Tcnicas para la caracterizacin de clones

Sofa Valenzuela Facultad Ciencias Forestales y Centro de Biotecnologa

Qu es la caracterizacin de clones?
Se emplea para determinar propiedades del ADNr
Tamao Mapa de restriccin Orientacin del gen Secuencia nucleotdica

Para todo ello .

Es necesario tener ADN purificado
Genmico Plasmidial

Purificacin de ADN genmico

Hay muchas tcnicas disponibles http://www.protocolonline.org/prot/Molecular_Biology/DNA/DN A_Extraction___Purification/

Uno de ellos es el CTAB

Se emplea el detergente cetyl-trimethylammonium bromide (CTAB)

(CH3)3-N+-C16H33 Br -

CTAB
Es un detergente catinico que permite precipitar cidos nuclecos y polisacridos cidos en medios de baja fuerza inica. Las protenas y polisacridos neutrales permanecen en la solucin.

 A alta fuerza inica, el detergente (CTAB) forma un complejo con las protenas y la mayora de los polisacridos (excepto los acdicos). No precipita el los cidos nuclecos. til en la purificacin de organismos que poseen un alto contenido de CH, como las plantas.

Para extraccin de ADN genmico

El lisado a emplear ha sido ajustado a alta fuerza inica (>0.7 M NaCl). Se remueve el pp de CTAB-protenaspolisacridos. Extracciones secuenciales con fenolcloroformo Precipitar el ADN con isopropanol o etanol.

CTAB

ADN
El ADN plasmidial es muy empleado en biologa molecular. Diversos plasmidios disponibles, de alta y bajo nmero de copias. Se puede aislar del ADN cromosomal.

ADN plasmidial
Miniprep, preparaciones a pequea escala de ADN plasmidial
Lisis alcalina Extraccin con fenol Precipitacin con etanol Gradiente en CsCl

Objetivo separar ADNpl del ADN cromosomal

Lisis alcalina
El pellet (bacterias) se resuspende en una solucin que contiene lisozima, para digereir la pared celular de la bacteria. En presencia de SDS (detergente) en solucin alcalina se rompe la membrana celular y denatura las protenas, ADN y ARN. Se lleva a pH 5 (con KOAc), donde precipitan las protenas denaturadas y ADN cromosomal. Se centrifuga y se obtiene el ADNpl, ARN y algunas protenas.

Extraccin con fenol

Paso para obtener el ADNpl puro. Se extrae el ADN pl con fenol o una mezcla de fenol-cloroformo (orgnico)

Fenol denatura a las proteinas remanentes y estas quedan como un precipitado en la fase intermedia.

Precipitacin con etanol

El ADN y ARN remanente se concentran por precipitacin con etanol. Se agrega NaOAc (0.3M) y se agrega 2-3 volmenes de etanol. Se centrifuga y el pellet se resuspende en buffer. Se puede tratar con RNAasa, para remover exceso de ARN

ADNpl
Ver para creer.. Se realiza una electroforesis en geles de agarosa y tincin del ADN
Bromuro de etidio

AGAROSE GEL ELECTROPHORESIS Agarose: A polysaccharide extracted from seaweed. Used to separate DNA fragments based on size

Colocar en un gel de agarosa

La sepacin en geles de agarosa es por tamao del ADN

Mixture of DNA molecules

La sepacin en geles de agarosa es por tamao del ADN

Gel of the week

(-) Decreasing Size

(+)

DNA Ladders

Se puede modificar la concentracin de agarosa

Varying concentrations of agarose DNA Ladders

La concentracin a emplear depende del tamao de los fragmentos a separar.

A mayor concentracin, para separar fragmentos ms pequeos

Concentraciones ms bajas para ADN de mayor tamao

Hay estndares de PM, predefinidos

Tincin del gel

Cmo se visualiza el ADN?

Bromuro de Etidio

Se intercala entre las bases de ADN

En presencia de luz UV (300-360), EtBr emite luz fluorescente a 590 nm

http://sandwalk.blogspot.com/2007/07/ethidium-bromide-binds-to-dna.html

Methylene blue
Miembro de la familia de las tiazinas Unin inica a DNA y RNA Unin dbil, requiere mayor cantidad de ADN/ARN Se puede desteir el gel.

Crystal Violet
Se intercala al DNA, pero es menos mutagnico. Se detecta en el rango visible, no requiere luz UV.

SYBR Safe
Desarrollado por la empresa Invitrogen Similar a EtBr

Ya tenemos el ADN
Ahora se requiere contar con fragmentos ms pequeos.. Podemos clonar fragmentos especficos o de inters. El fin es clonar el ADN.

Enzimas empleadas en clonamiento del ADN

Hay varias, las ms importantes
Enzimas de restriccin Fosfatasa Ligasa Exonucleasa Quinasas Taq polimerasa

Cmo verificar si lo qu tengo es un plasmidio?

Se debe conocer el mapa del plasmidio
Conocer la secuencia que ste tiene

Se realiza un mapa de restriccin

http://www.plantmethods.com/content/figures/1746-4811-1-13-1.jpg

Para ello requiero de enzimas de restriccin

Enzimas de Restriccin (ER)

Herramientas imprescindibles para el manejo de ADN, debido a la especificidad con que cortan secuencias de ADN. ADN de diferentes fuentes pueden ser cortados por la misma ER y unidos por la accin de la ligasa, generando molculas quimricas. Existen en forma natural en bacterias (ms de 200)

Enzimas de restriccin Endonucleasas especficas Reconocen secuencias cortas del AND y generan un corte, en o cerca del sitio de reconocimiento. Las regiones que reconocen: por lo general 4 o 6 bases, pero en algunos casos 5, 8, o ms Reconoce palndromes

Enzimas de restriccin
Se aislan de bacterias Su nombre deriva de la bacteria Gnero- primera letra (mayscula) Especie- segunda y tercera letra (minscula) Letras adicionales desde strains (cepas) Nmeros romanos se refieren a diferentes enzimas aisladas de la misma cepa de bacterias

Ejemplo: EcoRI E Escherichia Co coli R R strain I primera enzima descrita en Escherichia coli R

Restriction enzymes II
coli (species)

Nomenclatura

Escherichia (genus)

RY13 (strain)
First identified

Eco R I
Se clasifican en: Tipo I y III: cortan lejos del sitio de reconocimiento Tipo II: cortan en el sitio de reconocimiento

Clasificacin funcional:

Blunt ends Sticky ends / compatible ends Cortes frecuentes (4bp) 44 = 256 pb Cortes rare (6bp) 46 = 4096 pb

Los cortes pueden ser romos.(blunt ends)

O bien pegajosos (sticky ends- cohesive)

Hay miles de ER

Enzyme Ava I Bam HI Bgl II Eco RI

Organism from which derived Anabaena variabilis Bacillus amyloliquefaciens Bacillus globigii Escherichia coli RY 13

Target sequence C* C/T C G A/G G G* G A T C C A* G A T C T G* A A T T C

Eco RII
Hae III Hha I Hind III Hpa I Kpn I Mbo I Mbo I Pst I Sma I SstI Sal I Taq I

Escherichia coli R245

Haemophilus aegyptius Haemophilus haemolyticus Haemophilus inflenzae Rd Haemophilus parainflenzae Klebsiella pneumoniae Moraxella bovis Moraxella bovis Providencia stuartii Serratia marcescens Streptomyces stanford Streptomyces albus G Thermophilus aquaticus

* C C A/T G G
GG*CC GCG*C A* A G C T T G T T * AA C G GTAC * C *G A T C *G A T C CTGCA*G CCC*GGG GAGCT*C G *TCGAC T*CGA

Xma I

Xanthamonas malvacearum

C*CCGG

Nucleotide Specificity

Example

Frequency of Occurrence

Four
Five Six Seven Eight

Alu I
Nci I EcoR I EcoO109I Not I

256 (0.25 Kb)

1024 (1.0 Kb) 4096 (4.1 Kb) 16384 (16.4 Kb) 65536 (65.5 Kb)

Metilasas.
Existen metilasas que reconocen secuencias de ADN y metilan (CH3). Emplean SAM (S-adenosilmetionina) Rol de proteccin en bacterias. Algunas poco especficas
5' CG 3'. (metilan C)- Sss I

Metilaciones ms comunes

Corte de ADN con ER

Hpa I

EcoR I

Hind III

Hind III + EcoR I

Electroforesis

correr los fragmentos

Tincin del gel

Si ahora cortamos el plasmidio

1

EcoRI
358

pIBV2006 4558pb
2558
858 MseI MseI

Qu obtenemos en el gel?
1 EcoR1 358 MseI 858 MseI 2558 4558

EcoRI

MseI

EcoRI + MseI

MW M
10000 5000 4000 3000 2000 750 500 100

Manipulacin de fragmentos de ADN

Los fragmentos de ADN obtenidos pueden ser empleados para clonar. Previo a ello, se requiere tratar al ADN

Fosfatasa alcalina
Remueve el grupo fosfato del extremo 5 de molculas de ADN o ARN de simple o doble hebra. Evita que el plasmidio se recircularice o haya unin del fragmento de ADN, luego de ser tratado con ER

Para recordar.

Si tenemos un fragmento ADN

Fosfatasa alcalina

X
X

X X

ADN ligasa - EC 6.5.1.1

Realiza uniones de ADN de doble hebra entre un grupo 5 P y 3OH, mediante una reaccin dependiente de ATP. Requiere tener fragmentos que sean compatibles (extremos pegajosos o slo romos).

Con extremos pegajosos

El mecanismo.

http://bitesizebio.com/wp-content/uploads/2007/10/dna-ligase-mechanism.gif

Nucleasas
Cortan desde los extremos de ADN lineal. Nuclease BAL-31 Exonucleasa III Mung Bean Nuclease

Nuclease BAL-31
Es una exonucleasa
Sentido 5 y 3

Exonucleasa III
La exonucleasa III digiere el ADN doble hebra (dsDNA) slo desde el extremo 3.

Mung Bean Nucleasa

Degrada ADN o ARN de simple hebra, en 5 o 3.

Frejol Mungo
Vigna radiata Originario de India Se aisl la enzima

ADN polimerasa
Se han caracterizado una serie de ADN polimerasas, que poseen las siguientes caractersticas
Agregan nucletidos en el extremo 3 Se basan en un templado.

ADN Polimerasas

ADN Polimerasas
Pueden tener adems
Actividad exonucleasa Permite corregir errores durante la sntesis

ADN polimerasa I
Sintetiza ADN complementario a la hebra molde, en direccin 53 Requiere de un primer con 3OH libre Fragmento Klenow
No posee la actividad 53

Caractersticas de polimerasas
E. coli DNA polI E. coli DNA T4 DNA pol I - Klenow Fragment T7 DNA Taq DNA M-MuLV Tx reversa

5-3 3-5 Error (106) Inac. calor

+ + 9 +

+ 40 +

+ <1 +

+ 15 +

+ 285 -

N/A +

Taq ADN polimerasa

Aislada de una bacteria termoestable (Thermus aquaticus). Temperatura ptima de 72C y estable sobre 90C. Empleada en PCR (polymerase chain reaction)

Transcriptasa reversa
ADN polimerasa ARN dependiente. Sintetiza ADN complementario a un templado de ARN en la direccin 53. Requiere partidor con 3 OH libre. Aisladas de virus
HIV-1rt from the human immunodeficiency virus type 1 (PDB 1HMV) M-MLV rt from the Moloney murine leukemia virus AMV rt from the avian myeloblastosis virus

RT-actividades
DNA polimerasa: En el retrovirus, la enzima copia slo ARN , pero en el laboratorio puede copiar ssARN y ssADN con igual eficiencia. Requiere de un partidor de ARN o ADN.

RNasa H : RNase H es una ribonucleasa que degrada el ARN del hbrido ARN-ADNformado por ejemplo en la Tx reversa. Posee actividad endonucleasa y exonucleasa.

Mecanismo

ARN polimerasas
Hay varios tipos, las principales
T7, T3 y SP6

Provienen de bacterifagos Requieren del promotor especfico Empleadas para la transcripcin.

RNAasa
Capaces de degradar ARN
RNasaA, degrada ARN, pero no ADN RNasaH, Degrada el RNA, en la forma de duplex ARN-ADN

Su estabilidad es el principal problema para manipular el ARN..

Ms informacin
http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html http://www.youtube.com/watch?v=Q53NR h_KJ6w&feature=related