CULTIVOS BACTERIOLOGICOS COMO METODO Y SOLUCION DE ENFERMEDADES Mara del Carmen Heredia Chvez, PP Ingeniera Biotecnolgica, UCSM.

RESUMEN Se realizo la siembra de muestras de hgado y leche, potencialmente factores de enfermedades bacterianas, en agar Sangre y Agar Mc Conkey, seguido de una tincin de Gram; con el fin de tipificar el tipo de microrganismo. Despus de 24 hrs de incubacin se obtuvo para las vsceras colonias gram + beta hemolticas cremosas, para la muestra de leche colonias alfa hemolticas, cremosas en agar sangre y rosado - naranja en agar Mc Conkey.

INTRODUCCION La efectividad de un laboratorio microbiolgico y el xito de los procedimientos dependen en gran medida del modo de obtencin, transporte, rapidez y oportunidad con que las muestras llegan al laboratorio. Estos procedimientos son prioritarios para que el laboratorio contribuya eficientemente en el diagnstico, es por ello que se debe de mantener la calidad de la muestra durante todo el proceso. Las bacterias para su desarrollo requieren de sustancias nutritivas cuyos componentes bsicos deben satisfacer las mnimas exigencias nutricionales y condiciones de atmsfera (aerobiosis, anaerobiosis, microaerofilia), pH y temperatura ptima para su crecimiento in vitro. MARCO TEORICO

Cultivos: Un mtodo fundamental para estudiar las bacterias es cultivarlas en un medio lquido o en la superficie de un medio slido de agar. Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes que van, desde azcares simples hasta sustancias complejas como la sangre o el extracto de caldo de carne. Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo slido donde las clulas que se multiplican no cambian de localizacin; tras muchos ciclos reproductivos, cada bacteria individual genera por escisin binaria una colonia macroscpica compuesta por decenas de millones de clulas similares a la original. Si esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecer como cultivo puro de un solo tipo de bacteria.

Muchas especies bacterianas son tan parecidas morfolgicamente que es imposible diferenciarlas slo con el uso del microscopio; en este caso, para identificar cada tipo de bacteria, se estudian sus caractersticas bioqumicas sembrndolas en medios de cultivo especiales. As, algunos medios contienen un producto que inhibe el crecimiento de la mayora de las especies bacterianas, pero no la de un tipo que deseamos averiguar si est presente. Otras veces el medio de cultivo contiene determinados azcares especiales que slo pueden utilizar algunas bacterias. En algunos medios se aaden indicadores de pH que cambian de color cuando uno de los nutrientes del medio es fermentado y se generan catabolitos cidos. Si las bacterias son capaces de producir fermentacin, generan gases que pueden ser apreciados cuando el cultivo se realiza en un tubo cerrado. Tincin: Tincin de Gram, mtodo de identificacin de bacterias mediante una tincin especfica. Desarrollado por el mdico dans Hans Christian Joachim Gram, es un procedimiento utilizado universalmente. En un primer momento las bacterias se tien con violeta de genciana (derivado metilado anilnico) y despus se tratan con la solucin de Gram (1 parte de yodo, 2 partes de yoduro potsico y 300 partes de agua); por ltimo se lavan con alcohol etlico, y unas bacterias retienen el fuerte color

azul de la violeta de genciana y otras se decoloran por completo. A veces se aade una contratincin con fucsina o eosina para teir las bacterias decoloradas de color rojo y hacerlas ms visibles. Se denominan bacterias Gram positivas a aquellas que retienen la tincin azul y bacterias Gram negativas a las que quedan decoloradas. Algunas bacterias presentan capacidad variable de tincin de Gram y se llaman Gram variables. Bacterias Gram positivas tpicas son los estafilococos que producen fornculos; Gram negativas representativas son la Escherichia coli de la flora intestinal o los bacilos de la tos ferina; Gram variables son los bacilos de Koch de la tuberculosis AGAR MACCONKEY Es un medio selectivo diferencial utilizado para el aislamiento y diferenciacin de bacilos gram negativo fermentadores y no fermentadores de lactosa. Se utiliza con frecuencia para el aislamiento de Coliformes.

Sirve como indicador visual de pH, distinguiendo as las bacterias gram

negativas que pueden fermentar la lactosa (Lac+) y las que no pueden (Lac-).

las 24 hrs y por una coloracin de Gram tratamos de identificar la bacteria aislada. Muestras de leche: Homogenizamos la muestra y se tomo la muestra directamente con el asa e inocular con estrias suaves como en el caso anterior. Procediendo al cultivo e identificacin como el caso anterior. Muestra de huevo: Desinfectamos la parte superior con alcohol y quemamos la zona de donde se tom la muestra para luego romper en ese lugar la cscara. Tomamos la muestra de la parte superior e inocular como en los casos anteriores. RESULTADOS

Lac+
Al utilizar la lactosa en el medio, bacterias Lac+ como Escherichia coli, Enterobacter y Klebsiella producen acidez, lo cual baja el PH bajo 6,8 lo que tiene como consecuencia la aparicin de colonias de color rojo oscuro.

LacBacterias que no fermenten la lactosa como Salmonella, Proteus y Shigella utilizaran peptona en su lugar, formando ammonio, lo cual incrementa el PH del agar, formando colonias blancas o incoloras. MATERIALES Y METODOS Para sembrar la muestra, se acondicionaron los microorganismos a un medio de cultivo frtil, para que en condiciones ptimas de temperatura y tiempo de incubacin , puedan desarrollar y multiplicarse In Vitro. Para ello se uso dos medios de cultivo uno general y otro selectivo, Agar Sangre y Agar Mc Conkey Siembra de vsceras. Frente al mechero se esteriliz la hoja de bistur y con ste caliente quemamos la zona del rgano del cual se tomar la muestra para el cultivo. Se tom la muestra con una asa bacteriolgica e inocul con estras suaves sobre el medio de cultivo por mtodo de agotamiento procurando que por este se tengan colonia separadas. Sellamos las placas e incubamos a 37C por 24 horas. Se hizo la lectura de placa a

Fig. Agar Mc Conkey, Parte superior de laplaca muestras de leche, parte inferior muestras de hgado.

CONCLUSIONES Y DISCUCIONES Se obtuvo bacterias presumiblemente salmonella muestras de hgado. BIBLIOGRAFIA MANTILLA, G. y otros. DIAGNOSTICO DE TUBERCULOSIS BOVINA POR AISLAMIENTO BACTERIOLOGICO O HISTOPATOLOGICO DE VACUNOS REACTORES A LA PRUEBA TUBERCULINA. http://www.solociencia.com/biol ogia/microbiologiamicroorganismos-ganaderia.htm http://www.ugr.es/~pomif/pombac/pb-i/pb-i-2-variedad.htm NFL, en

Fig. Agar Sangre, a la derecha muestra de hgado, izquierda muestra de leche.

MUESTRA Hgado Crecimiento Color

Agar Sangre +++ Cremosa

Forma tamao

Leche

Crecimiento

Color Forma

Beta hemolisis rugosas 2 a 5 mm +++ Blancas Alfa hemolisis Redondas De 0.5 cm

Agar Mc Conkey + Naranjas cremosas NFL Lisas Redondas 5 a 8 mm ++ Anaranjada NFL Redondas De 0.5 cm a +

Gram -

Maria Amparo Bravo. Bacterias anaerobias. Universidad del cauca. Facultad ciencias de la salud

CUESTIONARIO 1. Indique la importancia del mtodo y anlisis bacteriolgico. El mtodo y anlisis bacteriolgico es importante debido a que son un indicativo de los agentes bacteriolgicos que estn causando una enfermedad, son mas especficos que solo un anlisis de lesiones, permite por ello determinar el tipo de tratamiento que se debe adoptar. Hay que recordar que es un paso mas en el diagnostico de enfermedades pero que de ser posible se debe complementar con otro tipo de estudios y observaciones.

2.

Indique como estn clasificados los medios de cultivo de acuerdo a su contenido qumico.
Segn su composicin qumica Para preparar los medios de cultivo definidos o sintticos (ej el medio de Koser para la utilizacin del citrato) se utilizan componentes de alta pureza, por lo que se conoce su composicin qumica (cualitativa y cuantitativamente). Cuando no es decisivo conocer la composicin exacta del medio de cultivo se utilizan medios indefinidos, naturales o complejos, como el Agar nutritivo preparados con mezclas de nutrientes como peptonas, extracto de carne, extracto de levadura, agar-agar, etc.

3. Indique como es la clasificacin de los medios de cultivo basados en el uso del laboratorio.
Segn su finalidad Cuando se cultivan microorganismos que requieren nutrientes comunes, se utilizan medios de cultivo ordinarios (como el Agua de peptona): sus nutrientes permiten el crecimiento de gran nmero de microorganismos, pero no de los que requieren nutrientes particulares. Las bacterias mas exigentes nutricionalmente se cultivan en medios enriquecidos (como Agar chocolate que es Agar nutritivo aadido del 10% de sangre calentada hemolizada-): Contienen los nutrientes ausentes de los medios ordinarios, como por ejemplo factores orgnicos de crecimiento.

Cuando se pretende que el propio cultivo de la bacteria diferencie entre distintos tipos de bacterias se utilizan Medios de cultivo diferenciales (ej. Medio para la fermentacin de la lactosa): algn componente del medio proporciona un cambio visible del cultivo si existen ciertas bacterias (en el caso de la lactosa la acumulacin de cidos).
Puede favorecerse la probabilidad de seleccionar cierta bacteria especfica de una mezcla de ellas utilizando medios de cultivo selectivos o realizando un enriquecimiento de la bacteria que se pretende seleccionar, en detrimento de otras bacterias de la mezcla. Los Medios de cultivo selectivos (como el Agar Mac Conkey) son medios slidos que contienen sustancias que inhiben el crecimiento de algunas bacterias, pero permite el de otras. El Agar Mac Conkey contiene sales biliares antibacterianas pero permiten el crecimiento de las Enterobacterias cuyo hbitat natural (el intestino) contiene tales sales antibacterianas. El resultado es el crecimiento selectivo de las bacterias que resisten las sales biliares, entre ellas las enterobacterias. El efecto antibacteriano selectivo de algunos medios de cultivo permite su utilizacin sin aplicar la esterilizacin convencional

Los cultivos de enriquecimiento se realizan en medios lquidos (medios de cultivo de enriquecimiento), con alguna propiedad fsica o qumica que favorecen el desarrollo de un determinado tipo bacteriano, o se incuban bajo condiciones especiales: el desarrollo de los microorganismos celulolticos se favorece en un medio de cultivo que contiene celulosa como nico sustrato orgnico. Otros microorganismos no podrn crecer tan eficientemente. V.cholerae es una bacteria que tolera el pH alcalino, por lo que el Agua de peptona-alcalina (pH 11) permite el enriquecimiento de Vibrio cholerae de una muestra de heces

4. Indique cuales son las caractersticas de un cultivo anaerbico, que bacterias se puede aislar y etiologa de que enfermedades pueden ser?

Se utilizan medios selectivos, no selectivos y de enriquecimiento.Los medios de cultivo para anaerobios tienen una alta proporcin de peptonas e hidratos de carbono ya que su metabolismo es ms exigente que el de bacterias facultativas y requieren adems factores de crecimiento como la hemina y vitamina K. Los medios empleados con mayor frecuencia son: AGAR SANGRE ANAEROBIO (ASA): Agar sangre complementado con Vitamina K y hemina Medio no selectivo. Crecen anaerobios y anaerobios facultativos. AGAR SANGRE LACADA KANAMICINA VANCOMICINA (ASLKV): Medio selectivo para bacilos Gram negativos anaerobios, favorece produccin de pigmento. FENILETIL ALCOHOL AGAR (FEA): Inhibe el crecimiento de bacilos Gram negativos aerobios facultativos.Crecen la mayor parte de anaerobios Gram positivos y Gram negativos, el alcohol sirve como aceptor final de electrones. AGAR BACTEROIDES BILIS ESCULINA (BBE): Selectivo para bacteroides sobre todo grupo frgilis, pueden crecer tambin fusobacterium. AGAR YEMA DE HUEVO (EYA): Para Clostridium sp. AGAR CICLOSERINA CEFOXITINA FRUCTOSA (CCFA): Para Clostridium difficile.

GENERO CLOSTRIDIUM Las Bacterias del gnero Clostridium son bacilos Gram positivos esporulados, la mayor parte de sus especies son anaerobios estrictos . MORFOLOGIA: Pueden observarse como bacilos largos, estrechos, pleomorficos a veces de formas filamentosas de gran longitud.Forman esporas que pueden situarse en la regin terminal, subterminal o central de acuerdo a la especie. Algunos son mviles poseen flagelos pertricos, otros son capsulados como el

Clostridium perfringens. METABOLISMO: Carecen de citocromos necesarios para el transporte de electrones, de catalasas y peroxidasas. La mayora producen grandes cantidades de gas (CO2 e H) por fermentacin butrica. Fermentan varios azcares lo que permite la diferenciacin de especies junto con reacciones bioqumicas como: Liquefaccin de la gelatina, reduccin de nitratos, produccin de indol a partir de triptfano. Existen especies proteoliticas y otras sacarolticas. FACTORES DE PATOGENICIDAD: Poseen enzimas como colagenasa, proteinasas, hialuronidasas, desoxirribonucleasa, lecitinasa y neuraminidasa las cuales actan a nivel local produciendo destruccin de tejidos, algunas de stas actan como toxinas en el husped. ESPECIES CLINICAMENTE IMPORTANTES Clostridium tetani. Produce el ttano Clostridium botulinum produce botulismo, botulismo infantil, botulismo de heridas. Clostridium perfringens. Produce intoxicacin alimentaria, mionecrosis, celulitis anaerobica, colitis necrotizante. Clostridium difficile. Produce colitis pseudomembranosa. GENERO BACTEROIDES Bacilos Gram negativos pequeos de extremos redondeados, poseen largas vacuolas, contienen esfingolpidos en la membrana .Algunos poseen enzima sper oxido dismutasa (SOD) y otras protenas inducidas por el oxgeno. Anaerobios aerotolerantes, no forman esporas, son inmviles. Forman parte de la flora normal del TGI, est comn mente en leon terminal y prolifera en colon en proporciones de 10 9 microrganismos/gr.Tambin se puede encontrar en boca, vagina y uretra. METABOLISMO: Producen un conjunto de cidos succnico, lctico, actico, Frmico y propinico y algunos de ellos una mezcla de ac.actico y butrico, como productos de la fermentacin de la glucosa. FACTORES DE PATOGENICIDAD: - Cpsula compuesta de polisacridos A y B, la cual puede conferir resistencia para mecanismos de defensa del husped. Los antgenos capsulares pueden causar ms una respuesta de clulas T que una mediada por anticuerpos. Puede estimular los depsitos de fibrina e inducir la formacin de abscesos. Degrada el complemento del husped por factores no identificados. Produce enzimas como neuraminidasa, hialuronidasa, Dnasa, fosfatasa y muy ocasionalmente fibrinolisinas. Produce heparinasa que puede predisponer a trombosis vascular. Produce Zinc metalo proteasas (Entero toxina).

ESPECIES CLINICAMENTE IMPORTANTES: Bacteroides frgilis. Bacteroides melaninognicus. PATOGENIA Los Bacteroides son microorganismos comensales no invasores, pero en ciertas circunstancias, pueden producir infecciones graves y mortales se ha reportado hasta un 60% de mortalidad. Infecta cualquier sitio del organismo. Producen secrecin purulenta y suelen producir gases en el interior de los tejidos. Los factores predisponentes de mayor frecuencia son los traumas quirrgicos o accidentales, edema, anoxia y destruccin de tejidos, en stas circunstancias, pueden invadir los tejidos multiplicndose rpidamente. Con frecuencia pueden producir abscesos. Beneficios: - Estos microorganismos producen ac. Actico, butrico y propinico proporcionando el 70% de la energa a los entericitos colonicos. - Juegan un papel clave en la recirculacin de ac. Biliares entero hepticos y en la biotransformacin de cidos biliares. - Compite por los substratos con microorganismos patgenos. - Produce algo de vit K. DIAGNOSTICO MICROBIOLGICO * Toma de muestra por aspiracin. * Cultivo para anaerobios. 5. Mencione las principales caractersticas del aislamiento, identificacin de los hongos. desarrollo e

Para la identificacin de un moho se precisa una descripcin completa del organismo. Para estudiar sus caractersticas, se prefiere el medio de Czapeck que es un medio satisfactorio y da muy buenos resultados con fines comparativos.El examen de los cultivos debe hacerse diariamente, por lo menos durante la primera y segunda semana de incubacin. Las observaciones macroscpicas deben realizarce con la ayuda de una lupa. En general es posible determinar, por el examen visual, si una colonia de hongos es filamentosa o levaduriforme. Las colonias de hongos filamentosos tienen un aspecto velloso o acordonado, mientras que las levaduras producen colonias mantecosas con superficies lisas. Las colonias individuales desarrolladas en el medio Czapeck, se pueden estudiar a simple vista, con la lupa y al microscopio con poco aumento. Podemos as deducir lo siguiente: velocidad y forma de crecimiento, tamao y color de los cuerpos fructferos e hifas; elevacin y densidad de las distintas partes de la colonia, presencia o

ausencia de peritecios, variaciones en la forma y tamao de los ncleos de mohos. Debe observarse la consistencia de la superficie de la colonia, el plegamiento, la nitidez del borde y la presencia de pigmentos en la superficie o el reverso o su difusin hacia el medio circundante Invirtiendo la placa de Petri puede observarse el color del fondo de la colonia, as como cualquier coloracin producida en el medio. Estas observaciones son suficientes para indicar la clase u orden a que pertenece el hongo, pero para identificar el gnero y la especie es preciso el estudio al microscopio. Con las esporas se efectan las observaciones siguientes: forma, tamao, color, caractersticas y colocacin. En las hifas frtiles se examinan: ramas, tabiques, anchura, color, caractersticas y naturaleza de las paredes (lisas, picadas o rugosas). A partir de las observaciones as adquiridas y complementadas con las tcnicas de coloraciones conocidas, puede intentarse la identificacin del moho conociendo la descripcin de los gneros. 6. Investigue sobre las caractersticas y tratamientos de infeccin conocida en la actualidad como MRSA? En el pasado, la mayora de las infecciones por estafilococos respondan a un grupo de antibiticos llamados betalactmicos. Estos antibiticos abarcan miticilina y otros antibiticos ms comunes, tales como oxacilina, penicilina y amoxicilina. Aproximadamente 2 de cada 100 personas portan una cepa de estafilococo que es resistente a estos antibiticos. Ser resistente significa que un antibitico es incapaz de tratar y curar una infeccin con este tipo de bacterias. La cepa del estafilococo se denomina SARM o Staphylococcus aureus resistente a meticilina. Las infecciones por SARM a menudo ocurren en personas que estn en un hospital u otro centro de atencin mdica. Aquellas personas que han estado hospitalizadas o han tenido una ciruga en el ltimo ao estn en mayor riesgo. Las bacterias SARM estn causando un alto nmero de infecciones intrahospitalarias por estafilococos. Las infecciones por SARM extrahospitalarias se observan en personas por lo dems sanas que no han estado recientemente en el hospital. La mayora de estas infecciones comprometen la piel.

Las infecciones han ocurrido entre atletas que comparten equipo o elementos personales (como toallas o mquinas de afeitar) y nios en guarderas.

Los miembros de la milicia y aquellos que reciben tatuajes tambin estn en riesgo. El nmero de casos de SARM extrahospitalario se est incrementando.

Las infecciones cutneas por estafilococos provocan un rea con enrojecimiento, inflamacin y dolor en la piel. Puede haber drenaje de pus u otros lquidos del sitio. Es ms probable que los sntomas se presenten donde la piel haya sido cortada o frotada o en reas donde haya ms vello corporal. Cuando los pacientes contraen SARM en centros mdicos, las infecciones tienden a ser graves. Estas infecciones por estafilococos pueden estar en el torrente sanguneo, el corazn o los pulmones, la orina, o en el sitio de una ciruga reciente. Los sntomas de estas graves infecciones abarcan: Dolor torcico, Escalofro, Tos, Fatiga, Fiebre, Sensacin general de indisposicin (malestar), Dolor de cabeza, Mialgia, Erupcin cutnea, Dificultad para respirar.
Drenar la infeccin de la piel puede ser el nico tratamiento necesario para una infeccin cutnea local por Staphylococcus aureus resistente a meticilina. Este procedimiento se debe hacer en el consultorio mdico. Se pueden necesitar otros tratamientos para infecciones ms graves. Si usted todava no est en el hospital, lo pueden hospitalizar. El tratamiento puede consistir en: Lquidos y medicamentos por va intravenosa Dilisis renal (si se presenta insuficiencia renal) Oxgeno