GENES, GENOMAS Y TCNICAS DE INGENIERA GENTICA...

... CON UN TOQUE DE BIOINFORMTICA

CDIGO GENTICO
DNA Doble Hlice 5'ATG CTT CCT CGG TGC TAC TGT GAA TAA 3' 3'TAC GAA GGA GCC ACG ATG ACA CTT ATT 5'
Hebra codificadora Hebra no codificadora

Retrotranscripcin mRNA

TRANSCRIPCIN 5'AUG CUU CCU CGG UGC UAC UGU GAA UAA 3' TRADUCCIN

Protena

(NH2)MET-LEU-PRO-ARG-CIS-TIR-CIS-GLU-FIN(COOH)

GENES
Un gen es la unidad bsica de herencia de los seres vivos. Un gen es una secuencia lineal de nucletidos en la molcula de ADN (o ARN en el caso de algunos virus), que contiene la informacin necesaria para la sntesis de una macromolcula con funcin celular especfica. Por ejemplo: Protenas, ARNm, ARN ribosmico, ARN de transferencia y ARN pequeos.

GEN PROCARIOTA

mRNA POLICISTRNICOS

GEN EUCARIOTA

GENOMAS
El genoma es todo el material gentico contenido en las clulas de un organismo en particular.

EUCARIOTAS

CROMOSOMA

MITOCONDRIAS

CLOROPLASTOS

GENOMA HUMANO 3200 MB

Organismo Tamao Genoma(pares de bases) Fago 5104 Escherichia coli 4106 Levadura 2107 Caenorhabditis elegans 8107 Drosophila melanogaster 2108 Humano 3109

Amphibians 1091011 Psilotum nudum 2.5 x 1011

C-value enigma C-value paradox

El C-value enigma C-value paradox es un trmino usado para describir la variacin en los tamaos de genomas nucleares entre las especies eucariotas. El objeto de estudio del C-value enigma es la observacin de que el tamao del genome no se correlaciona con la complejidad del organismo.

EJERCICIO

Hacer un programa que a partir del archivo MTtabaco.gbk que contiene el genoma mitocondrial de tabaco extraer el gen que pida el usuario con 1000nts upstream y 1000nts downstream y guardarlo en formato fasta. Especificaciones del formato Genbank. http://www.ebi.ac.uk/embl/Documentation/FT_d efinitions/feature_table.html Especificaciones del formato Fasta. http://www.bioperl.org/wiki/FASTA_sequence_f ormat

LOCUS BA000042 430597 bp DNA circular PLN 02-MAY-2006 DEFINITION Nicotiana tabacum mitochondrial DNA, complete genome. ACCESSION BA000042 AP006340 AP006341 VERSION BA000042.1 GI:56806513 KEYWORDS . SOURCE mitochondrion Nicotiana tabacum (common tobacco) ORGANISM Nicotiana tabacum Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta; Spermatophyta; Magnoliophyta; eudicotyledons; core eudicotyledons; asterids; lamiids; Solanales; Solanaceae; Nicotianoideae; Nicotianeae; Nicotiana. REFERENCE 1 AUTHORS Sugiyama,Y., Watase,Y., Nagase,M., Makita,N., Yagura,S., Hirai,A. and Sugiura,M. TITLE The complete nucleotide sequence and multipartite organization of the tobacco mitochondrial genome: comparative analysis of mitochondrial genomes in higher plants JOURNAL Mol. Genet. Genomics 272 (6), 603-615 (2005) PUBMED 15583938 REFERENCE 2 (bases 1 to 430597) AUTHORS Sugiyama,Y., Watase,Y. and Nagase,M. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (04-APR-2003) Yasuo Sugiyama, Nagoya University, Center for Gene Research; Chikusa-ku, Furo-cho, Nagoya, Aichi 464-8602, Japan (E-mail:ysugiya@gene.nagoya-u.ac.jp, Tel:81-52-789-5943, Fax:81-52-789-4526) FEATURES Location/Qualifiers

/db_xref="GI:56806523" /translation="MDLYSIRNQRISPQKREEFPLLSFCSARAWHSLLAERHTEKKKR LPYLSNSSYSYSFLVVVPILVFFFLAFLGPSVFRTVRLATMNEYYVNRVSCSLSCALN TKLGQRCEGL" gene complement(24579..25766) /gene="atp6" Formato Genbank CDS complement(24579..25766) /gene="atp6" /note="CDS is reported in Acc# X06595" /codon_start=1 /product="ATP synthase F0 subunit 6" /protein_id="BAD83425.1" /db_xref="GI:56806524" /translation="MFRRIFLFDEDSLNSSVTSYTNASQSTTTIMDYSLKSSDTQGSS SGIFTDHPGLNPCSERIVELQYDIRLKLGALMPKESAQKVLEASEALHGESNNIAFLE

YLLEDLQQNGVGGEAYKDAVDLSKDLVSSPLEQFEIISLIPMKIGNLYFSFTNPSLFM
LLTLSLVLLLVYFVTKKGGGNSVPNAWQSLVELIYDFVLNPVNEQIGGLSGNVKQKFS PRISVTFTFSLFCNPQGMIPYSFTVTSHFLITLGLSFSIFIGITIVGFQKNGLHFLSF LLPAGVPLPLAPFLVLLELIPYCFRALSSGIRLFANMMAGHSSVKILSGFAWTMLCMN DLLYFIGDLGPLFIVLALTGLELGVAISQAHVSTILICIYLNDAINLHQSASFFIIEQ KRV" gene complement(31411..31743)

ORIGIN 1 attcacagtg ctcttcgcaa tctcgatcct cgcaatgctc tgcaacccga gggtgagcgc 61 cattgaagga ctggaagcaa gcttcacacc ttccacaacg gcaactacac cgtcgactcc 121 acaagaactc caagaacact cgttcttctc tcacacagca ctcctccctc cgatcttgtc 181 ccatctcggc ttccacgcgc gtgtcgcccc tatatgctgt caccgactag gctcggacgg 241 tggaggaagc tggtagcatt aggagaattt tcagcacttt tataacacag agtcagcgcg 301 aagaaaggca gatccatact agatcaacgg ttttcctttc tcttacgaga ttttcatttc 361 tagttagagg agcagaccac tctaacttac tttagaacaa tgagaaatgt aacactcacc 421 aactgaagaa cgaatgtgag ctcgggagga aatgtgcctc tccaactcgt actttgctac 481 aacgatcttt gtatgtacgg gtatcgataa tggaagagac tagatcaaat agggcaattc 541 gtaatgctct cttcctgtcc tagaataaga aagtagcttg tctgccgtac tggctgcttc 601 attgaatgtg tcgatctgca ttctatataa ggagttgatt tgcatccttg tctggcagtt 661 agctaagcga gaagctgtga tcgaggaagc cccgcccagt agtgcctcta ctctactagt 721 cctagtacta gatactagat agacaggccg gtcaccggtg gcataagatc cttctctgct 781 tgtctaactc aagccagata gcagcaatca ctcgaaatag tcatatgcgg aacacatgca 841 agtccagatt gaaagataag gaaggcaagt caaagcggaa agaaa

Formato Fasta
>gi|142864|gb|M10040.1|BACDNAE B.subtilis dnaE gene encoding DNA primase, complete cds GTACGACGGAGTGTTATAAGATGGGAAATCGGATACCAGATGAAATTGTGGATCAGGTGCAAAAGTCGGC AGATATCGTTGAAGTCATAGGTGATTATGTTCAATTAAAGAAGCAAGGCCGAAACTACTTTGGACTCTGT CCTTTTCATGGAGAAAGCACACCTTCGTTTTCCGTATCGCCCGACAAACAGATTTTTCATTGCTTTGGCT GCGGAGCGGGCGGCAATGTTTTCTCTTTTTTAAGGCAGATGGAAGGCTATTCTTTTGCCGAGTCGGTTTC TCACCTTGCTGACAAATACCAAATTGATTTTCCAGATGATATAACAGTCCATTCCGGAGCCCGGCCAGAG TCTTCTGGAGAACAAAAAATGGCTGAGGCACATGAGCTCCTGAAGAAATTTTACCATCATTTGTTAATAA ATACAAAAGAAGGTCAAGAGGCACTGGATTATCTGCTTTCTAGGGGCTTTACGAAAGAGCTGATTAATGA ATTTCAGATTGGCTATGCTCTTGATTCTTGGGACTTTATCACGAAATTCCTTGTAAAGAGGGGATTTAGT GAGGCGCAAATGGAAAAAGCGGGTCTCCTGATCAGACGCGAAGACGGAAGCGGATATTTCGACCGCTTCA GAAACCGTGTCATGTTTCCGATCCATGATCATCACGGGGCTGTTGTTGCTTTCTCAGGCAGGGCTCTTGG

TECNOLOGA DEL ADN RECOMBINANTE

Las tcnicas ms importantes:
- Clivado del ADN en sitios especficos por enzimas de restriccin. - Hibridacin de cidos nuclicos. Southern blot, Northern blot, hibridacin in situ y Western blot. - Clonado molecular del ADN. Vectores de clonado. - PCR, reaccin en cadena de la polimerasa.

MANIPULACIN DEL ADN IN VITRO ENZIMAS DE RESTRICCIN - Permiten realizar cortes en sitios especficos en el ADN, que permiten aislar y manipular genes individuales. - Son endonucleasas (cortan enlaces internos de la molcula) de origen bacteriano. - Reconocen secuencias especficas de ADN de diferente longitud. - Luego del reconocimiento realizan el corte.

ENZIMAS DE RESTRICCIN
- Existen alrededor de 4000 enzimas de restriccin conocidas. - 671 disponibles comercialmente. - Hay bases de datos de enzimas de restriccin y sus sitios de reconocimiento y corte: REBASE

http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html

RESTRICCIN EN 2 PASOS
from Bio import Restriction from Bio import Seq from Bio.Alphabet import IUPAC an=Restriction.Analysis(Restriction.CommOnly, Seq.Seq\ (secuencia, IUPAC.unambiguous_dna)) an.print_as ("map") Resultado (output):

7 TspEI Sse9I Tsp509I FokI | | 12 HpyCH4V CviRI | | | | 20 BstF5I BseGI | | | ATGGGTAATTGCAACGGGGCATCCAAG ||||||||||||||||||||||||||| TACCCATTAACGTTGCCCCGTAGGTTC 1 27

HIBRIDACIN DE ACIDOS NUCLICOS

- El apareamiento de las bases (A-T y C-G) para formar una doble hlice se llama hibridacin, dado que puede utilizarse para formar ADN hbrido compuesto por cadenas de diferentes orgenes. - La hibridacin permite la formacin de complejos DNA:DNA y ADN:ARN usando la complementariedad de bases (A-T, C-G). - El fenmeno de hibridacin ocurre bajo condiciones especiales en solucin (pH, concentracin de sales, T0, etc).

5'- A T G C T A G A G G G C T A A C G T A C T A G -3' 5'- A T CT C C C G A T T G C A T -3' 5'- A T G C T A G A G G G C T A A C G T A C T A G -3' 5'- A T C T C C C G A T T G C A T -3'

TCNICAS BSICAS
DNA
Cortado por enzimas de restriccin

RNA

PROTENA

ELECTROFORESIS

TRANSFERENCIA

Tranferencia de protenas, RNA o DNA separados por electroforesis a membranas sintticas.

Hibridacin del DNA o RNA con secuencias marcadas con radiactivo (sondas). Revelado por radioautografa. Deteccin de Protenas con anticuerpos marcados.

REVELADO

RESULTADOS Southern blot Northern blot Western blot

HIBRIDACIN IN SITU

CLONADO MOLECULAR

Introduccin en una clula hesped de una mlecula de ADN capaz de replicarse en paralelo con el genoma del hesped en estado episomal, es decir sin integrarse al genoma.

VECTORES DE CLONADO

BACTERIFAGOOFAGO

PLSMIDOS

PCR

TM temperature melting

DNApol de bacterias termofilas

Diseo de primers 15-30 nts

MUESTRAS

USOS DE LA PCR
Huella gentica Test de Paternidad Diagnstico de enfermedades hereditarias Clonacin de genes Mutagnesis Anlisis de ADN fsil Genotipado de mutaciones especficas Identificacin de especies

SECUENCIACION
A partir de 1970 fue posible determinar secuencia nucleotdica de fragmentos de DNA Mtodos clsicos: qumico y enzimtico

Mtodo qumico de Maxam y Gilbert

Pero en la actualidad los mtodos de secuenciacin utilizados se basan en el Mtodo enzimtico de Sanger

Ventajas
- Automatizacin completa de todo el proceso, no siendo necesaria siquiera la presencia de un tcnico que cargue las muestras. - Rapidez en el anlisis de cada muestra: dado el pequeo dimetro de los capilares, por lo que pueden leerse del orden de 450 nucletidos en el plazo de 1 hora.

Otros mtodos de secuenciacin automtica: - Empleando microarray - Pirosecuenciacin

Lectura de unas 100 millones de bases por corrida del instrumento (7.5 horas).

Referencias
Molecular Biology of The Cell. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books http://www.gbiosciences.com/Image/BE307.jpg http://www.biologyreference.com/images/biol_02_img0140.jpg www.biopython.org http://biology.clc.uc.edu/fankhauser/Labs/Genetics/PCR/PCR_Protocol.htm

http://members.aol.com/BearFlag45/Biology1A/LectureNotes/LNPics/Recomb/pcr.gif
Introduccin a la Oncologa Molecular. Gomz y Alonso. Universidad Nacional de Quilmes, 1998. http://www.genomesonline.org/gold_statistics.htm

Lic. Virginia Gonzlez