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PRINCIPIOS DE DIAGNSTICO BACTERIOLGICO

Dra. Mara Blanca Machuca Soto Msc. Microbiologa

EXAMEN EN FRESCO

DEFINICIN:
Observacin de los microorganismos al microscopio, en vivo, sin ninguna tincin previa. Se emplea cuando interesa observar alguna caracterstica del organismo vivo, como el movimiento de algunas bacterias, o la morfologa de protozoos

TCNICAS DE TINCIN

FUNDAMENTO:
El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea. Por lo que el medio ms simple de aumentar el contraste es la utilizacin de colorantes

Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de clulas

Para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares

IMPORTANTE
Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos

IMPORTANTE
Los mtodos de tincin son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaucin, ya que pueden conducir a errores Las molculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares autnticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante

CLASIFICACIN DE LOS COLORANTES POR SU CARGA


Los colorantes pueden dividirse en dos de acuerdo a su carga:

Colorantes bsicos que presentan carga positiva capaz de unirse a molculas cargadas negativamente como cidos nucleicos y algunas protenas. Ejemplos de ellos son: cristal violeta (violeta de genciana), azul de metileno, safranina, fucsina bsica, verde de malaquita, etc. Son los ms usados para la tincin de las clulas

Colorantes cidos con grupos cargados negativamente y que se unen a estructuras con carga positiva como la eosina, la fucsina cida,y el rosa de bengala

PREPARACIN DE UN FROTIS
Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del material que se va a teir (si es lquido) o se hace rodar el hisopo con que se tom la muestra

PREPARACIN DE UN FROTIS
Este material es suspendido en una gota de agua o solucin salina previamente colocada sobre el portaobjetos

PREPARACIN DE UN FROTIS
El material colocado en el portaobjetos se deja secar al aire o bien se pasa varias veces por la zona azul de la llama de un mechero Bunsen hasta que el vidrio est tan caliente que moleste al tacto pero no queme

TINCIN GRAM
La tincin Gram fue desarrollada empricamente por Christian Gram en 1884, a pesar del tiempo transcurrido la tincin apenas se ha modificado y es uno de los primeros pasos que se realiza para cualquier identificacin bacteriana La tcnica es capaz de diferenciar dos grandes grupos de bacterias: Gram positivas y Gram negativas

TINCIN GRAM
Su utilidad prctica es indiscutible y en el trabajo microscpico de rutina del Laboratorio de Microbiologa las referencias a la morfologa celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos) se basan justamente en la tincin de GRAM

TCNICA GRAM

FUNDAMENTO DE LA TCNICA DE GRAM


La diferenciacin entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas se establece en la naturaleza de la pared celular bacteriana

PARED CELULAR
Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo microorganismo, si sufre dao de la pared por una u otra causa, se vuelve gram negativo. Esto indica la importancia de la pared para la retencin o el escape del colorante

Las bacterias Gram positivas poseen una gruesa pared de peptidoglicano que es capaz de retener al complejo cristal violeta-yodo. Durante la decoloracin con alcohol acetona se provoca una deshidratacin de esta gruesa pared y se reduce la porosidad, atrapando entonces al complejo dentro de la clula

En cambio en las Gram negativas, la delgada capa de peptidoglicano no puede impedir la salida del complejo colorante y es entonces fcilmente teida por el colorante secundario o de contraste

DIFERENCIAS ENTRE GRAM (+) Y GRAM (-)

PARED CELULAR MYCOBACTERIAS


Posee una pared celular con un alto contenido de cidos miclicos que le da su principal caracterstica: la cido-alcohol resistencia

TINCIN DE ZIEHL NEELSEN


La tincin de ZiehlNeelsen (BAAR) es una tcnica de tincin diferencial rpida y econmica, que se basa en que las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos grasos

La tincin fue descrita por primera vez por dos mdicos alemanes, Franz Ziehl, un bacterilogo y Friedrich Neelsen, un patlogo

La coloracin clsica de ZiehlNeelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras

ALGUNOS MICROORGANISMOS CIDOALCOHOL RESISTENTES

Mycobacterium: fuertemente cidoalcohol resistentes Nocardia y Actinomices: dbilmente cidoalcohol resistente Parsitos coccdeos (Cryptosporidium) de muestras fecales

Otras tinciones de uso habitual RODAMINA-AURAMINA


Los cidos miclicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para los fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias, que aparecen de color amarillo o naranja brillante contra un fondo verdoso

NARANJA DE ACRIDINA
En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la fluorescencia puede variar, dependiendo del pH y de la concentracin El naranja de acridina ha sido empleado como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo est vivo y roja si est muerto. De todos modos, como el colorante se intercala en el cido nucleico, el germen viable se inactivar poco tiempo despus de la tincin.

BLANCO DE CALCOFLOR
Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de calcoflor aumentando considerablemente su visibilidad en los tejidos y otras muestras
Se emplea para aumentar la visualizacin de los elementos morfolgicos de los cultivos puros de los hongos