Cocos gram positivos Cocos gram positivos

Fotografa: Laurent Schwebel asesinado en Retiro el 8 de febrero de 2012

Introduccin

Objetivos

Introducir el concepto de cocos gram positivos y sus representantes ms importantes. Valorar la importancia de los Staphylococcus como microorganismos productores de enfermedad en los animales. Caracterizar al gnero Staphylococcus y sus mtodos de identificacin.

Caractersticas generales Cocos gram positivos

Diversos gneros Bacterias esfricas o levemente ovales Gram Positivas No forman esporos Motilidad poco comn

Ejemplo de cocos gram positivos: Enterococos

Otras caractersticas

Respiracin
Aerobios Anaerobios facultativos Anaerobios estrictos

Agrupacin celular y Catalasa

Cocos anaerobios estrictos

Coprococcus

Peptococcus

Peptostreptococcus

Ruminococcus Sarcina

Peptostreptococcus anaerobius

Cocos aerobios estrictos

Deinobacter Deinococcus Marinococcus Micrococcus Planococcus Salinococcus

Cocos anaerobios facultativos

Aerococcus

Saccharococcus

Enterococcus
Gemella Lactococcus Leuconostoc Melissococcus Pediococcus

Staphylococcus
Stomatococcus

Streptococcus
Trichococcus Vagococcus

Cocos anaerobios facultativos

Enterococcus Staphylococcus

Streptococcus

Agrupacin en diplo

Enterococcus faecalis

Agrupacin en cadenas

Streptococcus agalactiae

Agrupacin en racimos

Staphylococcus aureus

Cocos anaerobios facultativos

Staphylococcus

Gnero Staphylococcus
Cocos Gram positivos esfricos Dispuestos irregularmente (racimos de uva) Inmviles No esporulados Aerobios o anaerobios facultativos

Caractersticas de los Staphylococcus

Catalasa positivo (diferencial de Streptococcus) Fermentan carbohidratos y Producen pigmentos desde el blanco hasta el amarillo dorado

Clasificacin
32 especies y 15 sub especies

COAGULASA POSITIVA
S. aureus S. intermedius S. delphini S. schleiferi subsp. coagulans

COAGULASA NEGATIVA
Resto de las especies

COAGULASA VARIABLE
S. hyicus

Importancia

Algunos son microbiota normal (mucosa, piel, etc.)

Producen procesos supurativos, infecciones seas, genitourinarias, piel, tejidos blandos, septicemias e intoxicaciones alimenticias

Historia
1880 Luis Pasteur en caldo de pus furuncular 1881 Ogston demostr que estaba siempre en pus y denomina Staphylococcus (griego sptaphyle: racimo de uvas) A partir de 1940 comienza la preocupacin por este microorganismos por la aparicin de resistencia a los antibiticos.

Historia

1990 Se valora la importancia de los Staphylococcus coagulasa negativa. Cada vez mayor importancia por su capacidad de desarrollar resistencia a los antimicrobianos de uso convencional en la clnica veterinaria.

Hbitat
Comensal de piel Mucosas

Digestiva Rino faringe

Morfologa
Esfricos Tamao: 0,5 a 1,5 mm Gram positivos

En muestras clnicas
De a pares, aislados o pequeas cadenas

En cultivo
racimo de uvas

NO FORMA ESPORAS NO TIENE FLAGELOS

Staphylococcus en muestra clnica. Observar agrupacin.

Otra muestra clnica

Staphylococcus de un cultivo.

Resistencia
Dentro de las bacterias no esporuladas son de las ms resistentes. Soportan la desecacin durante semanas 60 C durante 30 min. toleran pH de 4 a 9 y concentracin de sales hasta 10 %

Factores de virulencia estructurales

Peptidoglucano Protena A Factores de adhesin cidos teicoicos Polisacridos capsulares

Pared Celular

El peptidoglicano es importante en la patogenia de la infeccin. Estimula la produccin de

Interleuquina-1 (que acta como pirgeno endgeno) de anticuerpos opsnicos en los monocitos agregacin de leucocitos PMN (abscesos) actividad semejante a endotoxinas y activa el complemento.

Adems hay otras protenas de pared

Protena A
Muchas cepas patgenas de S.aureus estn recubierta de manera uniforme con protena A. Impide la eliminacin inmune mediada por Ac

cidos teicoicos
Los polisacridos ms importantes son los cidos teicoicos ligados al peptidoglicano. Su fraccin alcohlica es el ribitol en S. aureus y el glicerol en S. intermedius. unin especfica a la fibrinonectica, median en la colonizacin con superficies mucosas.

Protenas de superficie

La superficie externa contiene una protena denominada factor de agregacin o coagulasa de unin presente en S. aureus y S. hyicus.
se une al fibringeno (reaccin no enzimtica) produce fibrina insoluble (se forman grumos). In vitro se da una reaccin parecida a la aglutinacin y permite evidenciar el Cumpling factor.

Otras protenas de superficie

Otras protenas de superficie relacionadas con la adherencia a los tejidos del hospedador son la protena de unin al colgeno a la elastina y a la fibronectina

Cpsula
Polisridos unidos laxamente a la pared celular. 11 serotipos capsulares (clasificacin serolgica) En Argentina los ms frecuentes que producen mastitis bovina son los 5 y 8.

Cpsula

La cpsula es antifagocitaria (inhibe a los leucocitos PMN)

unin a catteres, sondas, prtesis, u otros materiales sintticos.

En Staphylococcus coagulasa negativa es indicadora de patogenicidad.

Productos relacionados con la patogenicidad

Enzimas
Coagulasa Catalasa Hialuronidasa Lipasas Nucleasa Finbrinolisina Betalactamasa Supervivencia intracelular

Exotoxinas
Hemolisinas Toxina alfa Toxina beta Toxina gamma y leucocidina de Panton Valentine Toxina delta Toxinas con actividad de superantgenos Enterotoxinas Toxinas exfoliativas A y B Toxina 1 del sndrome de Shock txico

Staphylococcus: productos celulares relacionados con la patogenicidad.

Coagulasa

La presencia de coagulasa es indicador de patogenicidad. Protena que coagula el plasma de conejo. Altera la capacidad fagoctica de los macrfagos.

Catalasa

El perxido se puede acumular durante el metabolismo de la bacteria o despus de la fagocitosis. estafilococos

Catalasa

2 H2O2
perxido de hidrgeno txico

2 H2O + O2

Hialuronidasa

La hialuronidasa hidroliza el cido hialurnico (cemento intercelular).

Lipasa

Estas enzimas hidrolizan los lpidos

(sobreviven en reas sebceas)

Nucleasa

La DNAsa contribuye a la capacidad invasiva de los estafilococos.

Fibrinolisina

O estafiloquinasa, es un activador del plasmingeno

disuelve la fibrina, aumentando la capacidad de invasin del microorganismo.

Betalactamasa

Las betalactamasas
(codificadas por plsmidos).

presentan resistencia betalactmicos

penicilina G, ampicilina, ticarcilina, piperacilina y otros betalactmicos

Supervivencia intracelular

Algunos estafilococos pueden sobrevivir en el interior de los fagocitos.

Exotoxinas

S. aureus pueden dividirse en dos grupos:

TOXINAS: con actividad sobre membranas con actividad de superantgenos.

Hemolisinas

Las hemolisinas son toxinas con accin sobre las membranas celulares producen lisis. Las hemolisinas tienen actividad de fosfolipasas.

Las toxinas hemolticas se presentan en forma aislada, en combinacin o no se presentan.

Toxina alfa

Acta sobre membranas celulares: eritrocitos, leucocitos, plaquetas y fibroblastos. Letal para el conejo por va endovenosa, por va subcutnea, es dermonecrtica. La mayora de las cepas humanas y alrededor del 50 % de las cepas de origen bovino aisladas de mastitis, la producen.

Toxina beta
Es una esfingomielinasa C produce hemlisis caliente-fra. Sustrato: esfingomielina.

La sensibilidad de los eritrocitos depende del contenido de esfingomielina: bovinos, ovinos y caprinos.

Toxina delta

Acta sobre las membranas biolgicas por una accin similar a la de los detergentes (tensioactiva) relativamente termoestable.

Lesiona: eritrocitos, macrfagos, linfocitos, neutrfilos y plaquetas.

Toxina gamma y leucocidina de Panton Valentine

Son toxinas polipeptdicas dos componentes: componente S (protenas de elucin lenta) y componente F (protenas de elucin rpida), actan sinrgicamente para daar la membrana de las clulas. Toxina gamma tiene mayor efecto sobre eritrocitos Leucocidina sobre neutrfilos y macrfagos.

Toxinas con actividad de superantgenos

Poseen actividad de superantgenos.

Son capaces de inducir la activacin inespecfica de los macrfagos y de las clulas T con liberacin de citoquinas y aumenta la susceptibilidad a los lipopolisacridos bacterianos.

Enterotoxinas
Raramente las producen cepas de origen animal. Intoxicacin alimenticia. Seis toxinas solubles. termoestables y resistentes a la hidrlisis de las enzimas gstricas y duodenales.

Toxinas exfoliativas A y B

Producen la separacin intraepidermal con formacin de ampollas y exfoliacin posterior. epidermis en perros y en las epidermitis exudativas de los lechones.

Toxina 1 del sndrome de shock txico

La Toxina-1 del sndrome del choque txico (TSST-1) termoestable y resistente a la protelisis. Aisladas de mujeres con sndrome del shock txico (SST), asociado a la menstruacin por el uso de tampones.

Diagnstico

Marcha bacteriolgica

Toma de muestra

Las muestras segn la patologa pueden ser:

frotis superficiales, pus, sangre, material aspirado de trquea, lquido cefalorraqudeo, orina, leche.

Observacin en fresco
Pueden observarse cocos agrupados o aislados inmviles. Importante observar la cantidad de neutrfilos presentes en la muestra.

Coloracin

Cocos gram positivos.

Tincin de Gram de Staphylococcus aureus

Staphylococcus sp. Coloracin de Gram. Hemocultivo

Cultivo

Medio de cultivo
Sin exigencias nutritivas

Incubacin
24 h

Temperatura ptima
37 C

Medio lquido
Turbidez homognea y abundante en el fondo del tubo crecimiento en forma de anillo en la superficie

Medios slidos
Colonias redondas 1 a 2 mm de dimetro Borde neto Superficie lisa, opaca o mucoide

Coloracin de las colonias

Blancas Al contacto con luz y aire pueden ser pigmentadas S. aureus produce pigmento dorado debido a pigmentos carotenoides. Estos pigmentos no se difunden al medio y en lquido y anaerobiosis no lo producen. Las colonias de Staphylococcus coagulasanegativos (ECN) son frecuentemente grises a blancas y no hemolticas.

Medios selectivos Medio Chapman con

NaCl 7,5% Manitol Rojo de Fenol

Medio Baird-Parker (para alimentos)

Emulsin de yema de huevo Telurito de potasio
Las colonias de Staphylococcus aparecen negras brillantes con un halo claro.

CATALASA POSITIVOS Utilizan los H de C tanto por oxidacin como por fermentacin Aerobios o anaerobios facultativos

La temperatura ptima: 37 C
pH ptimo de 7 a 7,5

Tipos de hemlisis

Agar cerebro corazn con 5% de sangre ovina (principalmente) o equina muchos son HEMOLTICOS

Colonias amarillo-doradas caractersticas de Staphylococcus

aureus

Cultivo

Agar sangre de oveja mostrando S. aureus, S. saprophyticus, y S. epidermidis. La flecha indica el punto de hemlisis beta alrededor de S. aureus.

Colonias de S. aureus creciendo en agar sangre

Staphylococcus epidermidis Crecimiento en agar sangre.

S. saprophyticus a partir de cultivo en agar sangre de oveja

Identificacin bioqumica

Anaerobio facultativo
pueden crecer en presencia o ausencia de oxgeno

Cocos Gram
Positivos OF Glucosa

Oxidativa

Fermentativa
Catalasa Negativa Positiva Staphylococcus

Micrococcus

Streptococcus Enterococcus

Catalasa
Negativa Streptococcus Enterococcus Positiva Staphylococcus

Diferenciacin entre Staphylococcus de Streptococcus y Enterococcus

Coagulasa
Positiva S. aureus Negativa Sensibilidad Novobiocina

Sensible
S. epidermidis

Resistente S. saprophyticus

Identificacin de los Staphylococcus ms comunes

Diferencias entre Micrococcus y Staphylococcus

(gneros positivos a la catalasa)

Criterios diferenciales para identificacin de las especies de ECP.

Catalasa

Prueba de la catalasa

La enzima catalasa que separa a los cocos que pueden estar presentes en una muestra clnica. La enzima catalasa est presente en Staphylococcus y Micrococcus

Coagulasa fija en portaobjeto

La enzima coagulasa est presente en Staphylococcus aureus.

Coagulasa libre en tubo

La enzima coagulasa est presente en Staphylococcus aureus.

Agar manitol salado

S. epidermidis

S. aureus

Agar Manitol salado Selectivo para Staphylococcus. S. aureus es capaz de fermentar el Manitol.

Prueba de novobiocina

S. saprophyticus es novobiocina R (inhibidor de girasa), S. epidermidis es novobiocina S (S.aureus tambin es S).

Prueba de la DNAsa

Halo claro y transparente (flecha) alrededor de las colonias que indica que la enzima ha hidrolizado el DNA del medio.

No se observa halo transparente alrededor del crecimiento bacteriano. DNAsa negativa.

Identificacin serolgica

Por antgenos presentes en su pared celular y capsular: 11 serotipos capsulares. Pruebas serolgicas en pacientes son de poco valor prctico (infecciones profundas: endocarditis estafiloccica o neumona Ac anti-cido teicoico).

Fagotipificacin

Bacterifagos que sirven para tipificarlos por su sensibilidad a ser lisados. Se utiliza para cepas de S. aureus de origen humano, bovino y aviar.

Antibiograma S. aureus
TM K GM

CM

PT

FOX

OFX

RA

FOS

FA

VA

TEC

NOV

TM : tobramicina K : kanamicina GM : gentamicina CM : clindamicina E : eritromicina PT : pristinamicina FOX : cefoxitina OFX : ofloxacin RA : rifampicina FOS : fosfomicin FA : cido fucdico VA : vancomicina TEC : teicoplanina NOV : novobiocina

Resistencia ante los ATB

Existe resistencia frente a los ATB tanto en ECP como en ECN pueden presentar sensibilidad frente a betalactmicos, aminoglucsidos, rifampicina, lincosamidas y macrlidos.

En Argentina se han descrito aislamiento de S. carnosus meticilino resistente a partir de leche de mastitis bovina.

Un estudio realizado en EE.UU sobre 136 muestras de carne Staphylococcus aureus fue resistente a diferentes tipos de antibiticos. El 96% era resistente a por lo menos un tipo de antibitico y el 52% era resistente a tres o ms tipos de antibiticos.

Estafilococos coagulasa negativos

Identificacin de los ECN se realiza por las pruebas de

oxidasa, sensibilidad frente a novobiocina, deteccin de la enzima beta-galactosidasa y determinaciones como utilizacin de azcares, ureasa, fosfatasa alcalina.

Epidemiologa
Portadores sanos e infectados actan como reservorio. Todos los mamferos poseen ECN en la piel. Importancia en alimentos.

Epidemiologa

Origen endgeno (heridas, infecciones urinarias, piodermias)

contacto directo, o por fomites (ropas, utensilios, pezoneras contaminadas).

Mastitis bovina canal del pezn.

Supervivencia en el medio ambiente

Importancia de los Staphylococcus en veterinaria

Procesos purulentos: osteomielitis, artritis, abscesos, conjuntivitis, otitis, pimetra, infecciones urinarias, flemones. Enfermedades especficas: S. aureus mastitis bovina y botriomicosis equina (infeccin granulomatosa del cordn espermtico). S. intermedius (perros y en gatos): abscesos, piodermias, otitis, conjuntivitis, mastitis y heridas.

Importancia en Veterinaria
S. hyicus: epidermitis exudativa y poliartritis en cerdos. Coagulasa negativos: mastitis subclnicas de las vaquillonas (S. chromogenes, S. epidermidis) En cabras, S. caprae, S. chromogenes y S. epidermidis.

Tratamiento

Limpieza de la herida con jabn germicida y la aplicacin de un antisptico (solucin iodada, hexaclorofenol).

Los abscesos cerrados y lesiones supuradas: drenaje y teraputica antimicrobiana.

Tratamiento

Tratamiento sistmico prolongado: piodermias graves y extensas, los procesos profundos (osteomielitis) Es difcil de erradicar La vancomicina es el antibitico til para tratar estafilococos resistentes a oxacilina Resistencia a vancomicina en el mundo.

Resumiendo

Introduccin a cocos gram positivos Caractersticas generales de los Estafilococos Componentes estructurales y factores de patogenicidad Mtodos de diagnstico Epidemiologa Generalidades de tratamiento Importancia en medicina veterinaria

Bibliografa

Gentilini E. Estafilococos. En Microbiologa Veterinaria. Stanchi N. y col. Ed. 2005 pg. 263.

http://ar.groups.yahoo.com/group/microvet/

Muchas gracias por mantener el orden.

Brotes de ETA Toxinas y Genes

En brotes de ETA por toxi infeccin de S. aureus el 95% de las cepas producen SEA SEB SEC (sec1, sec2, sec3) SED SEE Mientras que el 5% restante corresponde a las nuevas toxinas (SEG, SEH, SEI y SEJ)