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Karl Andree
IRTA Sant Carles de la Rapita
Introduccin
Estructura del ADN y Terminologa Metodologa Bsica
Clonacin / Secuenciacin Marcadores Gnica Deteccin Gnica
Southern / northern blots Microarray PCR y RFLP
Expresin Gnica
qPCR (PCR a tiempo real) northern blots
X-ray Crystalography 1953 Single DNA Crystal 1990s Scanning Tunneling Microscopy 2003
DNArt
x 147 = 587!!!
5 5
Terminologa Bsica
Coding Strand (sentido) - la secuencia se muestra de izquierda a derecha de 5a 3 Non-coding Strand (antisentido) - la secuencia normalmente se representa de izquiera a derecha de 3 a 5, aunque puede mostrarse en sentido contrario
El ARNm se copia a partir de esta cadena de forma que la secuencia final del ARNm es la misma que la de la cadena codificante El ADNc se sintetiza a partir del ARNm, usando transcriptasa inversa, por tanto es un duplicado de la cadena no codificante 5- CAATGATGGTATGGAATTCCTGCAGGGGCCCTAG -3 3- GTTAC TACCATACCTTAAGGACGTCCCCGGGATC -5
Reverse Complement Strand (o Complement Strand) es la secuencia opuesta que se aparea a la cadena de referencia, mientras que la Reverse Strand es la misma secuencia que la cadena de referencia escrita con la polaridad opuesta
5- CTAGGGCCCCTGCAGGAATTCCATACCATCATTG -3
Taxonomy/Phylogeny
Collect Sequences from GenBank or EMBL
Do Computer Alignment of Sequences Design primers for YFG from consensus of alignment PCR Amplification of YFG Clone PCR products Sequence clones Edit sequences and add to alignment Phylogenetic Analysis Analyze & Compare Sequences to identify mutations, etc Design primers or probes Test primers/probes
Gene Detection/Expression
Collect Biological Samples
Extract DNA or RNA
BioInformatics Consortium: Design microarrays, Create transgenic animals, Whole genome comparisons, Etc...
Archive samples for later testing
Clon
Def.: - una clula, producto celular u organismo que es genticamente idntico a la unidad o individuo del que procede. Los clones se pueden guardar en genotecas que representan la totalidad o una fraccin del genoma de un organismo. Las tcnicas de PCR o DNA splicing son mtodos para el aislamiento de fragmentos especficos de ADN clonado. Los plsmidos, los virus, y cromosomas artificiales (YACs, BACs) se usan como vectores para la duplicacin de ADN clonado y para asegurar un archivo estable de la secuencia. DNA splicing (mediante enzimas de restriccin) es un mtodo comn para la insercin de ADN clonado en un vector. tambin los vectores TA, basados en la actividad polimerasa no especfica de la polimerasa de ADN Taq, son comunes.
Enzimas de Restriccin
Aisladas a partir de bacterias que las usan como una forma de sistema inmunolgico molecular para destruir ADN vrico
El Premio Nobel de Medicina de 1978 fu concedido por su descubrimiento Inici la poca del ADN recombinante (la R en RFLP)
El nombre de cada enzima proviene del de la bacteria a partir de la que se aisla (ej. Sex AI Streptomyces exfoliata) Las enzimas ms comunes en biologa molecular son las que reconocen secuencias de nucletidos palindrmicas de 4-6 pb 5-G AATTC (ej. Eco RI 3-CTTAA G- 3 ) - 5 Cada enzima slo corta en su sitio de reconocimiento especfico
Restriction Fragment Length Polymorphism ..ms despus
Secuenciacin de ADN
Las secuencias de 5 ADN son generadas por mquinas
Las mquinas tambin cometen errores Lee ambas cadenas y comprueba visualmente tus datos! 3
Anlisis Filogenticos
Neighbor Joining Maximum Parsimony Maximum Likelihood Bayesian Method
Alineamiento de Secuencias
Las secuencias consenso se analizan en un editor de alineamientos Todas las secuencias se alinean mecnicamente y se editan manualmente
BioEdit y otros freeware contienen Clustal W para alineamientos mecnicos hand alignments, o edicin manual, necesarios para la revisin de transversiones y transiciones con el fin de corregir los errores de alineamiento producidos por la mquina
I. Deteccin de Genes
Southern Blot & Northern Blot
Hoy qPCR prcticamente ha reemplazado a los northern blots
Microarray
puede detectar diferencias grandes de expresin gnica entre muestras a baja resolucin a menudo se usa para identificar genes de inters para experimentos de alta resolucin o estudios de expresin gnica con qPCR
Usados para la identificacin de genes que se expresan de forma diferente Caro de desarrollar porque requiere:
Equipo especializado Conocimiento previo sobre todo el genoma, o una genoteca de ADNc completa
ADN Microsatlite
Secuencias de ADN altamente repetitivas descubiertas usando curvas Cot (Britten & Davidson 1960s)
Romper el ADN en fragmentos de 400 - 500 pb Calentar el ADN para desnaturalizarlo y obtener cadenas sencillas Enfriar lentamente y tomar muestras a distintos tiempos
Slo una inflexin en una curva Cot creada con ADN bacteriano no microsatlites! Debido a la alta incidencia de mutacin y la mutltiplicidad de los alelos
Despus: 13 copias
5 CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG 3 3 GTCGTCGTCG TCGTCG TCGTC GTCGTC GTCGTCGTC GTC 5
Microsatlites
tambin llamados Simple Sequence Repeats (SSRs) o Variable Number Tandem Repeats (VNTRs), son loci polimrficos presentes en ADN nuclear y organelar que consisten en unidades repetidas de 1-4 pares de bases de longitud debido a la alta incidencia de mutacin y la mutltiplicidad de los alelos son tiles para realizar comparaciones genticas intra-especies de alta precisin los ensayos pueden resultar caros de desarrollar si no se conoce la sccuencia genmica constituyen una herramienta relativamente barata de usar para estudios de poblaciones o de paternidad Son tiles como marcadores en Quantitative Trait Loci (QTL) para reproduccin selectiva Forward Primer
0 - GAATTCCGGGGTCCTTCCCAGACACGTGTGTGTGTGTGAGTGTGTGTGTG -50 51- TGTGAGTGTGGTGGTTTGCCTTATTCAGTGGTGCCACTCCATCATGCGAG -100
Reverse Primer
Alelos Microsatlite
el tamao de los alelos es normalmente pequeo: 50500 pb la existencia de un nmero alto de alelos hace que sean muy tiles en estudios de poblaciones la tcnica analtica se basa en PCR fcilmente adaptable a la mayora de laboratorios, tambin puede ser subcontratada a travs de diversas compaias de biotecnologa
Repeat No.
primer A
primer B
6 9 5 7
1
9 7
2
6 7
3
6 5
Las secuencias gnicas pueden ser inferidas mediante el uso de enzimas de restriccin y sus secuencias de restriccin correspondientes Se comparan fragmentos de ADN procedentes del ADN genmico completo o fragmentos amplificados mediante PCR
se compara ADN cortado vs. ADN sin cortar, y se compara entre especies realizando digestiones con diferentes enzimas de restriccin
Ase I
M WSHV1 WSHV2 M
Hind Sst Hind Sst
ADN Ribosomico
TEM Imagen de transcripcin
De gra Int da ac do to
18S
5.8S
ITS-1 ITS-2
28S
18S
5.8S
ITS-1 ITS-2
28S
ETS
ETS
ETS
ADN Ribosomico
Large Subunit -30 proteins -24S rRNA -5.8S rRNA Small Subunit -20 proteins -18S rRNA
18S
5.8S
ITS-1 ITS-2
28S
18S
5.8S
ITS-1 ITS-2
28S
ETS
ETS
ETS
Secuenciacin Mitocondrial
Heredado slo a travs de la linea materna
secuencias altamente conservadas, pero tambin alta tasa de mutacin dentro de linajes
AF42 AF43 AF40 AF39 AF38 AF36 AF30 AF28 AF25 AF12 AF8 AF1 Afallax AF51 AF22 AF3 AF15 AF16 AF18 AF19 AF20 AF27 AF49 AF2
http://mitofish.ori.u-tokyo.ac.jp/
base de datos de ADN mitocondrial para especies de peces
A. fallax
AF6 AF14 AF31 AF29 AF33 AF7 AF9 AF26 AF24 AF32 AA13 Aalosa AA14 Aalosa AA12 Aalosa AA11 Aalosa AA10 Aalosa AA9 Aalosa AA8 Aalosa AA4 Aalosa AA2 Aalosa AA1 Aalosa AA3 Aalosa AA5 Aalosa AA7 Aalosa AF37 AA6 Aalosa AA15 Aalosa AF5 AF23 AF46 AF47
A. alosa
C1 M ZI ZII ZI M C1 ZII
(E T) CtT (E R) CtR
Cycle number
La expresin relativa muestra varios genes bajo la influencia de los niveles de vitamina A en la dieta Muestras de larvas a los 18 dph 14 Comparacin de 3 dietas con 12 18 dph * concentraciones diferentes de 10 vitamina A y dieta normal 8
= R450 (dieta control normal) = R900 = R2250 = R4500 6 4 2 0 -2
AR R AR R
P AR P on op e e st st O O in nt o
in ct e
Resumen
YFG
Estudios de historia vital: - identificacin de fases del desarrollo Filogentica / Sistemtica Decubrimiento / descripcin de genes Deteccin de mutaciones
Respuestas fisiolgicas (estrs, nutricin, estado del desarrollo, interacciones huesped/parsito, etc) Microarray detectar diferencias grandes de expresin gnica entre muestras a baja
resolucin
Expresin de gnes alta resolucin de estados de expresin gnica alterada Manipulacin de gnes RNAi, genes anti-sentido, mutagnesis dirigida, gene knock-outs usando animales transgnicos
Resources
GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
tambin EMBL (European Molecular Biology Laboratory) & DDBJ (DNA Data Bank of Japan) Bsqueda y descarga de secuencias de ADN y proteinas Anlisis BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) para comparacin de secuencias
T T G C A A C G T T C A G T
Nmero de ciclo 0 1 2 3
Nmero de Ciclos
El uso de espectrofotometra
A260 = 1 = 50 g/ml de AND genmico; o 0.1 < A260 < 1 A260 / A280 ~ 1.9
[DNA] = A260 x Dilucin x 50 g/ml
Absorbance
0.5
DNA P rotein
0 260 nm 280 nm
Wavelength
Esenciales para el inicio de la amplificacin Define los extremos finales para rondas de amplificacin sucesivas Los primers son:
De cadena sencilla normalmente 15 - 30 pb de longitud ~50 % G/C estabiliza la unin del primer Acabado en el extremo 3 con una G/C estabiliza el inicio de la polimerizacin
GCTAGCATGACCTCGTGAATGGGCTAG 3
GTGTATCATGACGTAGATTCGGGCCC 3
Hay que usar el espectrofotmetro para comprobar los stocks del primer
A260 = 1 = 33 g/ml [primer] = A260 x Dilucin x 33 g/ml
RT-PCR
Reverse Transcription PCR (PCR con Transcripcin inversa)
Requiere sntesis previa de ADN a partir de un ARN plantilla (template). La transcriptasa inversa es una ADN-polimerasa dependiente de ARN. La polimerizacin de ADN puede tener lugar en el mismo tubo de reaccin o separadamente.
Se puede realizar usando colorante de unin a ADNds (SyberGreen), o formas diversas de sondas fluorognicas como Taqman. Probabilidad reducida de falsos positivos puesto que los tubos de ADN amplificado nunca se abren para realizar geles de agarosa. Los resultados se obtienen en menos tiempo - no hay geles de agarosa. Rango dinmico amplio - cuantificacin precisa con ms de 7 rdenes de magnitud.
False Positive
False Positive
Amplification Plot
Dissociation Curve
Altamente especfico y preciso sobre siete rdenes de magnitud Puedes disponer de un juego entero diseado para t si se conoce la secuencia
www.appliedbiosystems.com
El anlisis de las curvas de desnaturalizacin para la deteccin de falsos positivos no es posible con los ensayos Taqman Siempre que sea posible disea la sonda de manera que cubra una unin exon/exon para evitar la deteccin de ADN genmico
Denature
primer F
Anneal
primer F
Extend
Cambia de guantes entre tareas Siempre incluye un control de slo reactivo Asigna tareas especficas a las pipetas
Preparacin del cocktail Preparacin de ADN Carga del gel
Contaminacin
Rompe el ciclo!
Limpia gradillas & superficies entre usos La contaminacin de la PCR se autoperpetua
Amplificacin
Acknowledgements:
Carles Garcia Nacho Fernandez Carmen Lopez Guillermo Guerao Enric Gisbert Miguel Angel Lopez Guiomar Rotllant Ana Roque
Investigant el present, apropant el futur www.irta.es
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