Evaluacin de marcadores genticos para la diferenciacin de especies dentro del complejo Mycobacterium tuberculosis

Es importante identificar correctamente las especies dentro del complejo Mycobacterium tuberculosis porque las implicaciones zoonticas de la tuberculosis bovina, especialmente en pases en desarrollo. Nosotros valoramos el uso de varios marcadores genticos para la identificacin de especies-especificas de el complejo Mycobacterium tuberculosis. Un PCR mltiple diseado para la deteccin de los elementos mtp40 y IS1081 fue optimizado y evaluado en 339 cepas de micobacterias procedentes de distintos lugares y diferentes animales. La gama de huspedes de los genes IS6110, MPB70 y 16s rRNA tambin fueron estudiados por PCR en todas las cepas. Finalmente, la utilidad de los marcadores genticos fue comparada por una prueba de inmunoperoxidasa para la identificacin especifica de cepas de Mycobacterium bovis. La secuencia mtp40 fue detectada en 87 de 91 cepas de M. tuberculosis y en 9 de las 11 cepas de Mycobacterium africanum pero no en alguna de las cepas de M. bovis o Mycobacterium microti, indicando que el PCR mltiple de mtp40-IS1081 puede ser una til prueba que podra diferenciar los patgenos humanos aceptados M. tuberculosis y M. africanum, desde los conocidos patgenos animales M. bovis y M. microti. Interesantemente, el elemento mtp40 tambin fue encontrado en todas las cepas del complejo M. tuberculosis aisladas de focas. Este organismo es considerado como un patgeno real de las focas, pero este origen es esencialmente desconocido. La bsqueda de el elemento mtp40 en las cepas de focas sugiere una estrecha relacin entre estas mismas con las de origen humano y las de origen animal. El elemento mtp40 no fue encontrado en alguna otra de las especies de micobacterias incluidas en este estudio. Como resultado de este estudio, sugerimos que pruebas bioqumicas o marcadores genticos alternos siguen siendo necesitados para diferenciar M. tuberculosis de M. africanum cuando estas especies coexisten como agentes causales de tuberculosis. La prueba de inmunoperoxidasa funciono bien en la identificacin de cepas de M. bovis. Tambin se informa, por primera vez, la amplificacin en PCR de el repetitivo elemento IS6110 en un aislado de Mycobacterium ulcerans y un aislado de Mycobacterium gilvum, lo cual hace hincapi en la necesidad de una mayor investigacin de la gama de huspedes de esta secuencia. El complejo de Mycobacterium tuberculosis comprende las especies de mycobacterium M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, y M. microti y la ms reciente micobacteria causante de tuberculosis en focas (10). M. tuberculosis causa tuberculosis en humanos, pero la infeccin tambin ha sido registrada en perros y gatos (1, 37) y otros animales que se encuentren en contacto con humanos infectados. M. africanum (6) causa tuberculosis en humanos y primates (40). M. microti, el ratn de campo o el bacilo de dassie, causa la tuberculosis en pequeos roedores (11, 36, 43) y aunque ha sido registrado como causante de infeccin en gatos y perros (24) y en una llama (31), no es considerado como un importante patgeno en humanos. M. bovis es el agente causal de tuberculosis bovina pero tiene la ms amplia gama de huspedes como ningn otro miembro del complejo M. tuberculosis. Debido al lento crecimiento de los organismos del complejo M. tuberculosis, la identificacin por mtodos tradicionales (21) tomara varias semanas. Aunque algunas caractersticas fenotpicas pueden ser usadas para separarlos, diferentes estudios taxonmicos (19,25,34) apoyan la idea de que miembros del complejo M. tuberculosis deberan ser reconocidos como una sola especie. Sin embargo, las diferencias epidemiolgicas entre ellos hacen que sea conveniente clasificarlos como especies separadas. La incidencia de tuberculosis humana causada por M. bovis ha disminuido en pases desarrollados despus de la pasteurizacin de la leche para consumo humano y el exitoso progreso de campaas de erradicacin

de tuberculosis bovina. Sin embargo, los humanos pueden actuar como reservorio de M. bovis, y la transmisin de la infeccin en ganado ha sido registrada en varios pases (2, 44). Informacin precisa sobre la incidencia de infeccin por M. bovis en humanos es limitada en muchos pases. Estudios en Argentina (3) y el sureste de Inglaterra (45, 48) han reportado incidencias entre 04 y 6% del total de casos de tuberculosis humana. De acuerdo con los datos de la Organizacin Panamericana de Salud y la Organizacin Mundial de Salud, 7000 nuevos casos de tuberculosis humana causados por M. bovis incrementan en Amrica del Sur cada ao (29) y algunos autores han sugerido que la incidencia real podra ser ocho veces ms alta (33). En reas como frica, la importancia zoontica de infeccin por M. bovis podra agravarse aun mas por el contacto tan cercano con animales, consumo de leche no pasteurizada, y el incremento en la incidencia de infecciones por el virus de inmunodeficiencia humana (15). La infeccin por M. bovis ha sido reportada en varios pacientes con SIDA en San Diego, California (16), y cepas de M. bovis con resistencia a mltiples frmacos ha sido reportado por tener una extensin entre pacientes con SIDA en salas de Francia (5). M. tuberculosis, M. bovis, y M. africanum son capaces de causar tuberculosis en humanos as como en animales. La Similitud en las manifestaciones clnicas y el tratamiento de estas infecciones ha significado que muchos laboratorios no logren identificarlos completamente (22). Sin embargo, esto es importante para identificar correctamente estos aislados de modo que investigaciones epidemiolgicas pueden detectar reservorios potenciales que podran ser un riesgo para la salud pblica. Adicionalmente, aislados de M. bovis son resistentes a pirazinamida, una droga comnmente usada para el tratamiento de tuberculosis (26). Muchos Laboratorios ahora usan tcnicas moleculares para la identificacin de aislados del Complejo M. tuberculosis. Pruebas de DNA de etiqueta-ester Acridinio (AccuProbe; Gene Probe, Inc., San Diego, Calif.) estn disponibles para este propsito (20,28); sin embargo, estas pruebas no pueden distinguir entre miembros del complejo. La PCR tambin ha sido utilizada para la rpida identificacin de mycobacteria. Primers dirigidos al gen 162 rRNA pueden ser usados para identificar organismos que pertenezcan al gnero Mycobacterium (4). Los fragmentos de genoma ms comnmente elegidos para la amplificacin de especies especficas del complejo M. tuberculosis son la insercin de secuencias IS6110 (39) y IS1081 (8) y el genMPB70 (14,32). En un reporte reciente un fragmento del genoma llamado mtp40 fue identificado como especifico para especies M. tuberculosis (30) y fue ampliado por PCR con oligonucletidos PT-1 y PT-2 (18). Este estudio informa la optimizacin y evaluacin de un ensayo de PCR mltiple diseado para distinguir M. tuberculosis de otros miembros del complejo M. tuberculosis sealando hacia los genes mtp40 e IS1081 en una sola reaccin. Tambin informamos un estudio por PCR de la gama de huspedes de IS6110, el gen MPB70, y el gen 16S rRNA en una amplia variedad de especies de Mycobacterium de diferentes animales y reas de origen. Una prueba establecida de inmunoperoxidasa para la deteccin del antgeno MPB70 en cepas de M. bovis fue tambin se evalu para determinar el valor de esta prueba comparada con la ms reciente desarrollada prueba de marcadores genticos.

MATERIAL Y METODOS Cepas de micobacterias. Un total de 339 cepas de micobacteria pertenecientes a 31 diferentes especies, incluyendo las cepas de referencia y los aislamientos clnicos, que fueron evaluados en animales y reas geogrficas distintas. 286 cepas provenientes de la coleccin de cultura de el Laboratorio para Tuberculosis Bovina de Referencia Australiana, al sur de Perth, Oeste de Australia, Australia, y 53 provenientes de el Laboratorio de Micobacterias, Departamento de Patologa Animal (Sanidad Animal). Universidad Complutense de Madrid, Espaa. Todos los aislamientos fueron identificados por mtodos convencionales (21). Antes de su uso en este estudio las cepas de micobacterias fueron almacenadas a -80C en vas protectoras (Farmacuticas Sigma, Clayton Victoria, Australia) como lo sugiri el proveedor. Las cepas fueron reactivadas al remover una sola capa de cuentas del organismo y aadindolo al medio de cultivo en condiciones estriles. Las cepas de bacterias usadas en este estudio y sus fuentes estn enlistadas en la tabla 1. Preparacin de suspensiones bacterianas crudas y extractos de DNA. Las especies de micobacterias fueron cultivadas en Agar Sangre B83 (9) o en el medio de bordes de piedra (38), con la excepcin de M. genavense quien creci en Middlebrook 7H11 (Laboratorios Difco, Detroit, Michigan). Los cultivos fueron incubados en presin de 36 C, excepto por Mycobacterium ulcerans y Mycobacterium marinum, quienes fueron incubadas a 30C hasta que el crecimiento fue evidente. Una sola colonia se aadi a 100 ul de agua purificada y calentada a 94C por 10 minutos para exhibir el DNA por PCR y despus se almaceno en enfriamiento a -20C hasta la evaluacin. Las extracciones de DNA fueron realizadas y descritas previamente (13). Diseo general del estudio. Todas las cepas fueron evaluadas por un PCR mltiple desarrollado para mtp40 e IS1081, por un PCR mltiple para 16S rRNA y MPB70, y por PCR para IS6110. El algunos casos (n=50), el DNA extrado (aproximadamente 20 ng) fue evaluado en lugar de la suspensin celular. Las cepas con resultados aberrantes fueron reevaluadas por lo menos tres veces, y cuando est disponible, la suspensin celular y el DNA fueron evaluados en paralelo. Adems de esto, todas las cepas de M. tuberculosis y M africanum dieron negativo para mtp40 y ms de la mitad de las cepas de M. bovis fueron tambin evaluadas para mtp40 en un simple PCR para la secuencia mtp40 como se comprob en mltiples resultados. Doscientas veintitrs de las cepas fueron evaluadas por la prueba de inmunoperoxidasa. Primers de Oligonucletidos. Los Primers de Oligonucletidos fueron sintetizados en Farmacia Gen Ensamblador Plus y gel purificado gel purificado de poliacrilamida al 20% que contiene 7M urea. Los
oligonucletidos fueron visualizados por imagen de UV separado en columnas NAP-10 (Biotech Farmacia). Las secuencias de nucletidos y los productos esperados de la amplificacin de reacciones son mostrados en la tabla 2. Condiciones de amplificacin para mtp40-IS1081 en PCR mltiple. Las condiciones de la reaccin fueron diseadas en un alto grado de especificidad. Una cuidadosa filtracin de cada componente fue necesaria para optimizar la PCR para generar dos bandas de intensidad equivalente. Las condiciones de amplificacin finales fueron las siguientes: PCR llevo a cabo un volumen total de 25 ul conteniendo 0.5 mM MgCl2, O.5 de Tih mas Polimerasa (Biotech Internacional, Bentley, oeste de Australia, Australia), 60 ng de el primer IS1081, 150 ng de cada primer de PT 1x reaccin buffer 67 mM Tris-IICl (Pii 8.8 A 25C), 16.6 mM (NII4)2SO4 () 0.2 mM Trifosfato desoxinucleosido, 1 mM 2-mercaptoetanol, 6 M EDTA, 0,2 mg of gelatin por ml y 5 ul de la muestra. Las reacciones mezcladas fueron superpuestas con 50 ul de aceite de parafina. Despus de una desnaturalizacin inicial de 10 min a 94C las reacciones mezcladas fueron amplificadas por 35 ciclos de desnaturalizacin a 94C por 30 s, recalentando a 65C por 2 min, y una extensin a 72C por 3 min con un termociclador Corbell FTS-1 (Internacional Biotech).

Condiciones de Amplificacin para los PCRs mltiples de16S rRNA-MPB70 y IS6110. Las condiciones de amplificacin para el PCR mltiple de 16S rRNA-MPB70 son similares a las descritas previamente (46). La amplificacin por PCR del elemento IS6110 fue realizado en condiciones similares a las descritas para el PCR mltiple de mtp40-IS1081, fue modificado por el uso de 2 mM MgCl2, 1 U of Tth mas Polimerasa, y 100 ng de cada primer de INS-1 y INS-2. Los productos de la amplificacin fueron analizados por electroforesis en gel a 100 V por 45 min en gel al 2% de agarosa. Los Geles fueron marcados en bromuro de etidio y fotografiados en un transiluminador de UV. Ensayo de Inmunoperoxidasa. El ensayo de inmunoperoxidasa fue realizado como se describi previamente (10) usando una tcnica de punto en mancha con un extracto de antgeno crudo, en una suspensin de autoclave de organismo con una opacidad de 5 (Opacidad Standard de McFarland, Difco), y 4C3/17, un anticuerpo monoclonal comercial de MPB70 (Agen Biomedicals, Brishbane, Queensland, Australia). RESULTADOS Optimizacin de las PCRs. Una de los ms importantes parmetros para la amplificacin especifica de la secuencia mtp40 fue la concentracin de MgCl2. Los resultados ptimos fueron obtenidos con 0.5 mM de MgCl2; altas concentraciones resultaron en una generacin de productos de la amplificacin inespecficos de M. bovis. Un numero mnimo de ciclos de amplificacin (n=35) y una alta temperatura de recocido (65C) fueron usados para minimizar algn potencial de reaccin cruzada con otra especie de micobacteria. Encontramos que .5 U de Polimerasa Tth plus DNA fue suficiente para realizar la amplificacin mltiple exitosamente. Durante la optimizacin de las condiciones de la reaccin, un PCR mltiple con primers para mtp40 y para IS6110 fue probado. Esto fue observado, cuando ambos pares de primers fueron usados en un solo tubo, la eficiencia de la amplificacin de el elemento IS6110 fue ms alta que la encontrada para la secuencia mtp40. Este factor resulta en la existencia de resultados falsonegativo con errores en la identificacin de los aislados. Este fenmeno de competicin no fue observado en la reaccin mltiple de mtp40 y IS1081. Despus de una valoracin combinada de ambos pares de oligonucletidos, encontramos que los resultados precisos fueron obtenidos con 150 ng de cada uno de los PT primers y 60 ng de cada unos de los 1081 primers. La tabla 3 resume los resultados de la prueba de 339 aislados de micobacterias por PCR para objetivos de mtp40, IS1081, 16S rRNA, MPB70 y IS6110 y la prueba de inmunoperoxidasa para la presencia de el antgeno MPB70. Prueba de PCR. El fragmento de 396 pb de mtp40 fue amplificado de el genoma de 87 de los 91 (95.6%) aislados de M. tuberculosis, de 9 de 11 (81.8%) cepas de M. africanum, y de todas las 17 cepas de las focas evaluadas. La identificacin de los cuatro aislados de M. tuberculosis y los dos aislados de M. africanum que carecan de la secuencia mtp40 fue confirmado por pruebas convencionales (morfologa de la colonia, preferencia de oxigeno, produccin de niacina, reduccin de nitrato, susceptibilidad a la pirazinamida, y susceptibilidad al acido hidrazida tiofeno-2-carboxlico (21). La secuencia mtp40 no fue detectada en alguna de las cepas de M. bovis, M. bovis BCG, M microti, o alguna micobacteria no tuberculosa. El fragmento de 238 pb de IS1081 fue amplificado de los genomas de los 304 miembros del complejo M. tuberculosis evaluados pero no de alguna otra especie de micobacteria. La figura 1 muestra los productos de la amplificacin de varias especies de micobacteria obtenidos por PCR mltiple de los elementos mtp40 y IS1081. En el PCR del 16S Rrna-MPB70, los productos del genero especifico de1030 pb fueron generados de todas los 339 aislados de micobacteria, y de todas las 304 cepas del complejo M. tuberculosis se produjo el producto amplificado de 372 pb para MPB70. La presencia de la secuencia IS6110 fue investigada por PCR en los 339 aislados de micobacterias y fue encontrado en 300 de las 304 cepas de M. tuberculosis evaluadas. Las cepas que carecen de IS6110

fueron los aislados de M. tuberculosis provenientes de pacientes Vietnamitas. Esta secuencia fue tambin detectada en las cepas de M. ulcerans y Mycobacterium gilvum que fueron incluidas en nuestro estudio. Prueba de Inmunoperoxidasa. Todas menos 1 de las 11 cepas identificadas de M. bovis y todas las 17 cepas de M bovis BCG evaluadas dieron positivo cuando fueron evaluadas por la prueba de inmunoperoxidasa para el antgeno MPB70 (Table 3). Todas las cepas de M. microti y todas las cepas de las cepas dieron negativo a la prueba de inmunoperoxidasa. Un aislado identificado como M. tuberculosis y uno identificado como M. africanum dieron positivo a la prueba de inmunoperoxidasa. DISCUSION El objetivo de este estudio fue desarrollar en un solo tubo una reaccin que fuera capaz de detectar la presencia del elemento IS1081 (especifico para los organismos del complejo M. tuberculosis) para luego identificar las especies de M. tuberculosis por medio la presencia de la secuencia de mtp40. Aunque el fragmento genmico mtp40 fue originalmente descrito como especifico de las especies de M. tuberculosis (18,30) y los resultados de un estudio reciente usando un nmero limitado de cepas fue consistente con estos resultados (35), encontramos que le fragmento mtp40 tambin se encuentra presente en M. africanum y en las cepas de focas. La presencia de este elemento en 9 de los 11 cepas de M. africanum evaluadas apoya la controversia que existe en la clasificacin de los aislados. M. africanum es un grupo altamente heterogneo de micobacterias registrado por ser fenotpicamente intermedio entre M. bovis y M. tuberculosis. En un estudio de taxonoma numrica de 60 aislados de M. africanum de cinco diferentes pases Africanos, estas cepas se agruparon con M. tuberculosis o M. bovis de acuerdo a su origen geogrfico (17). Las cepas provenientes de focas evaluadas fueron originalmente identificadas como M. bovis por medio de pruebas de susceptibilidad bioqumica y a frmacos (12). Sin embargo, estas cepas carecan de cantidades detectables del antgeno MPB70, considerado por ser virtualmente especifico para los aislados de M. bovis (42,47), cuando fueron evaluados con el ensayo de inmunoperoxidasa. Despus de la caracterizacin genmica por el anlisis con endonucleasas de restriccin y fragmentos de restriccin de longitud del polimorfismo, las cepas de focas formaron un nico grupo claramente diferente del que las cepas de M. bovis formaban parte, y ellas parecan estar ms estrechamente relacionadas con M. tuberculosis que con M. bovis (12). La presencia del fragmento mtp40 en las cepas de focas apoya la relacin gentica de estos aislados con especies de M. tuberculosis. Algunos investigadores han recientemente registrado la existencia de las cepas de M. bovis provenientes de pacientes humanos con la secuencia mtp40 (40a); sin embargo, en el presente estudio ninguna de las 42 cepas de M. bovis evaluadas provenientes de humanos mostro la presencia de este elemento. La identificacin de las 4 cepas de M. tuberculosis y las dos cepas de M. africanum que carecan de la secuencia mtp40 fue confirmada por pruebas bioqumicas estndar. No encontramos alguna correlacin entre la variedad de cepas y la presencia de el elemento. 2 de las cepas de M. tuberculosis fueron susceptibles (variedad asitica) y dos fueron resistentes (variedad clsica) al acido hidrazida tiofeno-2carboxlico. Una de las cepas de M. africanum fue confirmada como tipo I, y la otra fue confirmada como tipo II. Una investigacin previa de la gama de variedades de IS1081 revelo que, apare del complejo de especies de M. tuberculosis, este elemento tambin se encuentra presente en la cepa TMC 1470 (Coleccin Trudeau, Instituto Nacional de Salud, Bethesda, Md. de la Mycobacterium xenopi (7). Nuestro estudio incluye el anlisis de cuatro aislados clnicos y dos tipos de cepas de M. xenopi, y todos ellos carecan del elemento IS1081. Recientemente, algunos autores (41,49) han registrado la existencia de cepas de M. tuberculosis que carecan de la secuencia IS6110; estas cepas se han originado del Sureste de Asia e India. En este estudio, cuatro aislados de M. tuberculosis de pacientes Vietnamitas carecan del elemento IS6110. Sin embargo, para nuestro conocimiento, ningn miembro del complejo de M. tuberculosis ha sido registrado

con la falta de IS1081. Esto sugiere que el elemento IS1081 es una buena opcin para inclusin en el PCR mltiple para identificar la bacteria con el complejo M. tuberculosis en el sureste de Asia. IS6110 no haba sido previamente registrado en presencia de alguna micobacteria que en el complejo M. tuberculosis hasta un reciente informe (27) de homologa entre IS6110 y otras seis Mycobacterium spp. Por una tcnica de PCR anidada. En nuestro estudio un producto de la PCR consistente con IS6110 fue detectado en una cepa de M. ulcerans y en una cepa de M. gilvum. Estas cepas fueron reevaluadas cuatro veces, y los controles negativos fueron incluidos con cada lote de tubos de PCR con el fin de detectar alguna contaminacin cruzada posible. Par la reevaluacin de las cepas se seleccion los tubos de diferentes subcultivos, as como la cepa original realizada en nuestra coleccin de cultivos. Estos descubrimientos enfatizan la importancia de una investigacin mas extensiva de la gama de variedades de esta secuencia con el fin de prevenir resultados falso-positivo y falso-negativo en la identificacin por PCR de los organismos del complejo de M. tuberculosis. La prueba de inmunoperoxidasa se encontr como un mtodo simple, confiable y especifico para la identificacin de las cepas de M. bovis. Una de las cepas que fue originalmente identificada como M. bovis pero dio negativo a la prueba de inmunoperoxidasa fue aislada de un paciente humano que haba nacido en Singapur. Cuando se reevalu por pruebas bioqumicas, la cepa fue un intermedio entre M. bovis y M. tuberculosis pero ms parecida a M. tuberculosis. Esta cepa en particular tambin careca del mtp40, el cual en este estudio fue ms consistente con M. bovis. Por el PCR mltiple de mtp40-IS1081, mas cepas de M. africanum han sido agrupadas con M. tuberculosis, dando un resultado positivo a ser patgenos humanos, mientras los tradicionales patgenos animales M. bovis y M. microti dieron un resultado negativo. La excepcin de este descubrimiento esta en las cepas de focas, las cuales se agruparon en patgenos humanos. En la actualidad, no hay ningn nico mtodo rpido para la identificacin dentro del complejo de M. tuberculosis. Sugerimos que la PCR descrita aqu podra ser usada con alguna otra prueba, incluyendo la prueba de inmunoperoxidasa y pruebas bioqumicas, para la identificacin de los miembros del complejo de M. tuberculosis. RECONOCIMIENTOS Gran parte de este trabajo fue financiado por la Campaa de erradicacin de Tuberculosis y Brucellosis Australiana. E Libana y A. Aranaz son estudiantes de Doctorado con subvenciones del Ministro de Educacin y Ciencia de Espaa. Agradecemos a Suzette Williams por su excelente asistencia tcnica. Reconocemos a los muchos colaboradores quienes nos proporcionaron con las cepas usadas en este estudio.: David Dawson, Queensland, Australia, por muchas de las cepas de M. africanum; Auba Seivers, Laboratorio de Referencia de Micobacterias, Victoria, Australia, y Frank Haverkort, Laboratorio de Referencia de Micobacterias, Oeste de Australia, Australia, por los aislados de M. tuberculosis; Tony Jenkins, Reino Unido, por algunas de las cepas de M. microti; Goran Blske, Suiza, por el aislado de Suricata; Richard Wallace, Estados Unidos, quien provey muchas de las cepas de M. Bovis BCG; y Mariano Domingo, Barcelona, Espaa, por el abastecimiento de especmenes animales de los cuales muchas cepas de Espaa fueron aisladas.