resposta hormonal ao estresse

vitelogenina como biomarcador



VITELOGENINA (VTG)

glico-fosfo-lipoproteína de alto massa molecular (de 170-200 kDa)

produzida em HEPATÓCITOS sob controle multi-hormonal: a transcrição do
RNA
m
é ativada por estrógenos - 17|-estradiol ( E
2
)

principal constituinte do VITELO, é liberada no sangue (exocitose)

relacionada a outros biomarcadores e ao
SISTEMA NEUROENDÓCRINO REPRODUTOR
de peixes

XENOESTRÓGENOS: substâncias que são desreguladoras endócrinas
a expressão da VTG por hepatócitos,
ou a supressão da mesma, têm sido usadas em peixes
como indicadores de efeitos (ANTI)ESTROGÊNICOS:
estrogênicos em machos e jovens
anti-estrogênicos em fêmeas.

seqüência aa da VTG: é bem conservada entre distintas TAXA no tempo evolutivo

VTG de TELEOSTEI: National Center for Biotechnology Information
BioEdit v.5.0.9 e ClustalW
alinhadas em consenso:
56,8% de similaridade, duas a duas
número médio de 1713 aa (DP = 50 aa)
187,95 kDa (DP = 5,15 kDa).
BioEdit v.5.0.9 e ClustalW

BioEdit v.5.0.9 e ClustalW

BIOMARCADORES

RESPOSTA BIOLÓGICA de um organismo ( INDIVIDUAL ) que
ocorre da EXPOSIÇÃO do mesmo a um XENOBIÓTICO

ALTERAÇÕES FISIOLÓGICAS ou MORFOLÓGICAS
em VIAS METABÓLICAS,
CÉLULAS, TECIDOS ou
SISTEMAS INTEGRADOS do organismo

PROCESSO ALTERADO: é uma RELAÇÃO (causa-efeito) de
componentes de um sistema biológico entre si e entre
os componentes daquilo que não é o sistema biológico em
questão.

DETECTÁVEL ou MENSURÁVEL por métodos
bioquímicos, fisiológicos, histológicos ou morfológicos (imagem)
SISTEMA HEPÁTICO
(HEPATÓCITO)

Expressão de METALOTIONEÍNA
indut.: metais, EsROx e ESxH
tolerância a EsROx, p.ex.:H
2
O
2

atividade antioxidante


HOMEOSTASE OXIDATIVA
tolerância a EsROx
atividade antioxidante:
SOD, CATALASES,
peroxidases, GSHp
GSH S-t, GSHr
[GSH]


Expressão de P450
uso de EsROx em oxidações
l catabolismo (MFOS):
oxidação de esteróides
l ativ. monoxigenases associadas
p.ex.: EROD


Expressão de VITELOGENINA
regulada por 17|-Estradiol

xenobionte com:
ativ. estrogênica
(machos e jovens)
ativ. anti-estrogênica
(fêmeas)

HOMEOSTASE DE Zn
&
ATIVIDADE DE METALOENZIMAS
SISTEMA REPRODUTOR
NEUROENDÓCRINO

CÉREBRO
¹
HIPOTÁLAMO
GtRH (+) / DPM (–)

HIPÓFISE
GtH I & GtH II (+)
e outros (+/–)

TESTÍCULO/OVÁRIO
ESxH e outros fatores
dimorfismo sexual
gametogênese (Zn)
incorpora VT (GtH I)

o-ALAd

inibição :
ANEMIA
PORFIRIA

l [ pre-HEME ]
¹ [ HEME ]
l [ o-ALA ]

ESTRESSE
OXIDATIVO
POUCA
RELEVÂNCIA
ECOLÓGICA
GRANDE
RELEVÂNCIA
ECOLÓGICA
RESPOSTA A
LONGO PRAZO
RESPOSTA A
CURTO PRAZO
parâmetros
bioquímicos
enzimas de
desintoxicação
parâmetros
imunológicos

parâmetros
histopatológicos

condições
bioenergéticas
populações &
comunidades
capacidade
reprodutiva
parâmetros
fisiológicos
ADAMS et alii
1989
OBJETIVOS

extenção
ou
extrapolação




ensaios
prévios
spp BR

métodos
fáceis e
baratos

MOLÉCULA CÉLU
LA
TECIDO ÓRGÃO SISTEMA ORGA
NISMO
POPULAÇÃO COMUNIDADE ECOSSISTEMA
VITELOGENINA de PEIXES (VTG)
>> GLICO-LIPO-FOSFO-PROTEÍNA de ALTO PESO MOLECULAR (160-210 kDa ; médi a apr ox.: 180 kDa )
>> expressão hepát ica (HEPATÓCITOS ) INDUZÍVEL (ATIVAÇÃO da t ranscri ção de RNAm)
em fêmeas , machos e jovens i mat uros sob CONTROLE HORMONAL, por :
E2

: 17
|
-est radi ol (hor mônio nat ur al)
EE : hor mônios SINTÉTICOS ou SUBSTÂNCIAS EXÓGENAS
> EE2 : et i ni l -est radi ol com ação est rogêni ca (XENOESTRÓGENOS )
> DEB : di et i l -est i l -best rol
>> INCORPARADA NOS OÓCITOS em desenvolviment o (sob ação da gonadot ropi na I ),
onde é quebr ada (pr ot eólise) em pr ot eínas
menor es const it uint es do vit elo (p. ex.: prot eí na l i povi t el í ni ca - LV)
>> sua INDUÇÃO (at i vação da expressão gêni ca por E2 ou EE ) é ACOMPANHADA pela
EXPRESSÃO (hepat óci t os ) de OUTROS COMPONENTES PROTÉICOS:
ER : RECEPTOR ESTROGÊNICO
> RECEPTOR NUCLEAR: PROTEÍ NA ATI VADORA de t r anscr ição
> liga-se ao "hor mônio" for mando E2-ER ou EE-ER
VEPs : pr ot eínas do ENVELOPE VITELÍNICO
> 2 a 4 t ipos pr ot éicos (47-129 kDa )
Desregulador
endócrino
Desativando
funções
enzimáticas
(fenarimol)
Mimetizando
substâncias
(fenvalerato)
Modulando a
ação
hormonal
(tamoxifeno)
Bloqueando
receptores
(EM-652,
DEHP)
Destruindo
receptores
(ICI 182.780 -
Fulvestran)
disjuntor??? DESREGULADOR
SUPERFAMÍLIA DE RECEPTORES INTRACELULARES (NUCLEARES)
SUPERFAMÍLIA DE RECEPTORES DE HORMÔNIOS ESTERÓIDES
P2 P3
P4
P5
P3
P2
especificidade química
LIGANTE // RECEPTOR
EFEITO ESTROGÊNICO
EM NÍVEL TECIDUAL

P1-o
ERE’s:
ELEMENTOS
(sequências de DNA)
DE RESPOSTA
ESTROGÊNICA
ER-o ER-|
P1-|
ER: “PROMÍSCUA”
Sharpe and Skakkebaek (1993): “SEA OF ESTROGENS”

prostate cancer
obesity in children
declining sperm counts
and precocious puberty
BAIXA AFINIDADE
CONFORMACIONAL

BAIXA ATIVIDADE
(RESPOSTA)
BIOLÓGICA

FALTA DE EVIDÊNCIA
EPIDEMIOLÓGICA
CONSISTENTE PARA
INFERIR EFEITOS
CRÔNICOS (PATOLÓGICOS)
DE EXPOSIÇÃO A
BAIXOS TEORES

BAIXOS TEORES DE EXPOSIÇÃO
NO AMBIENTE

SINERGISMO

AUTO-”REGULAÇÃO” ENDÓCRINA
COMPLEXA NO ORGANISMO

SISTEMA REPRODUTOR
NEUROENDÓCRINO

CÉREBRO
¹ ¹
HIPOTÁLAMO
GtRH (+) / DPM (–)

Adeno-HIPÓFISE
GtH I & GtH II (+)
e outros (+/–)

TESTÍCULO/OVÁRIO
ESxH e outros fatores
dimorfismo sexual
gametogênese (Zn)
incorpora VTG (GtH I)

SISTEMA REPRODUTOR
NEUROENDÓCRINO:
Organização Molecular

ORGANIZAÇÃO REALIZADA POR
ESTRUTURAS MOLECULARES
DIVERSAS:
NEURO-HORMÔNIOS
NEUROTRANSMISSORES
HORMÔNIOS CLÁSSICOS
RECEPTORES

SINALIZAÇÃO INTERCELULAR:
PARÁCRINA
SINÁPTICA
ENDÓCRINA
AUTÓCRINA

X
A C B
MÉTODOS PARA ESTUDOS
MOLECULARES
COM A VITELOGENINA DE PEIXES:


produtos biotecnológicos
a “serviço” da preservação
ambiental




VITELOGENINA de PEIXES (VTG)
>> GLICO-LIPO-FOSFO-PROTEÍNA de ALTO PESO MOLECULAR (160-210 kDa ; médi a apr ox.: 180 kDa )
>> expressão hepát ica (HEPATÓCITOS ) INDUZÍVEL (ATIVAÇÃO da t ranscri ção de RNAm)
em fêmeas , machos e jovens i mat uros sob CONTROLE HORMONAL, por :
E2

: 17
|
-est radi ol (hor mônio nat ur al)
EE : hor mônios SINTÉTICOS ou SUBSTÂNCIAS EXÓGENAS
> EE2 : et i ni l -est radi ol com ação est rogêni ca (XENOESTRÓGENOS )
> DEB : di et i l -est i l -best rol
>> INCORPARADA NOS OÓCITOS em desenvolviment o (sob ação da gonadot ropi na I ),
onde é quebr ada (pr ot eólise) em pr ot eínas
menor es const it uint es do vit elo (p. ex.: prot eí na l i povi t el í ni ca - LV)
>> sua INDUÇÃO (at i vação da expressão gêni ca por E2 ou EE ) é ACOMPANHADA pela
EXPRESSÃO (hepat óci t os ) de OUTROS COMPONENTES PROTÉICOS:
ER : RECEPTOR ESTROGÊNICO
> RECEPTOR NUCLEAR: PROTEÍ NA ATI VADORA de t r anscr ição
> liga-se ao "hor mônio" for mando E2-ER ou EE-ER
VEPs : pr ot eínas do ENVELOPE VITELÍNICO
> 2 a 4 t ipos pr ot éicos (47-129 kDa )
FONTES de DNA para CLONAGEM de genes ou “fragmentos” de
genes (SEQÜÊNCIAS NUCLEOTÍDICAS)
FÍGADO
EXTRAÇÃO BIOQUÍMICA de RNA-total
EXTRAÇÃO BIOQUÍMICA de DNA-total
 clivagem aleatória (endonuclease de restrição)
 coleção heterogênea de fragmentos de DNA
-AAAAAAA
anelamento com INICIADOR:
primer oligo(dT)
-AAAAAAA
-TTTTTTT
-TTTTTTT
TRANSCRIPTASE
REVERSA
NaOH
DNA
polimerase
TRANSCRIÇÃO REVERSA
DNA
complementar (
cDNA )
 “biblioteca” GENÔMICA ou
BANCO de DNA genômico
 “biblioteca” ou BANCO de cDNA
CLONAGEM do DNA
( DNA-total ou cDNA )

DNA exógeno à BACTÉRIA ou LEVEDURA
+
VETOR DE CLONAGEM (PLASMÍDIO ou
FAGO)
=
CLONES de DNA recombinante (COLÔNIAS)
POSSÍVEIS ETAPAS para o estudo da EXPRESSÃO
de VITELOGENINA (VTG) e
DETECÇÃO-QUANTIFICAÇÃO em TECIDOS
: uma OU outra
: uma E outra ENTRADA +
: relação INTRA-ESPECÍFICA (Hm)
: relação INTERESPECÍFICA (outras espécies - spp = )
proteínas (PTs) ou
aminoácidos (aa’s) ou
seqüência de aa’s
DNA ou seqüência de DNA
RNA ou seqüência de RNA
DNA, RNA, PT, aa’s ou
SEQÜÊNCIAS spp = Hm
ISOLAMENTO ou PURIFICAÇÃO de
VTG de Hm (PLASMA ou CÉLULAS)
>> cromatografia de troca iônica (purificação)
>> fracionamento por precipitação (isolamento)
ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
>> INCUBAÇÃO com anti-VTG
>> INCUBAÇÃO com ANTI-2
ário
-CONJUGADO
>> COLORIMETRIA (padrões : VTG purificada)
>> VALIDAÇÃO (bioensaios)
IMMUNOBLOTS : WESTERN ou DOT BLOTS
>> VTG em SDS-PAGE ou direto no NYLON
>> INCUBAÇÃO com anti-VTG ou anti-VTG
>> INCUBAÇÃO com ANTI-2
ário
-CONJUGADO
>> DENSITOMETRIA (padrões : VTG purificada)
RECORTAR, do SDS-PAGE, a BANDA com VTG
PRODUÇÃO DE anti-
VTG: IMUNZ. em spp =
+
INDUÇÃO de VTG de Hm
no FÍGADO por IIP de
17|-ESTRADIOL (E
2
)
anti-VTG de spp = REAÇÃO CRUZADA
RT ( transcriptase reversa )
TRANSCRIÇÃO REVERSA
mRNA’s >>> cDNA’s
EXTRAÇÃO de RNA-total do FÍGADO
NORTHERN BLOT
HIBRIDIZAÇÃO: cDNA-VTG ou SHt
>> RNA em GEL de AGAROSE
>> DENSITOMETRIA (padrões de
RNA)
+
EXPRESSÃO in vitro do DNA-VTG de Hm
>> VETORES de EXPRESSÃO (“gene” de VTG)
>> produção de VTG (ou VTG-aa’s) em host cell
PCR ( DNA polimerase )
>> amplificação e isolamento
de cDNA ou OUTRO
>> com PRIMERS para VTG
construir SONDA MARCADA
cDNA-VTG
+
CONSTRUÇÃO/OBTENÇÃO de
PRIMERS
oligonucleotídeos sintéticos degenerados
>> para sequências conservadas de aa’s
do dom. carboxi-terminal (3’) da VTG
(4-5 sequências conhecidas de 4-5 spp = )
>> ALEATÓRIOS
SONDA HETERÓLOGA MARCADA (SHt

)
HIBRIDIZAÇÃO com ESTRINGÊNCIA ¹
>> RNA ou DNA ou cDNA ou
>> oligonucleotídeos sintéticos degenerados
relacionados à seqüência(s) de DNA do GENE
que codifica a VTG em spp = de peixes
EXTRAÇÃO de DNA-total do FÍGADO
>> clivagem aleatória (endonuclease de
restrição)
>> coleção heterogênea de fragmentos de DNA
“ISOLAMENTO” do DNA-VTG
HIBRIDIZAÇÃO: cDNA-VTG ou SHt
>> SOUTHERN BLOT de GEL de AGAROSE
>> seleção de colônia com clones de DNA-VTG
+
+
CLONAGEM do DNA de Hm
( DNA-total ou cDNA-VTG )

DNA de Hm (EXÓGENO à bactéria ou
levedura)
+
VETOR DE CLONAGEM (plasmídio ou fago)
=
CLONES de DNA recombinante (COLÔNIAS)




cDNA-VTG de Sparus
aurata
mRNA-VTG
de Sparus aurata
Northern Blot:
autoradiografia (
32
P)
5 dias após IIP :
5 mg E
2
. Kg
-1

SDS-PAGE (7%)
Comassie Blue
3 10 30 M
VTG
3 3 10 10 30 30 M
VTG
ELISA
VTG de Sparus aurata
IOD
TRUTA
mRNA-VTG
Northern Blot:
autoradiografia (
32
P)
[VTG]% (IOD) VTG
TRUTA
[VTG]% (IOD)
mRNA-VTG Northern Blot:
sonda fluorescente
Salvelinus alpinus
IIP : 10 mg E
2
. Kg
-
1

VTG
Western Blot: anti(2)-enzima
SILVERSAND, C.; HYLLNER, S. J. & HAUX, C. Isolation,
immunochemical detection, and observations of the instability of
vitellogenin from four teleosts. The Journal of Experimental Zoology,
v.267, p.587-597. 1993.

6HB-E
2
494,3 g
15 dias
linha 1: 200 nl dos animais 3 e 6 (pool de plasma), MACHOS jovens E
2
(-)
linha 2: 200 nl do animal 4, FÊMEA jovem E
2
(-)
linha 3: 50 nl do animal 11, sexo indefinido, iip E
2
(+)
linha 4: 200 nl do animal 11, sexo indefinido, iip E
2
(+)
linhas 5 a 8: 50 nl de VTG redissolvida em NaCl 1 M, após PRECIPITAÇÃO (2x), com EDTA/MgCl
2
e H
2
O
linha 5: [EDTA] : [Mg
++
] = 1,0 : 2,5
linha 6: [EDTA] : [Mg
++
] = 1,0 : 2,0
linha 7: [EDTA] : [Mg
++
] = 1,0 : 1,5
linha 8: [EDTA] : [Mg
++
] = 1,0 : 1,0
 animal 11, iip E
2
(+) :
1 2 3 4 5 6 7 8
MWM
205 kDa
116 kDa
97,4 kDa
66 kDa
45 kDa
29 kDa
linha 1: 200 nl dos animais 3 e 6 (pool de plasma), MACHOS jovens E
2
(-)
linha 2: 200 nl do animal 4, FÊMEA jovem E
2
(-)
linha 3: 50 nl do animal 11, sexo indefinido, iip E
2
(+)
linha 4: 200 nl do animal 11, sexo indefinido, iip E
2
(+)
linhas 5 a 8: 50 nl de VTG redissolvida em NaCl 1 M, após PRECIPITAÇÃO (2x), com EDTA/MgCl
2
e H
2
O
linha 5: [EDTA] : [Mg
++
] = 1,0 : 2,5
linha 6: [EDTA] : [Mg
++
] = 1,0 : 2,0
linha 7: [EDTA] : [Mg
++
] = 1,0 : 1,5
linha 8: [EDTA] : [Mg
++
] = 1,0 : 1,0
 animal 11, iip E
2
(+) :
1 2 3 4 5 6 7 8
MWM
205 kDa
116 kDa
97,4 kDa
66 kDa
45 kDa
29 kDa
SANGUE >>> PLASMA
PMSF a 1 mM; etanol a 0,5%
força = 3000×g por 30 min., 4
o
C
[EDTA
÷
] ÷ [Mg
++
] = 1,0 ÷ 2,5
[EDTA
÷
] ÷ [Mg
++
] = 1,0 ÷ 2,0
[EDTA
÷
] ÷ [Mg
++
] = 1,0 ÷ 1,5
[EDTA
÷
] ÷ [Mg
++
] = 1,0 ÷ 1,0
GRAU
PISTILO
-200
o
C
0,5 mg 30 dias 0,5 mg 15 dias BLEED 15 dias 0,25 mg 15 dias BLEED 15 dias 0,25 mg 15 dias BLEED
ANTI-SORO HOMÓLOGO:
contra VTG de Hoplias (HOPL)
ANTI-SOROS DA BIOSENSE
®

contra VTG de:

Salmo salar (SALA)
Salvelinus alpinus (SALP)
Sparus aurata (SPAU)

2 3 4 5 6 7 8 1 9 10
250 kDa
150 kDa
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
2 3 4 5 6 7 8 1 9 10 2 3 4 5 6 7 8 1 9 10
250 kDa 250 kDa
150 kDa 150 kDa
100 kDa 100 kDa
75 kDa 75 kDa
50 kDa 50 kDa
37 kDa 37 kDa
NC
Y
Y
+
A + B
2 3 4 5 6 7 8 1 9 10
250 kDa
150 kDa
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
2 3 4 5 6 7 8 1 9 10
250 kDa 250 kDa
150 kDa 150 kDa
100 kDa 100 kDa
75 kDa 75 kDa
50 kDa 50 kDa
37 kDa 37 kDa
25 kDa 25 kDa
TTBS com 5% de LEITE

anti-soro SAPAU
1:3000
40 s de reação
salina tamponada com Tris
pH 7,5 (TBS) contendo:

0,1% (v/v)
de Tween 20
(TTBS)

com oscilação orbital,
por 16 horas e a 8–10
o
C.
miosina: 207 kDa
|-galactosidase: 117 kDa
albumina de soro bovino: 95 kDa
ovalbumina: 45 kDa
miosina: 207 kDa miosina: 207 kDa
|-galactosidase: 117 kDa |-galactosidase: 117 kDa
albumina de soro bovino: 95 kDa albumina de soro bovino: 95 kDa
ovalbumina: 45 kDa ovalbumina: 45 kDa
2 3 4 5 6 7 8 1 9 10
250 kDa
150 kDa
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
2 3 4 5 6 7 8 1 9 10
250 kDa 250 kDa
150 kDa 150 kDa
100 kDa 100 kDa
75 kDa 75 kDa
50 kDa 50 kDa
37 kDa 37 kDa
25 kDa 25 kDa
TTBS SEM o LEITE do BLOQUEIO
anti-soro SALP 1:3000; 20 s de reação
salina tamponada com Tris
pH 7,5 (TBS) contendo 0,1% (v/v)
de Tween 20 (TTBS) e 5% de leite
(m/v), com oscilação orbital,
por 2 horas e a temp. ambiente.
250 kDa
150 kDa
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
2 3 4 5 250 kDa
150 kDa
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
2 3 4 5 250 kDa 250 kDa
150 kDa 150 kDa
100 kDa 100 kDa
75 kDa 75 kDa
50 kDa 50 kDa
37 kDa 37 kDa
25 kDa 25 kDa
2 3 4 5
250 kDa
150 kDa
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
2 3 4 5 250 kDa 250 kDa
150 kDa 150 kDa
100 kDa 100 kDa
75 kDa 75 kDa
50 kDa 50 kDa
37 kDa 37 kDa
25 kDa 25 kDa
2 3 4 5
250 kDa
150 kDa
100 kDa
75 kDa
50 kDa
2 3 4 5 6 7 8 1 9 10
37 kDa
25 kDa
250 kDa 250 kDa
150 kDa 150 kDa
100 kDa 100 kDa
75 kDa 75 kDa
50 kDa 50 kDa
2 3 4 5 6 7 8 1 9 10 2 3 4 5 6 7 8 1 9 10
37 kDa 37 kDa
25 kDa 25 kDa
anti-soro HOPL
1:3000
20 s de reação
anti-soro SALA
1:3000
15 min. de reação
anti-soro HOPL
1:3000
20 s de reação
250 kDa
150 kDa
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa
2 3 4 5 6 7
8
1 9 10
250 kDa 250 kDa
150 kDa 150 kDa
100 kDa 100 kDa
75 kDa 75 kDa
50 kDa 50 kDa
37 kDa 37 kDa
25 kDa 25 kDa
2 3 4 5 6 7
8
1 9 10
anti-soro SALP
1:3000
15 min. de reação
ln N
m
× [ ( n
m
÷ ¿ n
i
) + 1 ]
ln N
i
× [( n
i
÷ ¿ n
i
) + ( n
i
÷ N
i
)] × ( RGS
i
÷ RGS
e
)
IAR = × 100
ln N
m
× [ ( n
m
÷ ¿ n
i
) + 1 ]
ln N
i
× [( n
i
÷ ¿ n
i
) + ( n
i
÷ N
i
)] × ( RGS
i
÷ RGS
e
)
IAR = × 100
AGOSTINHO, A. A.; SUZUKI, H. I.; SAMPAIO, A. A.; BORGES, J. D. R.
Índice de atividade reprodutiva: uma proposta para avaliação da
atividade reprodutiva em peixes. In: Encontro Brasileiro de Ictiologia, 9.,
1991. Resumos. Maringá : UEM. p.53. 1991.
N
i
: número de indivíduos na unidade amostral considerada
(um valor por área amostrada);
n
i
: números de indivíduos em reprodução nas unidades amostrais consideradas
(um valor por área amostrada);
N
m
: número de indivíduos da maior unidade amostral;
n
m
: número de indivíduos em reprodução na maior unidade amostral;
RGS = (massa das gônadas × 100) ÷ massa total do animal;
RGS
i
: RGS média dos indivíduos em reprodução na unidade amostral “i” ;
RGS
e
: maior valor individual de RGS.
CPUE = m
2
REDE × TEMPO
-1
n
m
÷ N
m
=
ln N
max
× [ ( n
max
÷ ¿ n ) + 1 ]
ln N × [( n ÷ ¿ n ) + ( n ÷ N )] × ( VTG ÷ VTG
max
)
I
VTG
= × 100
ln N
max
× [ ( n
max
÷ ¿ n ) + 1 ]
ln N × [( n ÷ ¿ n ) + ( n ÷ N )] × ( VTG ÷ VTG
max
)
I
VTG
= × 100
para Populações Naturais
[( n ÷ ¿ n ) + ( n ÷ N )]
I
VTGe
= × × 100
[ ( N
E2
÷ ¿ n ) + 1 ]
VTG
VTG
max
[( n ÷ ¿ n ) + ( n ÷ N )]
I
VTGe
= × × 100
[ ( N
E2
÷ ¿ n ) + 1 ]
VTG
VTG
max
para BIOENSAIOS

I
VTGh
= × × × 100
[( N
E2
÷ ¿ n ) + 1]
[( n ÷ ¿ n ) + 1] (VTG – VTG
C
)
VTG
max
ln n
ln N
E2
I
VTGh
= × × × 100
[( N
E2
÷ ¿ n ) + 1]
[( n ÷ ¿ n ) + 1] (VTG – VTG
C
)
VTG
max
ln n
ln N
E2
ln n
ln N
E2
para ENSAIOS in vitro de
ESTROGENICIDADE
ln N
f
I
VTGf
= × × × 100
[ ( n
f
÷ ¿ n ) + ( n
f
÷ N
f
) ]
[( n ÷ ¿ n ) + ( n ÷ N )] ln N VTG
VTG
max
ln N
f
I
VTGf
= × × × 100
[ ( n
f
÷ ¿ n ) + ( n
f
÷ N
f
) ]
[( n ÷ ¿ n ) + ( n ÷ N )] ln N VTG
VTG
max
para para a Vitelogênese, com
Fêmeas como Controle Referencial
demonstra a
PRODUÇÃO MOLECULAR
de VTG ( expressão )
em populações (ou grupos),
relacionando-a com a:

quantidade de indivíduos
VTG[+] ( ¿n )


MAGNITUDE AMOSTRAL
( N e N
max
)
dos grupos:
ANALISADO
e de
REFERÊNCIA
(denominador)


TRATAMENTO ctrl EE
NÚMERO DE CÉLULAS POR POÇO DE MICROPLACA N 129.471 145.807 92.357 106.128 ENTRA VALOR
CÉLULAS VTG (+) POR POÇO DE MICROPLACA n 129.471 145.807 92.357 106.128
CONCENTRAÇÃO RELATIVA (i nte nsi dade ) de VTG VTG 3.320.517 4.839.472 3.434.054 1.856.669 ENTRA VALOR
maior valor individual de VTG VTGmax 4.839.472 4.839.472 4.839.472 4.839.472
int ensidade de VTG no grupo CONTROLE VTGC 3.320.517 3.320.517 3.320.517 3.320.517
ESTROGENICIDADE no grupo = VTG - VTG
C
/ VTG
max 0,000000 0,313868 0,023461 -0,302481
NÚMERO DE CÉLULAS no gr upo controle i nduzi do ( EE
2
) N
E2 145.807 145.807 145.807 145.807
NÚMERO DE CÉLULAS VTG (+) no gr upo EE
2
n
E2 145.807 145.807 145.807 145.807
somat ór io de n (Sn) 473764 473764 473764 473764
l n N 11,77 11,89 11,43 11,57
n / Sn 0,27 0,31 0,19 0,22
n / N 1,00 1,00 1,00 1,00
(n / Sn)+(n / N) 1,27 1,31 1,19 1,22
VTG - VTG
C
/ VTG
max 0,00 0,31 0,02 -0,30
nume rador 0,00 4,88 0,32 -4,28
l n N
E2 11,89 11,89 11,89 11,89
(N
E2
/ Sn)+1 1,31 1,31 1,31 1,31
de nomi nador 15,55 15,55 15,55 15,55
I
VTGh
= 0,00 31,39 2,06 -27,55

I
VTGh
= × × × 100
[( N
E2
÷ ¿ n ) + 1]
[( n ÷ ¿ n ) + 1] (VTG – VTG
C
)
VTG
max
ln n
ln N
E2
I
VTGh
= × × × 100
[( N
E2
÷ ¿ n ) + 1]
[( n ÷ ¿ n ) + 1] (VTG – VTG
C
)
VTG
max
ln n
ln N
E2
ln n
ln N
E2
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
Í
n
d
i
c
e

V
i
t
e
l
o
g
ê
n
i
c
o
CTRL
EE
2
EE
2
+ TMX
TMX
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
Í
n
d
i
c
e

V
i
t
e
l
o
g
ê
n
i
c
o
CTRL
EE
2
EE
2
+ TMX
TMX
n : número médio de células viáveis por unidade de cultivo
(poço de microplaca, lamínula ou garrafa)
no tratamento considerado;
N
E2
: número médio de células viáveis por unidade de cultivo
no grupo induzido (E2[+]);
VTG : concentração ou quantidade de VTG aferida
nas unidades de cultivo do tratamento considerado;
VTG
C
: VTG aferida nas unidades de cultivo do grupo controle,
sem nenhum tratamento;
VTG
max
: maior valor individual de VTG

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