoso Forma irregular ou

Partícula microporosa esférica de Sílica.

Microporoso Forma irregular ou esférica 3 – 10 μ Alta capacidade Alta Eficiência Alto custo Separações analíticas Separações semi-preparativas Pressão alta

Sistema de CLAE

FASE NORMAL

Sílica: superfície polar e ácida.

Muito higroscópica. Adsorção de água.

Pode dar origem:

A pobre eficiência originada dos mecanismos mistos de retenção.

A pico com muita cauda para compostos básicos, causada pela interação com os sítios ácidos.

básicos, causada pela interação com os sítios ácidos. Superfície Silanol Grupos funcionais: SiOH, (CH 2 OH)

Superfície Silanol

Grupos funcionais: SiOH, (CH 2 OH) 2 (Diol), NH 2 , NO 2 e CN (Ciano).

Sistema de CLAE

FASE REVERSA

Ligação do tipo siloxano – a reação é chamada de silanização.

Si-OH Si-OH + Si-OH R1 e R3 = CH3
Si-OH
Si-OH
+
Si-OH
R1
e
R3 = CH3
R1 Cl Si R2 R3 ou O- CH3
R1
Cl
Si
R2
R3
ou
O- CH3
+ Si-OH R1 e R3 = CH3 R1 Cl Si R2 R3 ou O- CH3 Si-OH
+ Si-OH R1 e R3 = CH3 R1 Cl Si R2 R3 ou O- CH3 Si-OH
Si-OH Si-O Si-OH
Si-OH
Si-O
Si-OH

R1

Si

R2

+

R3

HCl

R2 = C18, C8, C4, C2, fenil e ciano (CN).

Sistema de CLAE

FASE REVERSA Os grupos silanos (Si-OH) que não chegaram a “silanizar- se” podem:

Promover mecanismos duplos de retenção.

Forte retenção de compostos polares.

Picos assimétricos em compostos básicos.

Adsorções indesejadas, diminuindo inclusive a vida útil da coluna.

Para eliminar este feito, usa-se o processo conhecido como “end-capping”.

Que consiste complementar a primeira silanização (C8, C18,

moléculas menores como trimetilsilano (TMS). Desativação da sílica.

) com

Sistema de CLAE

FASE REVERSA

Os grupos silanos (

) livres.

C18 Si-O-Si Si-OH NH2- C-C-C-C-C-CH3 C18 Si-O-Si
C18
Si-O-Si
Si-OH
NH2- C-C-C-C-C-CH3
C18
Si-O-Si

Sílica não desativada.

Distorção do pico (cauda) pela formação de ponte de hidrogênio com compostos básicos.
Distorção do pico (cauda)
pela formação de ponte de
hidrogênio com compostos
básicos.

Sistema de CLAE

FASE REVERSA

Os grupos silanos (

) livres.

C18 Si-O-Si Si-OH NH2- C-C-C-C-C-CH3 C18 Si-O-Si
C18
Si-O-Si
Si-OH
NH2- C-C-C-C-C-CH3
C18
Si-O-Si

Sílica não desativada.

Distorção do pico (cauda) pela formação de ponte de hidrogênio com compostos básicos.
Distorção do pico (cauda)
pela formação de ponte de
hidrogênio com compostos
básicos.

Sistema de CLAE

Limpeza da coluna após análise.

Fase Reversa – H 2 O

Limpeza da coluna após análise. Fase Reversa – H 2 O ACN:H 2 O (10:90) ACN:H

ACN:H 2 O (10:90)

análise. Fase Reversa – H 2 O ACN:H 2 O (10:90) ACN:H 2 O (90:10) Fase

ACN:H 2 O (90:10)

Fase Normal – n-Propanol

O (10:90) ACN:H 2 O (90:10) Fase Normal – n-Propanol n-Heptano Colunas 100, 125 e 150x4/4,6

n-Heptano

Colunas

100, 125 e 150x4/4,6 mm = 30’ cada etapa, fluxo de 1 ml/min

250 e 300x4/4,6 mm = 60’ cada etapa, fluxo de 1 ml/min

Procedimento de regeneração. Fase Reversa:

H 2 O

Metanol

Clorofórmio

Metanol

Fase Normal:

Heptano

H 2 O Metanol Clorofórmio Metanol Fase Normal: Heptano Clorofómio Acetato de etila H 2 SO

Clorofómio

Clorofórmio Metanol Fase Normal: Heptano Clorofómio Acetato de etila H 2 SO 4 0,05M Acetona Etanol

Acetato de etila

Clorofórmio Metanol Fase Normal: Heptano Clorofómio Acetato de etila H 2 SO 4 0,05M Acetona Etanol

H 2 SO 4 0,05M

Acetona

Clorofórmio Metanol Fase Normal: Heptano Clorofómio Acetato de etila H 2 SO 4 0,05M Acetona Etanol

Etanol

Clorofórmio Metanol Fase Normal: Heptano Clorofómio Acetato de etila H 2 SO 4 0,05M Acetona Etanol

H 2 O

Sistema de CLAE

Ativação de colunas novas

Fase Reversa – ACN ou Metanol 100%

Fase Normal – n-Heptano 100%

Antes de introduzir a FM verificar a miscibilidade com o solvente de ativação.
Antes de introduzir a FM
verificar a miscibilidade
com o solvente de
ativação.

Estocagem de colunas

Utilizar H 2 O antes de solvente tamponado.

de colunas Utilizar H 2 O antes de solvente tamponado. Fase Reversa – ACN:H 2 O

Fase Reversa – ACN:H 2 O (90:10)

Fase Normal – n-Heptano

Utilizar Etanol ou n-Propranol antes de solvente aquoso.
Utilizar Etanol ou n-Propranol antes de
solvente aquoso.

Colunas

100, 125 e 150x4/4,6 mm = 30’ cada etapa, fluxo de 1 ml/min

250 e 300x4/4,6 mm = 60’ cada etapa, fluxo de 1 ml/min

Sistema de CLAE

Sistema de CLAE

Sistema de CLAE

Sistema de CLAE