Faculdade de Cincias da Universidade do Porto

Licenciatura em Bioqumica

Sntese e actividade da - amilase

Efeito do cido giberlico, do cido abscsico e do clcio em sementes de Hordeum vulgare L.
Fisiologia Vegetal Ano lectivo 2011/2012

Joo Rodrigues, Liliana Raeiro, Maria Pires

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Introduo
A -amilase uma enzima induzida pelo embrio das sementes, sendo responsvel pela hidrolisao das suas reservas, no endosperma, nomeadamente o amido. O cido giberlico (GA), que produzido no embrio das sementes, aps estas passarem por um perodo de embebio em gua, transportado at aleurona e escutelo, onde induz a sntese da -amilase, entre outras hidrolases. Na presena do GA, os nveis de mRNA total que codificam a -amilase aumentam, o que revela uma correlao entre a produo de GA e produo de -amilase. O cido abcsico (ABA) uma fito-hormona que, quando presente no embrio induz a produo de um inibidor da -amilase, constituindo assim um regulador da taxa de crescimento. Alm disso, induz a sntese de inibidores de protase bacteriolgica, constituindo o sistema de defesa do embrio. A -amilase uma metaloenzima que contm Ca 2+. A ligao de um catio Ca2+ enzima um processo irreversvel e necessrio para manter tanto a actividade como a estabilidade desta. A cicloheximida um inibidor da sntese proteica que actua ao nvel da transcrio do DNA de clulas eucariticas. A presena deste composto nas sementes inibe a sntese da -amilase, inibindo o crescimento celular do embrio. Assim, a realizao desta experincia tem como objectivo a verificao do papel do GA na sntese da -amilase e a aco do GA, do ABA e do Ca 2+ nos nveis de actividade da dita enzima e consequentemente, no desenvolvimento embrionrio da semente.

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Materiais e Mtodos
Preparao e tratamento das sementes
1. Procedeu-se desinfeco de 250 sementes de cevada com lixvia a 10%, seguindo-se de lavagens sucessivas com gua destilada. Manteve-se as sementes em papel de filtro humedecido, em obscuridade, durante 24h, temperatura de 4C. 2. Seccionou-se transversalmente as sementes e separou-se as suas metade com e sem embrio. 3. Numeraram-se placas de Petri de 1 a 6, fazendo duplicados, e pipetou-se 5 mL das seguintes solues, respectivamente: placas 1 e 2: tampo HEPES 0,01 M, pH 6; placa 3: GA 10-6 M em tampo HEPES; placa 4: GA 10-6 M + CaCl2 10 mM em tampo HEPES; placa 5: GA 10-6 M + 1 M em tampo HEPES; placa 6: GA 10-6 M + cicloheximida em tampo HEPES; 4. Colocaram-se em cada uma dessas placas 15 metades de sementes. Na placa 1 colocaram-se as metades com embrio e nas restantes as sem embrio. 5. Vedou-se as placas com parafilme e incubou-se na obscuridade durante 48h. 6. Procedeu-se ao congelamento das amostras at data da extraco.

Preparao dos extractos para a quantificao de protenas

1.Em gelo, homogenizou-se as sementes em tampo de cido ctrico-citrato de sdio 10mM, pH 5. 2.Transferiu-se e centrifugou-se o extracto a 5000rpm, no frio. 3.Conservou-se o sobrenadante em gelo.

Quantificao de protenas pelo mtodo de Bradford

1.Preparou-se 6 solues de albumina com concentraes crescentes e com o intervalo de 0,2 mg/mL entre elas.

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2. Adicionou-se reagente de Bradford a 100 microL de cada sobrenadante diludo e deixar repousar temperatura ambiente. 3. Leu-se a absorvncia a 595 nm.

Quantificao da actividade da alfa amilase nos diferentes grupos de sementes

1. Marcar os tubos de acordo com a seguinte tabela: Tubos Tratamento Controlo com embrio Controlo sem embrio GA GA+Ca
2+

Volume extracto (mL) 0,5

Volume amido (mL) 1

Tempo de reaco (min) 2

2 3 4 5 6 7 8

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

1 1 1 1 1 1 0**

4 1 2 3 3 0* Correco A580nm

ABA+GA Ciclohexamida+GA Controlo T0 Branco

*- Adicionar HCl antes de adicionar amido **- Adicionar 1 mL de H20 destilada em substituio do amido 2. Pipetou-se o extracto e a soluo de amido para cada tubo de ensaio. Aps o tempo de reaco tabelado adicionou-se HCl a 1M, excepto ao tubo 9. Adicionou-se Lugol. 3. Mediu-se a absorvncia das solues a 580nm. 4. Determinou-se a quantidade de alfa-amilase e exprimiu-se os resultados graficamente.

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Resultados
Tempo Concentrao Abs. a de % de amido Tubo proteica 580 reaco hidrolisado/mL/min (g/mL) nm (min) 1 0,7296 151,61 2 0,3483 28,46 Abs. a 595 nm 2 3 4 5 6 7 0,5902 0,6106 0,5416 0,5720 0,5771 120,94 125,43 110,25 116,94 118,06 4 2 2 2 3 0 0,3226 0,2859 0,3773 0,3090 0,2672 0,8086 15,03 32,32 26,67 30,89 22,32 % de amido hidrolisado/min/g de protena 0,375 0,248 0,515 0,484 0,528 0,378 -

Discusso dos resultados

Aps a execuo laboratorial, obtivemos os resultados anteriores. Porm, confrontados com os esperados, estes resultados so ligeiramente diferentes, quer em termos de % de amido hidrolisado/min/g de protena (apesar de estarem relativamente proporcionais) quer no tubo 5, onde seria de esperar uma menor actividade, devido presena do cido abscsico. Isto pode dever-se ao facto de____(?). No tubo 7, foi adicionado HCl antes do amido para que no ocorresse actividade enzimtica e desta forma, o tubo servisse como controlo.

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No tubo 8, foi adicionada H2O em vez de amido para que no haja substrato para hidrolisar, apesar de haver -amilase presente, servindo este tubo para fazer o branco (zero) na realizao da espectrofotometria.

No tubo 1, a percentagem de amido hidrolisado revela que ocorreu a actividade normal da -amilase pois este tratamento s continha a parte da semente com embrio. No tubo 2, a percentagem de amido hidrolisado foi menor, alis, a menor de todos os tratamentos, como seria de esperar, pois continha a parte da semente sem embrio. A pequena percentagem deve-se ao facto da semente j ter no seu interior alguma quantidade de -amilase, que acabou por hidrolisar algum amido. No tudo 3, a actividade da -amilase foi das maiores, pois adicionamos GA, alm do que j existia na semente. Desta forma comprovamos a nossa hiptese de como este aumenta a actividade da enzima, hidrolisando maiores quantidades de amido, induzindo desta forma o crescimento da semente. No tudo 4, a actividade enzimtica deveria ter sido muito semelhante do tudo 3 porm isso no se verificou. Neste tubo adicionamos GA e Ca 2+, activador da amilase. Por os resultados serem menores que os esperados podemos assumir ou houveram erros na execuo do trabalho ou o tempo de reaco e a quantidade de io clcio foram insuficientes. (???) No tudo 5, a percentagem de amido hidrolisado foi maior relativamente ao tudo 3, o que no seria de esperar. Era de esperar menor actividade da enzima pois foi adicionado, alm de GA que produziria os mesmos efeitos que anteriormente, ABA que provoca a inibio da -amilase, fazendo diminuir a sua actividade. No tubo 6, em que existe a presena de cicloheximida, inibidora da sntese proteica e consequentemente, da enzima -amilase, os resultados foram os esperados dado que a percentagem de amido hidrolisado foi menor. No poderia ser menor que a do tubo 2 porque nesse no existia qualquer fito-hormona, ao passo que neste adicionamos na mesma GA, levando a que existisse ainda uma pequena quantidade de -amilase.

Bibliografia
http://www.plantphysiol.org/content/80/2/350.full.pdf http://www.plantphysiol.org/content/91/1/415.full.pdf

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http://www.jbc.org/content/264/32/19392.full.pdf http://www.nature.com/nchembio/journal/v6/n3/full/nchembio.304.html http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c4859?lang=pt&region=PT