resposta hormonal ao estresse

vitelogenina como biomarcador

VITELOGENINA (VTG)

glico-fosfo-lipoprotena de alto massa molecular (de 170-200 kDa)

produzida em HEPATCITOS sob controle multi-hormonal: a transcrio do
RNA
m
ativada por estrgenos - 17|-estradiol ( E
2
)

principal constituinte do VITELO, liberada no sangue (exocitose)

relacionada a outros biomarcadores e ao
SISTEMA NEUROENDCRINO REPRODUTOR
de peixes

XENOESTRGENOS: substncias que so desreguladoras endcrinas
a expresso da VTG por hepatcitos,
ou a supresso da mesma, tm sido usadas em peixes
como indicadores de efeitos (ANTI)ESTROGNICOS:
estrognicos em machos e jovens
anti-estrognicos em fmeas.

seqncia aa da VTG: bem conservada entre distintas TAXA no tempo evolutivo

VTG de TELEOSTEI: National Center for Biotechnology Information
BioEdit v.5.0.9 e ClustalW
alinhadas em consenso:
56,8% de similaridade, duas a duas
nmero mdio de 1713 aa (DP = 50 aa)
187,95 kDa (DP = 5,15 kDa).
BioEdit v.5.0.9 e ClustalW

BioEdit v.5.0.9 e ClustalW

BIOMARCADORES

RESPOSTA BIOLGICA de um organismo ( INDIVIDUAL ) que
ocorre da EXPOSIO do mesmo a um XENOBITICO

ALTERAES FISIOLGICAS ou MORFOLGICAS
em VIAS METABLICAS,
CLULAS, TECIDOS ou
SISTEMAS INTEGRADOS do organismo

PROCESSO ALTERADO: uma RELAO (causa-efeito) de
componentes de um sistema biolgico entre si e entre
os componentes daquilo que no o sistema biolgico em
questo.

DETECTVEL ou MENSURVEL por mtodos
bioqumicos, fisiolgicos, histolgicos ou morfolgicos (imagem)
SISTEMA HEPTICO
(HEPATCITO)

Expresso de METALOTIONENA
indut.: metais, EsROx e ESxH
tolerncia a EsROx, p.ex.:H
2
O
2

atividade antioxidante


HOMEOSTASE OXIDATIVA
tolerncia a EsROx
atividade antioxidante:
SOD, CATALASES,
peroxidases, GSHp
GSH S-t, GSHr
[GSH]


Expresso de P450
uso de EsROx em oxidaes
l catabolismo (MFOS):
oxidao de esterides
l ativ. monoxigenases associadas
p.ex.: EROD


Expresso de VITELOGENINA
regulada por 17|-Estradiol

xenobionte com:
ativ. estrognica
(machos e jovens)
ativ. anti-estrognica
(fmeas)

HOMEOSTASE DE Zn
&
ATIVIDADE DE METALOENZIMAS
SISTEMA REPRODUTOR
NEUROENDCRINO

CREBRO

HIPOTLAMO
GtRH (+) / DPM ()

HIPFISE
GtH I & GtH II (+)
e outros (+/)

TESTCULO/OVRIO
ESxH e outros fatores
dimorfismo sexual
gametognese (Zn)
incorpora VT (GtH I)

o-ALAd

inibio :
ANEMIA
PORFIRIA

l [ pre-HEME ]
[ HEME ]
l [ o-ALA ]

ESTRESSE
OXIDATIVO
POUCA
RELEVNCIA
ECOLGICA
GRANDE
RELEVNCIA
ECOLGICA
RESPOSTA A
LONGO PRAZO
RESPOSTA A
CURTO PRAZO
parmetros
bioqumicos
enzimas de
desintoxicao
parmetros
imunolgicos

parmetros
histopatolgicos

condies
bioenergticas
populaes &
comunidades
capacidade
reprodutiva
parmetros
fisiolgicos
ADAMS et alii
1989
OBJETIVOS

exteno
ou
extrapolao




ensaios
prvios
spp BR

mtodos
fceis e
baratos

MOLCULA CLU
LA
TECIDO RGO SISTEMA ORGA
NISMO
POPULAO COMUNIDADE ECOSSISTEMA
VITELOGENINA de PEIXES (VTG)
>> GLICO-LIPO-FOSFO-PROTENA de ALTO PESO MOLECULAR (160-210 kDa ; mdi a apr ox.: 180 kDa )
>> expresso hept ica (HEPATCITOS ) INDUZVEL (ATIVAO da t ranscri o de RNAm)
em fmeas , machos e jovens i mat uros sob CONTROLE HORMONAL, por :
E2

: 17
|
-est radi ol (hor mnio nat ur al)
EE : hor mnios SINTTICOS ou SUBSTNCIAS EXGENAS
> EE2 : et i ni l -est radi ol com ao est rogni ca (XENOESTRGENOS )
> DEB : di et i l -est i l -best rol
>> INCORPARADA NOS OCITOS em desenvolviment o (sob ao da gonadot ropi na I ),
onde quebr ada (pr ot elise) em pr ot enas
menor es const it uint es do vit elo (p. ex.: prot e na l i povi t el ni ca - LV)
>> sua INDUO (at i vao da expresso gni ca por E2 ou EE ) ACOMPANHADA pela
EXPRESSO (hepat ci t os ) de OUTROS COMPONENTES PROTICOS:
ER : RECEPTOR ESTROGNICO
> RECEPTOR NUCLEAR: PROTE NA ATI VADORA de t r anscr io
> liga-se ao "hor mnio" for mando E2-ER ou EE-ER
VEPs : pr ot enas do ENVELOPE VITELNICO
> 2 a 4 t ipos pr ot icos (47-129 kDa )
Desregulador
endcrino
Desativando
funes
enzimticas
(fenarimol)
Mimetizando
substncias
(fenvalerato)
Modulando a
ao
hormonal
(tamoxifeno)
Bloqueando
receptores
(EM-652,
DEHP)
Destruindo
receptores
(ICI 182.780 -
Fulvestran)
disjuntor??? DESREGULADOR
SUPERFAMLIA DE RECEPTORES INTRACELULARES (NUCLEARES)
SUPERFAMLIA DE RECEPTORES DE HORMNIOS ESTERIDES
P2 P3
P4
P5
P3
P2
especificidade qumica
LIGANTE // RECEPTOR
EFEITO ESTROGNICO
EM NVEL TECIDUAL

P1-o
EREs:
ELEMENTOS
(sequncias de DNA)
DE RESPOSTA
ESTROGNICA
ER-o ER-|
P1-|
ER: PROMSCUA
Sharpe and Skakkebaek (1993): SEA OF ESTROGENS

prostate cancer
obesity in children
declining sperm counts
and precocious puberty
BAIXA AFINIDADE
CONFORMACIONAL

BAIXA ATIVIDADE
(RESPOSTA)
BIOLGICA

FALTA DE EVIDNCIA
EPIDEMIOLGICA
CONSISTENTE PARA
INFERIR EFEITOS
CRNICOS (PATOLGICOS)
DE EXPOSIO A
BAIXOS TEORES

BAIXOS TEORES DE EXPOSIO
NO AMBIENTE

SINERGISMO

AUTO-REGULAO ENDCRINA
COMPLEXA NO ORGANISMO

SISTEMA REPRODUTOR
NEUROENDCRINO

CREBRO

HIPOTLAMO
GtRH (+) / DPM ()

Adeno-HIPFISE
GtH I & GtH II (+)
e outros (+/)

TESTCULO/OVRIO
ESxH e outros fatores
dimorfismo sexual
gametognese (Zn)
incorpora VTG (GtH I)

SISTEMA REPRODUTOR
NEUROENDCRINO:
Organizao Molecular

ORGANIZAO REALIZADA POR
ESTRUTURAS MOLECULARES
DIVERSAS:
NEURO-HORMNIOS
NEUROTRANSMISSORES
HORMNIOS CLSSICOS
RECEPTORES

SINALIZAO INTERCELULAR:
PARCRINA
SINPTICA
ENDCRINA
AUTCRINA

X
A C B
MTODOS PARA ESTUDOS
MOLECULARES
COM A VITELOGENINA DE PEIXES:


produtos biotecnolgicos
a servio da preservao
ambiental




VITELOGENINA de PEIXES (VTG)
>> GLICO-LIPO-FOSFO-PROTENA de ALTO PESO MOLECULAR (160-210 kDa ; mdi a apr ox.: 180 kDa )
>> expresso hept ica (HEPATCITOS ) INDUZVEL (ATIVAO da t ranscri o de RNAm)
em fmeas , machos e jovens i mat uros sob CONTROLE HORMONAL, por :
E2

: 17
|
-est radi ol (hor mnio nat ur al)
EE : hor mnios SINTTICOS ou SUBSTNCIAS EXGENAS
> EE2 : et i ni l -est radi ol com ao est rogni ca (XENOESTRGENOS )
> DEB : di et i l -est i l -best rol
>> INCORPARADA NOS OCITOS em desenvolviment o (sob ao da gonadot ropi na I ),
onde quebr ada (pr ot elise) em pr ot enas
menor es const it uint es do vit elo (p. ex.: prot e na l i povi t el ni ca - LV)
>> sua INDUO (at i vao da expresso gni ca por E2 ou EE ) ACOMPANHADA pela
EXPRESSO (hepat ci t os ) de OUTROS COMPONENTES PROTICOS:
ER : RECEPTOR ESTROGNICO
> RECEPTOR NUCLEAR: PROTE NA ATI VADORA de t r anscr io
> liga-se ao "hor mnio" for mando E2-ER ou EE-ER
VEPs : pr ot enas do ENVELOPE VITELNICO
> 2 a 4 t ipos pr ot icos (47-129 kDa )
FONTES de DNA para CLONAGEM de genes ou fragmentos de
genes (SEQNCIAS NUCLEOTDICAS)
FGADO
EXTRAO BIOQUMICA de RNA-total
EXTRAO BIOQUMICA de DNA-total
clivagem aleatria (endonuclease de restrio)
coleo heterognea de fragmentos de DNA
-AAAAAAA
anelamento com INICIADOR:
primer oligo(dT)
-AAAAAAA
-TTTTTTT
-TTTTTTT
TRANSCRIPTASE
REVERSA
NaOH
DNA
polimerase
TRANSCRIO REVERSA
DNA
complementar (
cDNA )
biblioteca GENMICA ou
BANCO de DNA genmico
biblioteca ou BANCO de cDNA
CLONAGEM do DNA
( DNA-total ou cDNA )

DNA exgeno BACTRIA ou LEVEDURA
+
VETOR DE CLONAGEM (PLASMDIO ou
FAGO)
=
CLONES de DNA recombinante (COLNIAS)
POSSVEIS ETAPAS para o estudo da EXPRESSO
de VITELOGENINA (VTG) e
DETECO-QUANTIFICAO em TECIDOS
: uma OU outra
: uma E outra ENTRADA +
: relao INTRA-ESPECFICA (Hm)
: relao INTERESPECFICA (outras espcies - spp = )
protenas (PTs) ou
aminocidos (aas) ou
seqncia de aas
DNA ou seqncia de DNA
RNA ou seqncia de RNA
DNA, RNA, PT, aas ou
SEQNCIAS spp = Hm
ISOLAMENTO ou PURIFICAO de
VTG de Hm (PLASMA ou CLULAS)
>> cromatografia de troca inica (purificao)
>> fracionamento por precipitao (isolamento)
ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
>> INCUBAO com anti-VTG
>> INCUBAO com ANTI-2
rio
-CONJUGADO
>> COLORIMETRIA (padres : VTG purificada)
>> VALIDAO (bioensaios)
IMMUNOBLOTS : WESTERN ou DOT BLOTS
>> VTG em SDS-PAGE ou direto no NYLON
>> INCUBAO com anti-VTG ou anti-VTG
>> INCUBAO com ANTI-2
rio
-CONJUGADO
>> DENSITOMETRIA (padres : VTG purificada)
RECORTAR, do SDS-PAGE, a BANDA com VTG
PRODUO DE anti-
VTG: IMUNZ. em spp =
+
INDUO de VTG de Hm
no FGADO por IIP de
17|-ESTRADIOL (E
2
)
anti-VTG de spp = REAO CRUZADA
RT ( transcriptase reversa )
TRANSCRIO REVERSA
mRNAs >>> cDNAs
EXTRAO de RNA-total do FGADO
NORTHERN BLOT
HIBRIDIZAO: cDNA-VTG ou SHt
>> RNA em GEL de AGAROSE
>> DENSITOMETRIA (padres de
RNA)
+
EXPRESSO in vitro do DNA-VTG de Hm
>> VETORES de EXPRESSO (gene de VTG)
>> produo de VTG (ou VTG-aas) em host cell
PCR ( DNA polimerase )
>> amplificao e isolamento
de cDNA ou OUTRO
>> com PRIMERS para VTG
construir SONDA MARCADA
cDNA-VTG
+
CONSTRUO/OBTENO de
PRIMERS
oligonucleotdeos sintticos degenerados
>> para sequncias conservadas de aas
do dom. carboxi-terminal (3) da VTG
(4-5 sequncias conhecidas de 4-5 spp = )
>> ALEATRIOS
SONDA HETERLOGA MARCADA (SHt

)
HIBRIDIZAO com ESTRINGNCIA
>> RNA ou DNA ou cDNA ou
>> oligonucleotdeos sintticos degenerados
relacionados seqncia(s) de DNA do GENE
que codifica a VTG em spp = de peixes
EXTRAO de DNA-total do FGADO
>> clivagem aleatria (endonuclease de
restrio)
>> coleo heterognea de fragmentos de DNA
ISOLAMENTO do DNA-VTG
HIBRIDIZAO: cDNA-VTG ou SHt
>> SOUTHERN BLOT de GEL de AGAROSE
>> seleo de colnia com clones de DNA-VTG
+
+
CLONAGEM do DNA de Hm
( DNA-total ou cDNA-VTG )

DNA de Hm (EXGENO bactria ou
levedura)
+
VETOR DE CLONAGEM (plasmdio ou fago)
=
CLONES de DNA recombinante (COLNIAS)




cDNA-VTG de Sparus
aurata
mRNA-VTG
de Sparus aurata
Northern Blot:
autoradiografia (
32
P)
5 dias aps IIP :
5 mg E
2
. Kg
-1

SDS-PAGE (7%)
Comassie Blue
3 10 30 M
VTG
3 3 10 10 30 30 M
VTG
ELISA
VTG de Sparus aurata
IOD
TRUTA
mRNA-VTG
Northern Blot:
autoradiografia (
32
P)
[VTG]% (IOD) VTG
TRUTA
[VTG]% (IOD)
mRNA-VTG Northern Blot:
sonda fluorescente
Salvelinus alpinus
IIP : 10 mg E
2
. Kg
-
1

VTG
Western Blot: anti(2)-enzima
SILVERSAND, C.; HYLLNER, S. J. & HAUX, C. Isolation,
immunochemical detection, and observations of the instability of
vitellogenin from four teleosts. The Journal of Experimental Zoology,
v.267, p.587-597. 1993.

6HB-E
2
494,3 g
15 dias
linha 1: 200 nl dos animais 3 e 6 (pool de plasma), MACHOS jovens E
2
(-)
linha 2: 200 nl do animal 4, FMEA jovem E
2
(-)
linha 3: 50 nl do animal 11, sexo indefinido, iip E
2
(+)
linha 4: 200 nl do animal 11, sexo indefinido, iip E
2
(+)
linhas 5 a 8: 50 nl de VTG redissolvida em NaCl 1 M, aps PRECIPITAO (2x), com EDTA/MgCl
2
e H
2
O
linha 5: [EDTA] : [Mg
++
] = 1,0 : 2,5
linha 6: [EDTA] : [Mg
++
] = 1,0 : 2,0
linha 7: [EDTA] : [Mg
++
] = 1,0 : 1,5
linha 8: [EDTA] : [Mg
++
] = 1,0 : 1,0
animal 11, iip E
2
(+) :
1 2 3 4 5 6 7 8
MWM
205 kDa
116 kDa
97,4 kDa
66 kDa
45 kDa
29 kDa
linha 1: 200 nl dos animais 3 e 6 (pool de plasma), MACHOS jovens E
2
(-)
linha 2: 200 nl do animal 4, FMEA jovem E
2
(-)
linha 3: 50 nl do animal 11, sexo indefinido, iip E
2
(+)
linha 4: 200 nl do animal 11, sexo indefinido, iip E
2
(+)
linhas 5 a 8: 50 nl de VTG redissolvida em NaCl 1 M, aps PRECIPITAO (2x), com EDTA/MgCl
2
e H
2
O
linha 5: [EDTA] : [Mg
++
] = 1,0 : 2,5
linha 6: [EDTA] : [Mg
++
] = 1,0 : 2,0
linha 7: [EDTA] : [Mg
++
] = 1,0 : 1,5
linha 8: [EDTA] : [Mg
++
] = 1,0 : 1,0
animal 11, iip E
2
(+) :
1 2 3 4 5 6 7 8
MWM
205 kDa
116 kDa
97,4 kDa
66 kDa
45 kDa
29 kDa
SANGUE >>> PLASMA
PMSF a 1 mM; etanol a 0,5%
fora = 3000g por 30 min., 4
o
C
[EDTA

] [Mg
++
] = 1,0 2,5
[EDTA

] [Mg
++
] = 1,0 2,0
[EDTA

] [Mg
++
] = 1,0 1,5
[EDTA

] [Mg
++
] = 1,0 1,0
GRAU
PISTILO
-200
o
C
0,5 mg 30 dias 0,5 mg 15 dias BLEED 15 dias 0,25 mg 15 dias BLEED 15 dias 0,25 mg 15 dias BLEED
ANTI-SORO HOMLOGO:
contra VTG de Hoplias (HOPL)
ANTI-SOROS DA BIOSENSE

contra VTG de:

Salmo salar (SALA)
Salvelinus alpinus (SALP)
Sparus aurata (SPAU)

2 3 4 5 6 7 8 1 9 10
250 kDa
150 kDa
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
2 3 4 5 6 7 8 1 9 10 2 3 4 5 6 7 8 1 9 10
250 kDa 250 kDa
150 kDa 150 kDa
100 kDa 100 kDa
75 kDa 75 kDa
50 kDa 50 kDa
37 kDa 37 kDa
NC
Y
Y
+
A + B
2 3 4 5 6 7 8 1 9 10
250 kDa
150 kDa
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
2 3 4 5 6 7 8 1 9 10
250 kDa 250 kDa
150 kDa 150 kDa
100 kDa 100 kDa
75 kDa 75 kDa
50 kDa 50 kDa
37 kDa 37 kDa
25 kDa 25 kDa
TTBS com 5% de LEITE

anti-soro SAPAU
1:3000
40 s de reao
salina tamponada com Tris
pH 7,5 (TBS) contendo:

0,1% (v/v)
de Tween 20
(TTBS)

com oscilao orbital,
por 16 horas e a 810
o
C.
miosina: 207 kDa
|-galactosidase: 117 kDa
albumina de soro bovino: 95 kDa
ovalbumina: 45 kDa
miosina: 207 kDa miosina: 207 kDa
|-galactosidase: 117 kDa |-galactosidase: 117 kDa
albumina de soro bovino: 95 kDa albumina de soro bovino: 95 kDa
ovalbumina: 45 kDa ovalbumina: 45 kDa
2 3 4 5 6 7 8 1 9 10
250 kDa
150 kDa
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
2 3 4 5 6 7 8 1 9 10
250 kDa 250 kDa
150 kDa 150 kDa
100 kDa 100 kDa
75 kDa 75 kDa
50 kDa 50 kDa
37 kDa 37 kDa
25 kDa 25 kDa
TTBS SEM o LEITE do BLOQUEIO
anti-soro SALP 1:3000; 20 s de reao
salina tamponada com Tris
pH 7,5 (TBS) contendo 0,1% (v/v)
de Tween 20 (TTBS) e 5% de leite
(m/v), com oscilao orbital,
por 2 horas e a temp. ambiente.
250 kDa
150 kDa
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
2 3 4 5 250 kDa
150 kDa
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
2 3 4 5 250 kDa 250 kDa
150 kDa 150 kDa
100 kDa 100 kDa
75 kDa 75 kDa
50 kDa 50 kDa
37 kDa 37 kDa
25 kDa 25 kDa
2 3 4 5
250 kDa
150 kDa
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
2 3 4 5 250 kDa 250 kDa
150 kDa 150 kDa
100 kDa 100 kDa
75 kDa 75 kDa
50 kDa 50 kDa
37 kDa 37 kDa
25 kDa 25 kDa
2 3 4 5
250 kDa
150 kDa
100 kDa
75 kDa
50 kDa
2 3 4 5 6 7 8 1 9 10
37 kDa
25 kDa
250 kDa 250 kDa
150 kDa 150 kDa
100 kDa 100 kDa
75 kDa 75 kDa
50 kDa 50 kDa
2 3 4 5 6 7 8 1 9 10 2 3 4 5 6 7 8 1 9 10
37 kDa 37 kDa
25 kDa 25 kDa
anti-soro HOPL
1:3000
20 s de reao
anti-soro SALA
1:3000
15 min. de reao
anti-soro HOPL
1:3000
20 s de reao
250 kDa
150 kDa
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
2 3 4 5 6 7
8
1 9 10
250 kDa 250 kDa
150 kDa 150 kDa
100 kDa 100 kDa
75 kDa 75 kDa
50 kDa 50 kDa
37 kDa 37 kDa
25 kDa 25 kDa
2 3 4 5 6 7
8
1 9 10
anti-soro SALP
1:3000
15 min. de reao
ln N
m
[ ( n
m
n
i
) + 1 ]
ln N
i
[( n
i
n
i
) + ( n
i
N
i
)] ( RGS
i
RGS
e
)
IAR = 100
ln N
m
[ ( n
m
n
i
) + 1 ]
ln N
i
[( n
i
n
i
) + ( n
i
N
i
)] ( RGS
i
RGS
e
)
IAR = 100
AGOSTINHO, A. A.; SUZUKI, H. I.; SAMPAIO, A. A.; BORGES, J. D. R.
ndice de atividade reprodutiva: uma proposta para avaliao da
atividade reprodutiva em peixes. In: Encontro Brasileiro de Ictiologia, 9.,
1991. Resumos. Maring : UEM. p.53. 1991.
N
i
: nmero de indivduos na unidade amostral considerada
(um valor por rea amostrada);
n
i
: nmeros de indivduos em reproduo nas unidades amostrais consideradas
(um valor por rea amostrada);
N
m
: nmero de indivduos da maior unidade amostral;
n
m
: nmero de indivduos em reproduo na maior unidade amostral;
RGS = (massa das gnadas 100) massa total do animal;
RGS
i
: RGS mdia dos indivduos em reproduo na unidade amostral i ;
RGS
e
: maior valor individual de RGS.
CPUE = m
2
REDE TEMPO
-1
n
m
N
m
=
ln N
max
[ ( n
max
n ) + 1 ]
ln N [( n n ) + ( n N )] ( VTG VTG
max
)
I
VTG
= 100
ln N
max
[ ( n
max
n ) + 1 ]
ln N [( n n ) + ( n N )] ( VTG VTG
max
)
I
VTG
= 100
para Populaes Naturais
[( n n ) + ( n N )]
I
VTGe
= 100
[ ( N
E2
n ) + 1 ]
VTG
VTG
max
[( n n ) + ( n N )]
I
VTGe
= 100
[ ( N
E2
n ) + 1 ]
VTG
VTG
max
para BIOENSAIOS

I
VTGh
= 100
[( N
E2
n ) + 1]
[( n n ) + 1] (VTG VTG
C
)
VTG
max
ln n
ln N
E2
I
VTGh
= 100
[( N
E2
n ) + 1]
[( n n ) + 1] (VTG VTG
C
)
VTG
max
ln n
ln N
E2
ln n
ln N
E2
para ENSAIOS in vitro de
ESTROGENICIDADE
ln N
f
I
VTGf
= 100
[ ( n
f
n ) + ( n
f
N
f
) ]
[( n n ) + ( n N )] ln N VTG
VTG
max
ln N
f
I
VTGf
= 100
[ ( n
f
n ) + ( n
f
N
f
) ]
[( n n ) + ( n N )] ln N VTG
VTG
max
para para a Vitelognese, com
Fmeas como Controle Referencial
demonstra a
PRODUO MOLECULAR
de VTG ( expresso )
em populaes (ou grupos),
relacionando-a com a:

quantidade de indivduos
VTG[+] ( n )


MAGNITUDE AMOSTRAL
( N e N
max
)
dos grupos:
ANALISADO
e de
REFERNCIA
(denominador)


TRATAMENTO ctrl EE
NMERO DE CLULAS POR POO DE MICROPLACA N 129.471 145.807 92.357 106.128 ENTRA VALOR
CLULAS VTG (+) POR POO DE MICROPLACA n 129.471 145.807 92.357 106.128
CONCENTRAO RELATIVA (i nte nsi dade ) de VTG VTG 3.320.517 4.839.472 3.434.054 1.856.669 ENTRA VALOR
maior valor individual de VTG VTGmax 4.839.472 4.839.472 4.839.472 4.839.472
int ensidade de VTG no grupo CONTROLE VTGC 3.320.517 3.320.517 3.320.517 3.320.517
ESTROGENICIDADE no grupo = VTG - VTG
C
/ VTG
max 0,000000 0,313868 0,023461 -0,302481
NMERO DE CLULAS no gr upo controle i nduzi do ( EE
2
) N
E2 145.807 145.807 145.807 145.807
NMERO DE CLULAS VTG (+) no gr upo EE
2
n
E2 145.807 145.807 145.807 145.807
somat r io de n (Sn) 473764 473764 473764 473764
l n N 11,77 11,89 11,43 11,57
n / Sn 0,27 0,31 0,19 0,22
n / N 1,00 1,00 1,00 1,00
(n / Sn)+(n / N) 1,27 1,31 1,19 1,22
VTG - VTG
C
/ VTG
max 0,00 0,31 0,02 -0,30
nume rador 0,00 4,88 0,32 -4,28
l n N
E2 11,89 11,89 11,89 11,89
(N
E2
/ Sn)+1 1,31 1,31 1,31 1,31
de nomi nador 15,55 15,55 15,55 15,55
I
VTGh
= 0,00 31,39 2,06 -27,55

I
VTGh
= 100
[( N
E2
n ) + 1]
[( n n ) + 1] (VTG VTG
C
)
VTG
max
ln n
ln N
E2
I
VTGh
= 100
[( N
E2
n ) + 1]
[( n n ) + 1] (VTG VTG
C
)
VTG
max
ln n
ln N
E2
ln n
ln N
E2
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40

n
d
i
c
e

V
i
t
e
l
o
g

n
i
c
o
CTRL
EE
2
EE
2
+ TMX
TMX
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40

n
d
i
c
e

V
i
t
e
l
o
g

n
i
c
o
CTRL
EE
2
EE
2
+ TMX
TMX
n : nmero mdio de clulas viveis por unidade de cultivo
(poo de microplaca, lamnula ou garrafa)
no tratamento considerado;
N
E2
: nmero mdio de clulas viveis por unidade de cultivo
no grupo induzido (E2[+]);
VTG : concentrao ou quantidade de VTG aferida
nas unidades de cultivo do tratamento considerado;
VTG
C
: VTG aferida nas unidades de cultivo do grupo controle,
sem nenhum tratamento;
VTG
max
: maior valor individual de VTG