Introduccion

Corynebacterium glutamicum bacteria Gram positiva del gnero Corynebacterium, asporgena (no produce esporas) y pleomrfica (que puede presentarse con diversas formas y tamaos) y productora natural del cido glutmico L-Glutamato: potenciador del sabor

 Corynebacterium glutamicum, se aisl originalmente como una bacteria productora de L-Glutamato .

C. glutamicum, libera ms de 80 g / litro de cido L-glutmico bajo condiciones de cultivo adecuadas.

Inconvenietes
Desde limitacin biotina y de otros tratamientos inductores son causantes de daos a las estructuras de la superficie celular este microorganismo, se ha asumido desde hace tiempo que L-Glutamato se fuga a travs de la membrana celular

Posible Solucin
La actividad de la deshidrogenasa 2-oxoglutarato (ODHC) al parecer disminuye durante la produccin de L-glutamato en respuesta a la limitacin biotina, steres de cidos grasos tensioactivos, y penicilina. La actividad ODHC se inhibi por la forma no fosforilada de la proteina OdhI, que es fosforilada por la serina / treonina y la protena quinasa PknG.

 NCgl1221 C. Glutamicum gen es homlogo a los canales mecanosensibles y juega un papel importante en la secrecin de L-glutamato, y se propone un nuevo modelo para la induccin de la secrecin de L-glutamato.

MATERIALES Y METODOS

Cepas bacterianas, condiciones de crecimiento y plsmidos

Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 L-glutamato productores 2A-1, 2A-1R, BL1 Escherichia coli JM109 se utiliz para la construccin y la propagacin de plsmidos. E. coli y clulas de C. Glutamicum se cultivaron a 37 C en medio LB o a 31,5 C en CM2B, respectivamente

 C. glutamicum ODHA se cultiv a 31,5 C en CM-Dex (por litro, 5 g de glucosa, 10 g de extracto de levadura, 10 g de triptona, 1 g de Fosfato de potasio monobsico, 0,4 g Sulfato de Magnecio Heptahidratado , 0,01 g Sulfato de Hierro Heptahidratado , 0,01 g sulfato manganeso, 3 g de urea, 34,5 ml de protena de soja hidrolizado [nitrgeno total, 1,2 g], ajustado a pH 7,0 con NaOH).

Construccin de mutaciones
Para interrumpir el gen ODHA, un fragmento interno deODHA se gener por PCR con el par de cebadores 5-GGG GAT CCA TCG GTA TGC CAC CAC GTG GTC GCC-3 y 5-GGG GAT CCA CGA CTG CTT CTG CAT CTT CGT TGG-3 (El subrayado indica el sitio de restriccin BamHI), Usando el gen ATCC 13869 del ADN cromosomal como plantilla.

 Para construir BL1 [NCgl1221 (V419 :: IS1207)], un fragmento del gen NCgl1221 era amplificado por PCR con el par de cebadores 5GGG AGC TCG ACT TTC TGG CTC TAC CTT T-3 y 5 GGG-AGC TCG CCG ATG GAG AAT AAT ACT A-3 (El subrayado indica el sitio SacI de restriccin), usando el cromosoma de C. glutamicum 2A-1R como plantilla.
Cada plsmido se introdujo en C. glutamicum ATCC 13869, y los clones con el plsmido integrado en el gen NCgl1221 se seleccionaron para su uso posterior.

Preparacion de la enzima y ensayo

Todas las etapas se realizaron a 4 C. C. glutamicum Las clulas se cosecharon, se lavaron dos veces en 0,2% de KCl, y se suspendieron en 100 mM N-tris (hidroximetil) metil-2 aminoetanosulfnico-NaOH, pH 7,5, que contiene 30% de glicerol.

Las clulas se rompieron por sonicacin, y el celular los desechos se eliminan por centrifugacin (15.000? g durante 15 min). La enzima cruda extractos se filtraron en gel en el mismo tampn en columnas PD10 (GE Healthcare Bio-Science Corp., Piscataway, NJ) para eliminar los metabolitos intracelulares. ODHC actividad se midi a 30 C en un ensayo fotomtrico siguiendo la tasa inicial en la absorbancia de 3-acetilpiridina adenina dinucletido a 365 nm.

Fermentacin de L-glutamato
Se utilizaron 4 condiciones Para la fermentacin de L-glutamato sin induccin, las clulas se cultivaron en 20 ml de medio GH1, en frasco Sakaguchi de 500 ml con agitacin Para la preuba tensioactiva de ster de cido graso o el tratamiento a penicilina, las clulas se cultivaron en 20 ml de medio medio GH2

 Fermentacin de L-glutamato por el agotamiento de biotina, 2-ml de alcuotas de cultivo de clulas se inocularon en 20 ml GH3 medio (GH2 medio sin biotina). fermentacin de L-glutamato en una jarra de fermentacin, las clulas se cultivaron en 300 ml medio GH4, Para la fermentacin principal, 30-ml alcuotas de cultivo de clulas se inocularon en 270 ml medio GH5

La aireacin se controla mediante agitacin para mantener el nivel de oxgeno disuelto por encima del 5%. Todas las clulas se cultivaron a 31,5 C. El pH se mantuvo a 7,2 con amoniaco gaseoso.

Extraccin de metabolitos intracelulares

Se realiz mediante una modificacin del mtodo descrito previamente. Lasclulas se separan del medio por filtracin rpida a vaco (Durapore HV, 0,45 M; Millipore, Billerica, MA), seguido por dos lavados con 10 ml de agua MilliQ y la incubacin de las clulas del filtro y adjunta durante 10 min en 2 ml de metanol que contiene 5 M cido morpholineethanesulfonic y 5 M metionina sulfona.

El extracto (1,6 ml) se mezcl con 1,6 ml de CHCl3 y 640 L de agua MilliQ, y la fase acuosa se aplic a una columna de centrifugacin para eliminar la contaminacin de protenas (Ultrafree-MC; Millipore). Los extractos filtrados se analizaron mediante capilar electroforesis de espectrometra de masas por Human Tecnologas metabolomaInc. (Yamagata, Japn). El volumen de la celda utilizada para calcular metabolito intracelular concentraciones fue de 1,6 l mg-1 peso seco de clulas (DCW) (4). El DCW fue calcula a partir de la DO620 por la siguiente frmula obtenida experimentalmente: DCW=22,707 x (DO620) / 100 (litros g-1).