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INMUNIDAD FRENTE A BACTERIAS INTRACELULARES

Algunas bacterias son capaces de sobrevivir y replicarse dentro de clulas del husped, pero ciertas bacterias patgenas como Mycobacterium y Listeria monocytogenes, que resisten la degradacin dentro de los macrfagos y son por lo tanto capaces de sobrevivir y multiplicarse an dentro de los fagocitos. Como estas bacterias estn en un nicho inaccesible a los anticuerpos circulantes, su eliminacin requiere mecanismos inmunes distintos ms complejos a los ya vistos para las bacterias extracelulares. INMUNIDAD NATURAL El principal mecanismo de inmunidad innata contra bacterias intracelulares es la fagocitosis y la accin de las clulas natural killer (NK). Sin embargo, las bacterias patgenas intracelulares son relativamente resistentes a la degradacin dentro de los fagocitos mononucleares. De modo que, no es sorprendente que usualmente la inmunidad natural sea bastante ineficaz en el control de la colonizacin y la diseminacin de estos microorganismos. Las bacterias intracelulares inducen la activacin de clulas NK, ya sea

directamente o mediante la produccin de citoquinas (interleuquina 12 o IL-12) derivadas de macrfagos. Las clulas NK activadas secretan interfern (IFN-), que es a su vez un potente activador de los macrfagos, mejorando su capacidad fagoctica y microbicida. Este proceso podr retrasar el crecimiento de la bacteria; sin embargo, la resolucin definitiva de la infeccin requiere de la inmunidad adaptativa. En conclusin, se considera que las clulas NK son las clulas claves para la contencin de las bacterias intracelulares mientras se desarrolla la inmunidad adaptativa. INMUNIDAD ADAPTATIVA La principal respuesta inmune protectora contra las bacterias intracelulares es la inmunidad elaborada por clulas. Muchos antgenos proteicos de estas bacterias estimulan las respuestas de clulas T CD4+ y CD8+ y ambos tipos celulares contribuyen al desarrollo de inmunidad protectora contra las bacterias intracelulares. Una funcin central para eliminar estos microorganismos es realizada por macrfagos activados por citoquinas (IFN-), derivadas de clulas Th1 activadas.

MACRFAGO INFECTADO

MACRFAGO INFECTADO Y ACTIVADO Y

La inmunidad mediada por clulas consiste en dos tipos de reacciones: 1. Activacin de los macrfagos por las citoquinas producidas por las clulas T, sobre todo IFN-, con la consiguiente muerte de los microorganismos fagocitados. 2. Lisis de las clulas infectadas por los linfocitos T citolticos CD8+. Los inmungenos proteicos de las bacterias intracelulares estimulan los linfocitos T, tanto CD4+ como CD8+. Los CD4+ responden a los antgenos presentados por las clulas presentadoras en el contexto del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II (Un ejemplo de estos antgenos es el derivado proteico purificado (PPD) de Mycobacterium tuberculosis). Estos microorganismos son potentes inductores de la diferenciacin de los linfocitos T cooperadores CD4+ en el fenotipo TH1, debido a que estimulan la produccin de IFN- por las clulas NK, as como la produccin de IL-12 por los macrfagos. Las clulas TH1 secretan IFN-, el cual activa los macrfagos estimulando la lisis dependiente de oxgeno y enzimas que matan a las bacterias fagocitadas. El IFN- estimula tambin el cambio de isotipo de anticuerpos que activan el complemento y

opsonizan bacterias para la fagocitosis, de modo que ayuda a las funciones efectoras de los macrfagos. Los linfocitos TH1 tambin producen factor de necrosis tumoral (TNF), que induce inflamacin local. La importancia de estas citoquinas en la inmunidad frente a bacterias intracelulares ha sido demostrada en varios modelos experimentales. Si la bacteria sobrevive dentro de las clulas y libera sus antgenos en el citoplasma, estos son procesados y presentados en asociacin con molculas clase I del sistema o complejo mayor de histocompatibilidad a las poblaciones linfocitarias citolticas CD8+. Estos linfocitos se activan, lisan las clulas infectadas y producen interfern . Los dos mecanismos efectores de la inmunidad mediada por clulas (activacin macrofgica y citotoxicidad linfocitaria) se complementan entre s y actan juntos. Se ha demostrado que se requiere de los linfocitos T-CD4+ y T-CD8+ para eliminar la infeccin. La activacin de los macrfagos, que ocurre como respuesta a la presencia de bacterias intracelulares, es tambin capaz de causar dao hstico. Este se manifiesta como reacciones de hipersensibilidad de tipo retardada contra las protenas del microorganismo.

Las bacterias intracelulares han evolucionado hacia la resistencia a la fagocitosis, y a menudo persisten largos perodos dentro de los fagocitos, provocando la estimulacin antignica crnica y la activacin de las clulas T y macrfagos. Esto puede resultar en la formacin de granulomas alrededor de los microorganismos. La lesin histolgica tpica de bacterias y hongos intracelulares es la inflamacin granulomatosa. Este tipo de reaccin inflamatoria puede servir para localizar y prevenir la diseminacin de los microorganismos, aunque est tambin asociada con dao funcional severo, debido a necrosis y fibrosis de los tejidos. De este modo, la respuesta inmune del hospedero es la principal causa del dao hstico y la enfermedad en las infecciones por bacterias intracelulares. La inmunidad protectora y la hipersensibilidad patolgica pueden coexistir, ya que son manifestaciones de una misma respuesta inmune especfica frente a determinados patgenos. Las diferencias individuales en los patrones de respuesta inmune frente a bacterias intracelulares son determinantes, tanto en la progresin de la enfermedad como en el desenlace clnico. Un ejemplo de ello es la lepra, causada por el Mycobacterium leprae; existen dos formas polares de la enfermedad, aunque muchos pacientes muestran formas intermedias menos claras. En el caso de la lepra lepromatosa, los pacientes tienen altos ttulos de anticuerpos especficos, pero una respuesta celular dbil a los antgenos bacterianos. Se detectan altos niveles de IL-4 e IL-10, patrn tpico del fenotipo TH2, citoquinas que ejercen efectos inhibitorios sobre los macrfagos. La proliferacin bacteriana y la inadecuada activacin de los macrfagos dan como resultado la

aparicin de lesiones destructivas en la piel, en los huesos subyacentes y en los nervios perifricos. En contraste, los pacientes con la forma tuberculoide de la enfermedad muestran una fuerte respuesta de tipo celular y una dbil respuesta de anticuerpos. La produccin de IFN- e IL-12 sugieren la activacin del fenotipo TH1. La aplicacin intradrmica de IFN- produce efectos beneficiosos sobre las lesiones de la piel en la lepra lepromatosa. EVASIN DE LOS MECANISMOS INMUNES Un importante mecanismo de supervivencia en las bacterias intracelulares es su capacidad para resistir su destruccin dentro de los fagocitos. Las micobacterias lo logran impidiendo la fusin del fagolisosoma, quiz interfiriendo el movimiento del lisosoma. La mayora de las bacterias se inactivan cuando son fagocitadas por macrfagos y leucocitos polimorfonucleares. Sin embargo, muchos microorganismos han desarrollado estrategias para sobrevivir y replicarse en estas clulas. Algunos usan los mecanismos fagocticos preexistentes para su internalizacin, como Mycobacterium sp. y Legionella pneumophila, que se unen a fragmentos C3b del complemento lo que favorecen su captacin por las clulas fagocticas. Una vez dentro de la vacuola fagoctica, algunos patgenos disuelven la membrana vacuolar y acceden al citoplasma celular rico en nutrientes, evadiendo los mecanismos bactericidas del fagocito; por ejemplo Shigella flexneri, algunas Rocketsias y L. monocytogenes; sta ltima produce una hemolisina (listeriolisina O) que forma poros en la membrana del fagosoma.

Otros microorganismos como Mycobacterium y Legionella, son capaces de inhibir la actividad bactericida de los fagocitos impidiendo la fusin del fagolisosoma (impiden la acidificacin del fagosoma) y algunos como Coxiella burnetti, sobreviven a los agentes bactericidas liberados en el fagolisosoma (incluso requieren de factores all presentes como seales que disparan su multiplicacin intracelular).

Los principales factores de virulencia bacterianos que permiten resistir la fagocitosis y facilitan la sobrevida intracelular incluyen las cpsulas y la produccin de enzimas que destruyen la membrana vacuolar, que degradan protenas lisosmicas, o que neutralizan los radicales txicos del oxgeno.

Principales estrategias para la evasin de los mecanismos a la respuesta inmune.

SALMONELLA
Salmonella es un bacilo Gram negativo que se comporta como patgeno intracelular facultativo, se divide en dos especies Salmonella bongori y Salmonella enterica, tomando en cuenta sus caractersticas bioqumicas generales. Esta ltima se subdivide en seis subespecies: enterica, salamae, arizonae, diarizonae, indica y houtenae; las salmonelas de mayor importancia mdica pertenecen a las subespecies enterica y arizonae y son consideradas serovars. Por lo que la nomenclatura que se est manejando actualmente es Salmonella enterica serovar Typhi, S. enterica serovar Paratyphi, S. enterica serovar Typhimurium. Segn el esquema clsico de Kauffman-White basado en antgenos somticos, flagelares y ocasionalmente capsular (Vi), las salmonelas se clasifican en ms de 2,500 serotipos, que pueden ser mviles o inmviles. Hay situaciones epidemiolgicas en las que es preciso afinar an ms la diferenciacin dentro del serotipo correspondiente, para tal fin se utiliza la fagotipificacin, sobre todo para las cepas causantes de epidemias en el hombre. Uno de los patgenos entricos ms frecuentes tanto en pases desarrollados como subdesarrollados es Salmonella spp, la cual dependiendo de su especie, tamao del inculo, factores de virulencia expresados por la cepa, hospedero involucrado, estado inmunolgico del paciente e intervencin mdica puede ocasionar desde una infeccin gastrointestinal media a severa hasta una infeccin sistmica que compromete la vida del paciente. La salmonelosis es una infeccin de importancia tanto en salud pblica como

en salud animal debido al impacto econmico que ocasiona; es una enfermedad aguda, de distribucin mundial, transmitida por los alimentos. Se estima que se presentan ms de 16 millones de casos de fiebre tifoidea por ao con aproximadamente 6,000,000 casos fatales y 1,300 millones de casos de gastroenteritis con una mortalidad que alcanza los 3 millones. En Per en el 2009, setenta y ocho trabajadores de la planta de licuefaccin del gas de Camisea de Pampa Melchorita, en la provincia de Caete, en Lima, fueron trasladados de emergencia a dos centros de salud de Chincha, se habran intoxicados masivamente por la bacteria salmonella, segn las primeras investigaciones en torno a este caso que remeci el sur chico. Salmonella es el gnero bacteriano que ocasiona mayores prdidas a la industria avcola, as como problemas de salud pblica para el consumidor. MECANISMOS DE ADHERENCIA La supervivencia de un microorganismo en un nicho determinado depende de su habilidad para adherirse, las adhesinas de la bacteria tienen una estructura que les permite reconocer molculas presentes en las clulas del hospedero llamadas receptores, con una estereoqumica especfica. Esta unin determina los hospederos y el organotropismo de las bacterias; adems, las adhesinas tienen la capacidad de activar a los linfocitos B y neutrfilos, lo que resulta en una variedad de respuestas biolgicas incluyendo proliferacion celular y secrecin de citocinas. En las bacterias, se puede encontrar una amplia variedad de adhesinas, las cuales se dividen en dos

grandes grupos: adhesinas fimbriales y adhesinas afimbriales, como la hemaglutinina filamentosa de Bordetella pertussis y el antgeno pH6 de Yersinia pestis, AfaD, AfaE en E. coli y protena M de Streptococcus. En general, las adhesinas de bacterias Gram negativas son: fimbria, fibrilla, flagelo, lipopolisacrido (LPS) y cpsula. La presencia de cpsula y flagelo en Salmonella depende de la especie en cuestin, solamente S. enterica serovar Typhi, S. enterica serovar Paratyphi C y S. enterica serovar Dublin presentan cpsula y

todas las salmonelas se consideran mviles a excepcin de S. enterica serovar Gallinarum. Estudios recientes muestran que S. enterica serovar Pullorum tiene motilidad en agar semislido o en agar Hekten incluso en estudios de microscopia electrnica se ha observado un flagelo pequeo y deformado. Es comn el aislamiento de una bacteria que exprese mltiples tipos de fimbria. Salmonella expresa una amplia variedad de fimbrias con diferente especificidad de unin, como se muestra en la siguiente tabla.

Despus de la entrada al hospedero, un patgeno bacteriano puede adherirse tanto directamente a la superficie de la clula hospedera o a la matriz extracelular, cuando el tejido est daado la matriz extracelular subyacente es expuesta, SEF17 se encarga de mediar la adherencia a una gran variedad de matrices extracelulares y protenas sricas, incluyendo fibronectina, laminina y plasmingeno. Se han descrito diferentes operones en cada una de las variedades de S. enterica, cada uno de ellos participa en

la adhesin a diferentes tipos celulares. Los genes de cada opern se expresan cuando en el hospedero las condiciones fsicoqumicas son las adecuadas, como la temperatura, pH, osmolaridad y disponibilidad de nutrimentos. El opern lpfABCDE se encuentra localizado en el centisoma 80 de S. entrica serovar Typhimurium y est flanqueado por secuencias similares a las descritas en E. coli K12 y O157:H7, sugiriendo que dicho opern puede haber sido adquirido por transferencia horizontal durante la evolucin.

La interaccin de un patgeno con una clula hospedera usualmente provoca la activacin de caminos de sealizacin de la clula hospedera, ya sea de manera directa por componentes bacterianos o por estimulacin de factores activadores del hospedero, como las citocinas inflamatorias. Tales activaciones pueden alterar la superficie de la clula hospedera, proveyendo as al patgeno con receptores de adhesinas alternos. Esta idea fundamental ha llevado a una gran cantidad de investigaciones para comprender cmo los patgenos bacterianos se adhieren a las clulas hospederas. Consecuentemente hemos aprendido en gran parte sobre la biognesis de las adhesinas, su regulacin y en una menor proporcin la identidad de los receptores. El receptor del hospedero que una adhesina reconoce, determina la especificidad del tejido por esa adhesina y la colonizacin o persistencia bacteriana. MECANISMO DE INVASIN Muchos microorganismos patgenos son capaces de entrar y sobrevivir dentro de las clulas eucariticas. Tal es el caso de Salmonella, que luego de la ingesta de agua y/o alimento contaminado, esta inicia su ciclo de infeccin a travs de tejido linfoide invadiendo as al hospedero, dirige su arribo a clulas hospederas que no son normalmente fagocticas como la superficie de la capa mucosa de clulas epiteliales. El mecanismo por el cual Salmonella invade las clulas del hospedero es conocido como disparo (trigger). La bacteria enva seales a las clulas epiteliales que inducen re arreglos del citoesqueleto dando lugar a la formacin de ondulamiento (ruffling) en su superficie, como respuesta al contacto.

Presumiblemente, esta tcnica de invasin asegura un nicho celular protegido para que el microbio se replique o persista. Se reconocen varias protenas efectoras de la SPI-1, involucradas en los re arreglos del citoesqueleto: SipA, SopE, SopE2 y SopB. SipA es una protena de unin a actina, que inhibe la despolimerizacin de F-actina y activa T-plasmina, su chaperona es SicA (SipE en S. enterica serovar Typhi). SopE se comporta como GEF (guanine exchange factor) en las protenas RhoGTPasas: CDC42 y Rac induciendo ruffling de la membrana, que permite la internacin de Salmonella adems estimula MAP cinasas (Mitogen-activated protein), Erk (quinasa reguladora por seales extracelulares), JNK (quinasa terminal) y p38. Es codificada porun fago temperado defectuoso de la familia P2, localizado en el centisoma 60 del cromosoma de Salmonella; anlisis de la secuencia del ADN aledaas a sopE, revelaron marcos abiertos de lectura (ORF) con secuencias significativamente similares a la cola de fagos y recombinasas sitio especfico. La protena SopE2 muestra un 69% de homologa con la secuencia de SopE, activa a CDC42, la cual acta con la familia de protenas del sndrome de WiskottAldrich (WASP) para activar al complejo Arp2/3, compuesto de 7 subunidades, incluyendo dos protenas relacionadas con actina y la protena p41-Arc. Este complejo inicia la polimerizacin de actina y ramifica filamentos de actina. El gen responsable de codificar dicha protena se encuentra localizado en el centisoma 40-42. SopB (Salmonella outer protein), como se conoce para S. enterica serovar Dublin, o SigD (Salmonella invasin genes) para S. enterica serovar Typhimurium, por su actividad de inositol

fosfato fosfatasa, tambin reorganiza el citoesqueleto de actina. La protena SptP (Salmonella protein tirosin phosphatase) es una tirosin fosfatasa, que independientemente de esta actividad, se comporta como GAP (GTPasa activating protein), es decir, cambia RacGTP a RacGDP, con lo que evita el ruffling estimulado por SopE adems antagoniza la activacin de JNK; su porcin amino-terminal comparte secuencias similares con YopE, en su porcin carboxiterminal es semejante a YopH as como al dominio cataltico de algunas tirosin fosfatasas de clulas eucariticas. Salmonella puede invadir varias lneas celulares y se considera que puede estimular ms de un camino de transduccin de seales para promover su entrada a las clulas del hospedero. En clulas HeLa y en fibroblastos de ratn B82 la bacteria estimula a la fosfolipasa C, que cataliza la escisin del fosfatidilinositol 4-5 bifosfato (PIP2) de membrana, generando inositol 1,4-5 trifosfato (IP3) y diacilglicerol (DAG). IP3 induce la liberacin del Ca2+ almacenado en el retculo endoplsmico (RE). El calcio y el fosfoinositol afectan protenas de unin a actina, muchas de las cuales (alfa-actinina, talina, tubulina, tropomiosina y ezrina) son recluidas en el sitio de entrada de la bacteria. El DAG junto con el Ca2+ activan a la protena quinasa C (PKC), el Ca2+ junto con la PKC sirven para activar a otras enzimas y finalmente a factores de transcripcin. El evento involucra CDC42 y Rac1 pero no Rho. Las citocalasinas B y D, que evitan la polimerizacin de los microfilamentos de actina previenen la entrada de Salmonella, mientras que los inhibidores de la tirosin cinasas no bloquean la entrada.

Todo parece indicar que la penetracin de Salmonella a la mucosa intestinal es esencial para causar infeccin letal, el hecho de bloquear la penetracin a la mucosa intestinal al mutar genes involucrados en invasin, permite obtener cepas atenuadas que pudieran ser utilizados como posibles inmungenos. Salmonella produce efectos citotxicos que resultan en la destruccin de las clulas M y la invasin de enterocitos adyacentes tanto por la cara apical como por la basolateral, induce apoptosis de macrfagos activados mediante la protena efectora SipB (Salmonella invasion protein) y fagocitosis inducida en macrfagos no activados, para poder ser transportada a hgado y bazo. SipB se asocia con la proteasa proapopttica caspasa I (ICE) que activa a las citocinas proinflamatorias IL-1 e IL-18. El fenotipo citotxico es dependiente de la fase de crecimiento bacteriano. Lundberg, demostr que cultivos bacterianos en la fase logartmica de crecimiento son citotxicos, mientras que en la fase estacionaria no lo son. Recientemente, Santos reporta que los cultivos en fase estacionaria tambin son citotxicos de manera SipB-independiente, despus de 12-18 horas postinfeccin, dicho evento es dependiente de OmpR y SPI-2 y permite la diseminacin de Salmonella por endocitosis de cuerpos apoptticos. Salmonella enterica serovar Typhimurium puede llegar a hgado y a bazo por una ruta alterna, que no requiere colonizacin intestinal o invasin de clulas epiteliales intestinales, la bacteria es llevada directamente del lumen intestinal a circulacin, bazo e hgado por fagocitos que expresan CD18.

Los modelos de cultivos celulares in vitro han sido de gran utilidad para comprender la interaccin entre Salmonella y las clulas eucariticas, la identificacin de los genes involucrados en el proceso infeccioso as como los factores que regulan estos genes. Se tienen reportes del empleo de clulas HeLa, Henle-407, CHO, Hep-2, VERO, BAT, MDCK; lneas celulares de adenocarcinoma humano: Caco-2, HT29 y T8436,52 tambin se han utilizado lneas de macrfagos J774, RAW 264.7.

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