Tema 9.

Tcnicas de manipulacin gentica

Bioqumica y Biologa Molecular

TEMA 9

TCNICAS DE MANIPULACIN GENTICA

1. 2. 3. 4. 5. 6. Introduccin Las enzimas de restriccin. Aislamiento del ADN forneo Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN Hospedadores. Introduccin del vector/ADN forneo Mtodos de seleccin Obtencin de genotecas 7. Electroforesis en geles de azarosa 8. PCR (polymerase chain reaction)

1. Introduccin La ingeniera gentica o clonacin molecular o tecnologa del DNA recombinante son trminos acuados para describir un amplio nmero de tcnicas que tienen por objeto la manipulacin de los genes que componen un organismo que puede ser desde una bacteria hasta una planta o un ser humano. Se considera que los padres de la ingeniera gentica son dos investigadores americanos en cuyos laboratorios se estudiaban durante los aos 70 los plsmidos bacterinos (Stanley Cohen, U. Stanford) y las enzimas de restriccin-modificacin (Herbert Boyer, U Columbia, San Francisco). Estos cientficos colaboraron estrechamente y sentaron las bases del DNA recombinante. La clonacin molecular consiste bsicamente en insertar un segmento de DNA que nos interesa en una molcula con capacidad autnoma de replicacin, que llamamos vector. Este vector artificial se introduce en el organismo hospedador adecuado, lo que se traduce en la sntesis de grandes cantidades del DNA deseado. Cada colonia que proviene de una sola clula se denomina clon.

Los principales pasos de la estrategia general de la clonacin son:

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1. 2. 3. 4.

5.

Aislamiento del DNA forneo que queremos clonar Unin del fragmento al vector o vehculo de clonacin Introduccin del vector con el DNA forneo en la clula hospedadora Seleccin de la clula hospedadora con el DNA forneo Determinar si la informacin gentica se mantiene de forma estable.

Algunos de estos pasos son ms o menos comunes a todos los organismos, otros como la introduccin del vector con el DNA forneo en la clula hospedadora o la seleccin de la clula transformada pueden variar mucho segn el organismo en cuestin.

2. Las enzimas de restriccin. Aislamiento del ADN forneo El aislamiento del DNA forneo puede efectuarse utilizando una de las dos estrategias siguiente: seleccin desde el genoma que lo contiene o sntesis directa a partir de RNA mensajero.

CortesEndonucleasas de restriccin o restrictasas Fragmentacin mecnica Aislamiento Sntesis Sntesis de DNA a partir de RNA mensajero Sntesis qumica directa

Endonucleasas de restriccin Son enzimas capaces de cortar el DNA. Podemos agruparlas en tres tipos: Tipo I y Tipo III. Son enzimas multifuncionales con las actividades de restriccin y modificacin. Necesitan Mg2+ y ATP y S-adenosil-metionina. Reconocen la secuencia de reconocimiento, despus recorren un cierto nmero de bases, unas 1000 en el caso de endonucleasas tipo I y unas 25 en el caso de las tipo III, por lo que rompen el DNA por secuencias ms o menos al azar.

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Tipo II. Rompen el DNA por la secuencia de reconocimiento por lo que dan lugar a fragmentos de longitud y secuencia definidas. Necesitan Mg2+ pero no ATP.

La utilidad prctica de las endonucleasas tipo II es incalculable. Se han aislado miles de enzimas de restriccin tipo II en diferentes especies bacterianas y se emplean como herramientas para cortar el DNA artificialmente. Generalmente reconocen secuencias palindrmicas con entre 4 y 7 pares de bases. Las secuencias palindrmicas son aquellas que se leen igual en sentido 5-3 en ambas cadenas complementarias. En la Figura 1 se muestran algunas endonucleasas de restriccin con sus secuencias de reconocimiento. La Figura 2 muestra algunos palndromes.

Figura 1. Secuencias de reconocimiento de algunas enzimas de restriccin.

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Figura 2. Palndromes.

La nomenclatura utilizada para denominar estas enzimas consiste en: 1. Tres letras cursivas que corresponden al nombre del microorganismo: Escherichia coli (Eco); Haempphilus influenzae (Hin). 2. La estirpe si la hubiera EcoR, aislada de la estripe RY13 de E. coli. 3. En nmeros romanos un nmero para distinguir si hay ms de una endonucleasa aislada de esa misma especie, no se debe confundir con el tipo. 4. Todas deberan llevar delante una R de restriccin o un M de metilasa, pero generalmente se omite.

Como se ha comentado, la gran mayora de las endonucleasas tipo II reconocen y rompen el DNA por secuencias concretas de entre 4 y 7 pares de bases que poseen simetra rotacional, secuencias palindrmicas:

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DABALE ARROZ A LA ZORRA EL ABAD DABA LE ARROZ AL A ZORRA ELABAD Por ejemplo, el corte con EcoRI produce el siguiente resultado: 5-G AATT C 3-C TTAA G Los cortes pueden dar lugar a: Extremos cohesivos en 5 Extremos cohesivos e 3 Extremos romos ej: EcoRI (Figura 3) ej: Pst I ej: HaeIII 5-G 3-CTTAA AATTC-3 G-5

GAATTC CTTAAG
Figura 3. Corte con EcoRI. Generacin de extremos cohesivos.

Los extremos romos son compatibles entre si para posteriores uniones, pero la unin es ms difcil. Los extremos cohesivos slo son compatibles entre s, si han sido cortados por la misma enzima o por endonucleasas con la misma secuencia de corte. Las enzimas con la misma secuencia de reconocimiento se llaman isoesquizmeros, pero pueden no cortar por el mismo sitio.

3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN Todos los vehculos de clonacin tienen como propiedad indispensable que pueden replicarse autnomamente. Adems es necesario que puedan
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separarse fcilmente del resto del genoma y que contengan regiones no esenciales para su propagacin y estabilidad. Plsmidos. Son replicones de DNA circular que se replican independientemente, aparecen de forma natural en las bacterias pueden tener entre 5.000 y 400.000 pares de base. La organizacin de la informacin gentica en bacterias responde en general a un cromosoma circular y una serie de fragmentos de DNA circular con capacidad autnoma de replicacin denominados plsmidos. Pueden introducirse en las clulas bacterianas por un proceso llamado transformacin. Las propiedades deseables en un plsmido para que sea un buen portador gentico son: Bajo peso molecular, as puede incorporar ms informacin. Control relajado (muchas copias por clula que se replican de forma no asociada al cromosoma). Amplio rango de hospedadores. Fenotipo seleccionable, es decir, que genticos como resistencia a antibiticos. Buen mapa de restriccin.

posea

marcadores

En la Figura 4 se representa un plsmido ejemplo, el plsmido de E. coli pBR322.

Figura 4. Plsmido pBR322 de E. coli.

Los plsmidos usados en ingeniera gentica son relativamente pequeos, se replican bajo control relajado y llevan genes de resistencia especficos a uno o ms antibiticos. Contienen adems un cierto nmero de sitos de restriccin para endonucleasas en los que el DNA que queremos clonar puede insertarse.

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Virus. Se emplean para introducir DNA forneo en una clula hospedadora. Entre los ms utilizados pueden destacarse como ejemplos los siguientes:

Para bacterias: Para plantas: Para mamferos:

Fago y sus derivados Fago M13 CaMV (virus del mosaico de la coliflor) SV40

El fago (Figura 5) es un virus parsito de E. coli. Su DNA es una molcula lineal bicatenaria de unos 48.5 Kb, de las cuales aproximadamente 1/3, 23 Kb, no contienen informacin esencial. En cada extremo posee prolongaciones cortas 5`monocatenarias cohesivas que le permiten recircularizarse en la clula hospedadora, estos sitios se llaman sitios cos. El corte por los sitios cos y el empaquetamiento en la cpsida pueden hacerse in vitro. La cpsida normalmente admite entre 38 y 53 Kb (-20% y +10% del DNA de fago ), por lo que no se pueden insertar fragmentos muy grandes de DNA. Como el fago normalmente tiene muchos sitios de corte, por lo general se usan derivados del fago en los que se han incluido modificaciones. La inclusin del DNA en la cpsida se hace de forma anloga a como ocurre en la naturaleza, por empaquetamiento in vitro. Existen kits comerciales que traen las protenas de la cpsida, la cola y todos los reactivos necesarios. El fago M13 o el MP8 incluyen un poligando o polylinker, pequeo fragmento que tiene sitios de restriccin para muchas restrictasas.

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Figura 5. Fago l. Esquema de su secuencia de DNA y estructura del virus.

Cosmidos. Es un artificio de laboratorio, un plsmido que posee el sito cos del fago , un origen de replicacin igual que otros plsmidos, marcadores genticos y puntos nicos de corte para ciertas restrictasas. La informacin se introduce en el hospedador por empaquetamiento in vitro, igual que en los fagos, pero una vez dentro del hospedador se comporta como un plsmido. Puede empaquetar eficazmente entre 38 y 53 Kb pero dado el pequeo tamao de los csmidos 5.4 Kb admite insertos mucho mayores que los que admiten otros vectores (Figura 6). Vectores YACs (yeast artificial cromosomas). Algunos genes de eucariotas son tan grandes que pueden superar los 1000 kb. Mediante el uso de genotecas basadas en plsmidos o fagos o csmidos slo es posible clonar pequeos fragmentos de stos. Los YACs son segmentos lineales de DNA de levaduras que contienen todos los elementos necesarios para la replicacin autnoma en una levadura (origen de replicacin, centrmeros y telmeros). DNAs de cientos de kilobases pueden insertarse y clonarse con los YACs. El uso de vectores capaces de incorporar segmentos de DNA mayores se hace necesario cuando vamos a clonar genomas muy grandes, como el genoma humano con un milln de pares de bases. Esto reduce el nmero de clones necesarios para tener una librera genmica completa (Figura 6).

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(A)

(B)

Figura 6. Csmico YAC (B). (A) y

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La unin del fragmento de DNA al vector o vehculo de clonacin se produce por la accin de la DNA ligasa. Sella mellas existentes entre nucletidos adyacentes. Cuando se unen fragmentos creados por una endonucleasa de restriccin quedan mellas. La DNA ligasa repara estas mellas. Al producir la unin entre el inserto y el vehculo de clonacin se debe evitar la recirculacin de plsmidos. Para esto se aumenta la concentracin de DNA, favoreciendo las reacciones intermoleculares. La reaccin del plsmido con fosfatasa alcalina elimina los grupos 5`-P e impide tambin la recircularizacin. La Figura 7 muestra esquemticamente el proceso de insercin del fragmento de DNA en el vector.

Figura 7. Esquema de la insercin de un fragmento de DNA en un vector. 134

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4. Hospedadores. Introduccin del vector/ADN forneo La introduccin en la clula hospedadora del vector con el fragmento de DNA que se desea clonar difiere dependiendo del tipo de vector utilizado. Los mtodos utilizados se describen a continuacin. Transformacin. Se introduce el DNA plasmdico o desnudo en una clula hospedadora. Esto ocurre normalmente en la naturaleza, pero se favorece con ciertos tratamientos que modifican la permeabilidad de la membrana al DNA como CaCl2 (obtencin de clulas competentes). La transformacin con plsmidos de hasta 10Kb es bastante eficiente, ms de 20Kb es casi imposible. Transduccin. El DNA entra por infeccin con un bacterifago. Transfeccin. Introduccin del DNA procedente de un virus sin la cpsida; es menos eficaz. Conjugacin. Paso del DNA de una clula a otra por pili. Fusin de protoplastos. Se elimina la pared celular de dos clulas microbianas, los protoplastos se unen temporalmente, pasa la informacin de uno a otro, luego se separan y se regeneran las paredes celulares. Microinyeccin. Se usa para clulas de mayor tamao, generalmente eucariotas; se requiere un micromanipulador, aparato con microscopio, sistema de TV y micropipeta. Otros. Pistola o bombardeo de partculas se usa principalmente para la trasformacin de vegetales. Hay que tener en cuenta que cualquier combinacin no es posible. Hay ciertas limitaciones, por ejemplo:

Los plsmidos con ms de 20Kb difcilmente pueden introducirse por transformacin, por lo que si el inserto es muy grande debe recurrirse a un csmido.

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Los derivados, de sito cos a sitio cos pueden tener entre 38-53 Kb pues se les elimina hasta 22Kb intiles: lo mximo posible a encapsidar ser la diferencia. La trasfeccin tiene un rendimiento mucho menor.

5. Mtodos de seleccin En el proceso de clonacin, y especficamente durante la introduccin de la asociacin vector-DNA forneo en la clula hospedadora, pueden ocurrir diferentes posibilidades: que entre en la clula hospedadora el DNA forneo recircularizado, el vector slo (ambas situaciones indeseables) o el portador gentico completo (vector+DNA forneo). Debe disponerse de un mtodo sencillo que permita distinguir estas clulas diferentes de forma sencilla. Normalmente, adems del marcador correspondiente los plsmidos llevan genes de resistencia a antibiticos, que permiten una primera seleccin.

Resistencia a antibitico

Por ejemplo, supongamos un DNA forneo que introducimos en un vector que lleva genes de resistencia a ampicilina. Se prepara un medio de cultivo con ampicilina. Las clulas que no han sido transformadas o han sido transformadas con el inserto solo recircularizado, no crecern (Figura 8). Solo crecern aquellas que tengan el plsmido, pues contendrn as el gen de resistencia al antibitico, aunque todava habr de buscarse un mecanismo que permita distinguir si las clulas tienen el plsmido solo o con el inserto (DNA forneo) correspondiente.

Resistencia ampicilina

Figura 8. Esquema del mtodo de seleccin de clulas transformadas (I). Resistencia a antibiticos.

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Seleccin gentica.

Inactivacin insercional. Consiste en introducir el DNA forneo en un gen marcador del vector, de forma que este gen se inactive. Por ejemplo, el gen de la -galactosidasa expresa un enzima que cataliza la degradacin de lactosa par dar glucosa y galactosa, pero tambin puede hidrolizar el enlace oglucosdico del x-Gal segn la siguiente reaccin:

5-Br-4-Cl-3-indolil--D-galactsido (X-Gal)

Br-Cl-Indol (azul) + -D- galactopiranosa

Las colonias con el gen de -galactosidasa tendrn color azul en presencia de x-gal, mientras que las colonias que permanezcan blancas en presencia de xgal sern clulas que han sido transformadas por el vector que contiene el DNA forneo en sitio adecuado y, por tanto, ha inactivado el gen de la galactosidasa (Figura 9). Las bacterias no transformadas o que contenan solo el inserto recircularizado ya haban sido eliminadas por carecer de la resistencia a antibiticos.

Figura 9. Esquema del mtodo de seleccin de clulas transformadas (II). Inactivacxin insercional.

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Insercin gnica positiva. Al DNA forneo le pego un marcador de forma que las colonias con el inserto tienen las caractersticas del marcador. Hibridacin de colonias. Consiste en detectar secuencias de DNA en colonias transformadas mediante hibridacin in situ con sondas marcadas radioactivamente o con otros marcajes. Se basa en la interaccin de las bases de dos cadenas de DNA complementarias. Es la misma tcnica que se usa para el southernblot. Se procede como se indica a continuacin y como se esquematiza en la Figura 10. (a) Obtencin de la sonda marcada. Una sonda es una molcula de DNA de cadena sencilla marcada, que tiene gran homologa con el DNA forneo que nos interesa. Las sondas homlogas son exactamente complementarias con el fragmento de DNA que busco, stas pueden obtenerse qumicamente o a partir del mensajero siempre que conozcamos la secuencia o la de aquella protena que codifica. Las sondas heterlogas suelen usarse cuando no conocemos la secuencia del fragmento buscado, son complementarias con DNA de otro organismo con el que se espera que el gen en cuestin tenga gran homologa. Las sondas pueden marcarse radioactivamente con 32P, o con desoxinucletidos fluorescentes. (b) Estrategia de hibridacin. Se obtiene una rplica de la placa de agar que contiene las colonias de la librera colocando una membrana de nitrocelulosa sobre la placa de agar. La membrana se trata con NaOH 0.5M para lisar las bacterias y desnaturalizar las cadenas de DNA. Se trata con proteinasa k para eliminar la protena y dejar el DNA de cadena simple unido a la membrana. Se incuba la membrana con la sonda marcada, normalmente en un horno de hibridacin, introducindola en un tubito con la solucin que contiene la sonda. El tubo va girando lentamente. Jugando con la temperatura , concentracin salina del tampn y tiempo de hibridacin deben encontrarse las condiciones adecuadas para la renaturalizacin del DNA. Se lavan bien los restos de sonda. Se pone la membrana en contacto con una placa de autorradiografa dentro de un receptculo hermtico; la placa se impresiona por la radioactividad. Por este mtodo el fragmento de DNA buscado puede ser identificado entre libreras genmicas que contienen hasta un milln de genes diferentes

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Figura 10. Seleccin de clulas transformadas mediante hibridacin de colonias.

Tcnicas genticas. Supongamos que quiero clonar el gen que codifica la nitrito reductasa. Utilizo como hospedador una cepa de E.coli mutante que carece de nitrito reductasa. Si clono la nitrito, la cepa tendr la nitrito reductasa podr degradar nitrito. La causa de sto slo puede ser que la mutacin ha revertido o que se ha conseguido introducir el gen de la nitrito reductasa en E. coli.

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6. Obtencin de genotecas Si partimos de cDNA o DNA sintetizando qumicamente del gen que nos interesa, conocemos muy bien lo que deseamos clonar. Pero si slo tenemos una cierta funcin gnica, por ejemplo el gen que codifica una protena, y no conocemos la localizacin de dicho gen en el genoma correspondiente, entonces tendremos que obtener una genoteca o banco de genes para realizar una bsqueda del gen de inters. Para obtener una genoteca se procede como se indica a continuacin. Se asla el DNA total y se corta en fragmentos pequeos. Cada fragmento se une a un vector y se introduce en la clula hospedadora. Obtendremos muchas colonias, cada una con un fragmento del DNA total. Estos hospedadores constituyen una genoteca o banco de genes. Luego slo tendremos que seleccionar de la genoteca el clon portador de la informacin que deseamos. Esto puede presentar problemas, ya que el gen que nos interesa se puede haber cortado internamente. La solucin consiste en hacer digestiones parciales jugando con el tiempo y la temperatura de incubacin, de forma que obtengamos fragmentos lo ms grandes posibles. Adems se hacen digestiones con diferentes restrictasas. As, la genoteca tendr ms genes pero nos aseguramos de que la informacin gentica buscada est ah. Si se trata de una librera de DNA genmico, el genoma completo del microorganismo se fragmenta y se introduce en el vector apropiado (Figura 11). Si el vector es un plsmido, se introduce en una bacteria adecuada y cada colonia de la bacteria transformada ser un clon de clulas idnticas portadoras de un tipo de plsmido recombinante. Cuando se usa como vector un fago, ste se cultiva sobre un csped de bacterias. Cada bacterifago recombinante crea a su alrededor un halo de clulas lisadas. Cada uno de estos halos contiene fagos idnticos portadores de un tipo de inserto. En el caso de organismos eucariotas, la librera genmica contiene no slo los genes sino tambin las porciones de DNA no codificante (los intrones). En eucariotas resulta mas til construir librerias que incluyan slo esos genes que se expresan, para esto se extrae el mRNA del organismo y se produce el DNA

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complementario mediante la transcriptasa reversa: se trata de una librera de cDNA o de DNA complementario.

Figura 11. Obtencin de librera de genmico. una DNA

7. Electroforesis en gel de agarosa Las molculas de cidos nucleicos pueden separase por electroforesis, porque sus movilidades electroforticas al igual que ocurra con las protenas varan de forma inversa a su tamao. Se usa agarosa en vez de poliacrilamida porque los DNAs con varios miles de pb no pueden penetrar por la red de acrilamida.

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El uso de geles de agarosa nos permite por ejemplo separar los plsmidos del cromosoma bacteriano de mayor tamao. El procedimiento experimental es el siguiente. Se pone en la cuba de electroforesis la agarosa (agar muy puro) fundida por calentamiento, se coloca el peine que dar lugar a la formacin de los pocillos donde se colocan las muestras. En la primera calle suele colocarse un muestra que contiene los fragmentos marcadores de peso molecular. Cuando se conecta la corriente elctrica las molculas de DNA comienzan a migrar. Las ms pequeas migran ms rpidamente. Tambin la configuracin del DNA influye en su velocidad electrofortica. Tras la electroforesis, el gel se tie con bromuro de etidio u otras molculas (naranja de acridina, proflavina) que se intercalan entre las bases y fluorescen cuando son expuestas a luz UV, con lo que se visualizan las bandas de DNA en un transiluminador de UV.

Figura 12. Electroforesis de DNA en geles de acrilamida.

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8. PCR (polymerase chain reaction) La reaccin en cadena de la DNA-polimerasa fue descubierta en 1985 por Kary B. Mullis de la empresa Cetus y le vali el premio Nobel de Qumica en 1993. Permite, partiendo de un pequeo fragmento de DNA, obtener un gran nmero de copias en tan slo unas horas. Para ello debemos sintetizar unos oligonucletidos adecuados que hibriden con el principio y el final del fragmento que deseamos amplificar. Estos oligos actan como primers. La PCR consiste en incubar la muestra de DNA con la enzima polimerasa, dNTPs y los dos oligonucletidos sintetizados, y esta mezcla de ensayo se somete a una serie de ciclos de temperatura (Figura 12). Por ejemplo: Primero: 1 minuto a 94C para separar las dos cadenas. Segundo: 1 minuto a 52C para que se una los primers al DNA molde (Tm-5). Tercero: 2 minutos a 72C para que acte la polimerasa. En el primer ciclo obtendremos cadenas de DNA ms largas del fragmento que se desea amplificar, pero en los ciclos sucesivos la muestra se ir enriqueciendo en el fragmento deseado. En 20 ciclos de PCR puede aumentar la secuencia deseada un milln de veces con gran especificidad. Realmente puede considerarse la PCR una forma de clonacin molecular sin clulas. La utilizacin de la pol polimerasa Tag de la bacteria termfila Thermus aquaticus , que no se desnaturaliza a altas temperaturas, facilit mucho esta tcnica, pues la polimerasa tradicional, muy sensible a la temperatura, debe aadirse en cada ciclo. La PCR se ha convertido en una tcnica indispensable en una gran variedad de aplicaciones. Como mtodo de diagnstico en clnica, en medicina forense para determinar si una muestra de pelo o esperma pertenece o no a un individuo, para mutagnesis dirigida, o en paleontologa molecular. Secuencias de organismos extinguidos cuyo DNA se ha conservado pueden amplificarse, secuenciarse y compararse con especies contemporneas. Tambin se ha conseguido amplificar el DNA de momias egipcias.

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Fusin 95C

Hibridizacin 50-60C

Extensin de La cadena 75C

Primer Ciclo

2do Ciclo 95C 50 - 60C 75C

Figura 12. Reaccin en polimerasa. cadena de la

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