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Cromatografia Lquida de Alta Eficincia Cromatografia uma tcnica utilizada na separao dos componentes de uma amostra, os quais se distribuem em 2 fases, uma estacionria e a outra mvel. A fase estacionria pode ser um slido, um lquido retido sobre um slido, ou um gel. A fase mvel pode ser lquida ou gasosa. (IUPAC)
CDD
CP
Adsoro
Partio
Inica
Excluso
As colunas catinicas so adquiridas comercialmente na forma de sais de Na+ ou de on hidroxnio (H+) as aninicas na forma de cloreto (Cl-).
Coluna
Detector Registrador
Sistema de bombeamento
Sistema de CLAE
Reservatrio da Fase Mvel
Recipientes de vidro, ao inox ou plsticos inertes 1 a 3 L. Filtro de ao sinterizado para reter as partculas sem produzir uma queda excessiva de presso. A Fase Mvel deve ser filtrada, antes de ser colocada no reservatrio. Sistema de filtrao por membrana de 0,45 m de porosidade.
Sistema de CLAE
Caractersticas bsicas Bomba para CLAE
Quimicamente inerte (resistentes a fase mveis agressivas). Trabalha a altas presses. Fluxo contnuo, livre de pulsao. Reprodutibilidade do fluxo. Fluxo constante a curto e longo prazo. Fluxos - 0,1 a 10 mL/min analticas e at 100 mL/min preparativas Pequeno volume interno.
Sistema de CLAE
Tipo de Bomba.
Reciprocantes. So bombas que escoam volumes constantes de forma no contnua, isto pulsante. Vazo pulsando pode causar perda na eficincia da coluna e instabilidade no detector. Duplo pisto quando um pisto succiona a fase mvel o outro expulsa o lquido para fora da bomba. A vazo (fluxo) de ambos os pistes, j quase livre de pulsaes, encaminhada coluna. Amortizadores de fluxo. A principal vantagem vazo de volume constante.
Sistema de CLAE
Sistema de bombeamento.
Isocrtico: Composio da fase mvel permanece constante. Capaz de separar um nmero limitado de picos. Gradiente: Composio da fase mvel varia durante a anlise. Sistema aplicvel quando a polaridade dos compostos muito diferente. Separao de amostras complexas. A determinao de impurezas relacionadas em uma matria-prima um exemplo.
Sistema de CLAE
Injetores.
No atacado por solvente. reprodutvel e preciso. Opera a altas presses. Manual. Automtico (auto-sampler). Otimizao do tempo de anlise. Melhor reprodutibilidade analtica.
Sistema de CLAE
Injetor Rheodyne Diagrama de fluxo
Sistema de CLAE
Detectores.
Caractersticas de um detector ideal. Alta sensibilidade. Baixo rudo (quanto maior o rudo pior ser o LD). Resposta rpida a todos os solutos. Ter uma larga faixa de linearidade. Insensibilidade mudanas na temperatura e vazo da FM. No provocar alargamento do pico. No destruio do soluto. Tipos de Detectores usados em CLAE. UV/VIS. Condutividade Eltrica. ndice de Refrao. Eletroqumico. Fluorescncia.
Sistema de CLAE
Detectores.
Caractersticas de alguns detectores de CLAE
Detector por Detector por eletroqumico condutividade (eletrodo Hg eltrica. gotejante). absorbncia excitao com mudanas no oxidao ou condutividade de luz na faixa luz produz ndice de reduo em eltrica do UV uma emisso refrao da potencial fixo devido a fluorescente fase mvel presena de ons. seletivo altamente universal seletivo seletivo depende prop. seletivo depende prop. depende prop. depende prop do composto do composto depende prop. fase mvel do composto do composto 10-9 10-9 e 10-12 10-7 10-12 10-8 Detector por espectrofotometria UV. Detector por fluorescncia. Detector por ndice de refrao.
Princpio de operao
Tipo
1-20
10-25
3-15
5-10
1,5-2,5
Sistema de CLAE
Detectores.
Caractersticas de alguns detectores de CLAE
Detector por espectrofotometria UV. Detector por fluorescncia. Detector por ndice de refrao. Detector por eletroqumico (eletrodo Hg gotejante). mdia sim Detector por condutividade eltrica.
Sensibilidade temperatura Sensvel vazo da fase mvel til com gradientes Aplicaes
baixa no
baixa no
alta no
Mdia sim
sim
sim
no
no
no
geral
Sistema de CLAE
Detector UV de Arranjo de Fotodiodos.
Sistema de CLAE
Detector UV de Arranjo de Fotodiodos.
Sistema de CLAE
Detector UV/VIS.
Lei de Lambert-Beer. Requer: Luz monocromtica Concentraes baixas Soluo sem turbidez (A) (B)
A = BC
Absorbncia Absortividade molar Concentrao molar Comprimento de percurso da clula Substituindo (A) em (B)
Aa = BCa
Aa = Absorbncia da amostra
Ca = Conc. da amostra
Ap = BC p
Ap = Absorbncia do padro
Aa Ap = Ca C p
Aa Ca = C p Ap
Cp =
Conc. do padro
Sistema de CLAE
Fase Mvel.
Ser de alto grau de pureza. Dissolver a amostra sem decompor os seus componentes. No decompor ou dissolver a fase estacionria. Ter baixa viscosidade. Ser compatvel com o tipo do detector utilizado. Ter polaridade adequada para permitir conveniente dos componentes da amostra. uma separao
Sistema de CLAE
O papel da Fase Mvel.
A fase mvel interage com amostra e a coluna, atravs de sua polaridade e caractersticas qumicas, assim exercendo uma grande influncia na separao.
Sistema de CLAE
Fase Mvel.
Fase Reversa. Tipicamente a fase mvel uma mistura de um componente aquoso, freqentemente contendo um tampo para controle de pH, e um solvente orgnico polar miscvel em gua. Solventes orgnicos. Metanol e Acetonitrila, so os mais utilizados. Tetrahidrofurano (THF) - usualmente na proporo de 5 20% junto com acetonitrila ou metanol para melhorar a seletividade. Fosfato um tampo muito utilizado.
Sistema de CLAE
Fase Mvel.
Fase Reversa. Ordenando em uma srie decrescente de polaridade e crescente de poder de eluo. A principal desvantagem para o uso de sais inorgnicos, que podem precipitar nas tubulaes, bomba, injetor... do sistema cromatogrfico, principalmente se a proporo do solvente orgnico for alta. Especial ateno de ser data a limpeza do equipamento.
Sistema de CLAE
Fase Mvel.
Fase Normal. Utiliza solventes apolares. O problema mais freqente neste tipo de cromatografia desativao da coluna de slica ou alumina por adsoro de gua. A gua adsorvida responsvel por mecanismos mistos de reteno (partio e adsoro) e produz grandes variaes na reteno e seletividade. Os solventes devem apresentar baixo teor de gua. Hexano, n-Heptano, Diclorometano e n-Propanol.
Sistema de CLAE
Fase Mvel
Caractersticas Polaridade da Fase Estacionria Polaridade da Fase Mvel Ordem de eluo da amostra - polar FASE NORMAL alta baixa + polar + polar FASE REVERSA baixa alta - polar
Efeito do aumento da Reduz os tempos de Aumento dos tempos polaridade da FM reteno de reteno
Sistema de CLAE
FASE NORMAL
Polaridade FM Reteno
Sistema de CLAE
FASE REVERSA
Polaridade FM Reteno
Sistema de CLAE
Fase Mvel.
O ar dissolvido na fase mvel pode: Formar bolhas na cabea da bomba presso, interrompendo o fluxo, prejudicando a integridade do pisto de safira e selo da bomba. A presena de bolhas no detector pode causar rudos muito alto. Em ambos os casos, h oscilao da linha de base, influncia sobre os tempos de reteno ou aparecimento de picos adicionais.
Sistema de CLAE
Fase Mvel.
Mtodos de desgaseificao. Ultra-som (lento, pouco eficiente) Vcuo (lento, requer agitao) Vcuo + Ultra-som (mais eficiente) Purga de Hlio (contnua) Degasser (contnuo remove o ar logo antes de entrar na bomba)
Sistema de CLAE
Fase Estacionria.
Slica ou Resina de Poliestireno-divinilbenzeno
Sistema de CLAE
Fase Estacionria.
Macroporoso Forma irregular ou esfrica 15 100 Alta capacidade Baixa Eficincia Baixo custo Separaes preparativas Limpeza da mostra Presso baixa Partcula macroporosa esfrica de Slica
Sistema de CLAE
Fase Estacionria.
Microporoso Forma irregular ou esfrica 3 10 Alta capacidade Alta Eficincia Alto custo Separaes analticas Separaes semi-preparativas Presso alta
Sistema de CLAE
FASE NORMAL Slica: superfcie polar e cida. Muito higroscpica. Adsoro de gua. Pode dar origem: A pobre eficincia originada dos mecanismos mistos de reteno. A pico com muita cauda para compostos bsicos, causada pela interao com os stios cidos.
Superfcie Silanol
Sistema de CLAE
FASE REVERSA Ligao do tipo siloxano a reao chamada de silanizao.
R1 Cl Si R2 R3
R1 Si R2 + HCl R3
Sistema de CLAE
FASE REVERSA Os grupos silanos (Si-OH) que no chegaram a silanizar- se podem: Promover mecanismos duplos de reteno. Forte reteno de compostos polares. Picos assimtricos em compostos bsicos. Adsores indesejadas, diminuindo inclusive a vida til da coluna. Para eliminar este feito, usa-se o processo conhecido como end-capping. Que consiste complementar a primeira silanizao (C8, C18,...) com molculas menores como trimetilsilano (TMS). Desativao da slica.
Sistema de CLAE
FASE REVERSA Os grupos silanos ( C18 Si-O-Si Si-OH Si-O-Si Slica no desativada. NH2- C-C-C-C-C-CH3 C18 Distoro do pico (cauda) pela formao de ponte de hidrognio com compostos bsicos. ) livres.
Sistema de CLAE
FASE REVERSA Os grupos silanos ( C18 Si-O-Si Si-OH Si-O-Si Slica no desativada. NH2- C-C-C-C-C-CH3 C18 Distoro do pico (cauda) pela formao de ponte de hidrognio com compostos bsicos. ) livres.
Sistema de CLAE
Limpeza da coluna aps anlise. Fase Reversa H2O ACN:H2O (10:90) n-Heptano ACN:H2O (90:10)
100, 125 e 150x4/4,6 mm = 30 cada etapa, fluxo de 1 ml/min 250 e 300x4/4,6 mm = 60 cada etapa, fluxo de 1 ml/min
Procedimento de regenerao. Fase Reversa: H2O Metanol Clorofrmio Metanol Fase Normal: Heptano Clorofmio Acetato de etila
Sistema de CLAE
Ativao de colunas novas Fase Reversa ACN ou Metanol 100% Fase Normal n-Heptano 100% Estocagem de colunas Fase Reversa ACN:H2O (90:10) Fase Normal n-Heptano Colunas
Utilizar H2O antes de solvente tamponado. Antes de introduzir a FM verificar a miscibilidade com o solvente de ativao.
100, 125 e 150x4/4,6 mm = 30 cada etapa, fluxo de 1 ml/min 250 e 300x4/4,6 mm = 60 cada etapa, fluxo de 1 ml/min
Sistema de CLAE
Sistema de CLAE
Sistema de CLAE
Sistema de CLAE