Tcnicas moleculares para el aislamiento, amplificacin, secuenciacin y expresin de un fragmento de ADN especfico

Esta tecnologa se denomina: Tecnologa del DNA recombinante, clonacin gnica o ingeniera gentica

Ningn campo de la biologa ha permanecido igual tras esta revolucin tecnolgica

Propiedad bsica del DNA que permite su manipulacin:

El acoplamiento de cadenas por complementariedad. La extraordinaria especificidad del reconocimiento entre secuencias de bases complementarias constituye un poderoso instrumento para la identificacin, aislamiento, clonacin,... De fragmentos de DNA complementarios a uno dado

Herramienta bsica
Endonucleasas (enzimas) de restriccin -> Enzimas de bacterias que reconocen secuencias de DNA especficas y lo cortan por el esqueleto azcar-fosfato. Tipo I y III: cortan el DNA en puntos distintos al de reconocimiento (al azar) Tipo II: cortan justo en los puntos que reconocen, que son repeticiones invertidas o palndromes

5-acgtattccggaacatcgacctGAATCCactttagcgtagctaccgctcgcag- 3 3-tgcataaggccttgtagctggaCTTAGGtgaaatcgcatcgatggcgagcgac- 5

EcoRI: E. Coli BamHI: Bacillus amyloliquefaciens

Dos tipos de cortes: Corte plano: extremos romos Corte escalonado: extremos pegajosos o cohesivos

Las enzimas de restriccin tipo II:

Proporcionan una forma de cortar el DNA de cualquier origen en secuencias especficas, produciendo por tanto una poblacin heterognea de fragmentos de extremos idnticos

Clonado de ADN
DNA forneo (secuencia que se desea clonar)
Vector de clonacin (vehculo) Organismo husped (E. Coli) Seleccin de vectores

Clonado de ADN
TEJIDO VECTORES

mRNA cDNA
(doble cadena metilado)

DNA DNA digerido LIGACION DNA-VECTOR DNA RECOMBINANTE INTRDUCCION EN CELULA HUESPED

DNA CLONABLE

Biblioteca

(Screening-subclonado)

VECTORES
Construidos a partir de plsmidos y bacterifagos naturales

Caractersticas

1) ORIGEN DE REPLICACION : Posee secuencias que permiten su propagacin 2) MCS: (multiple cloning site) sitio para insertar el DNA a clonar- Posee sitios nicos para varias ER 3) MARCADORES DE SELECCIN: Confieren propiedades fenotpicas a la clula husped.

TIPOS DE VECTORES

1) VECTORES DE CLONADO- Aislamiento de fragmentos de DNA

2) VECTORES DE EXPRESIN- Expresin de genes clonados

3) VECTORES ESPECIALES- Permiten estudio de promotores y secuencias regulatorias de la expresin gnica

TIPOS DE VECTORES DE CLONADO

PLASMIDOS: FAGOS: COSMIDOS:

Lmite clonado 0.1- 10 Kb Derivados del bacterifago Lambda, 8-25 Kb Combinacin fago l y plsmido, 35-50 Kb Derivados plsmido F, 75-300 Kb

BAC (Bacterial Artificial Chromosomes)

Vectores derivados de Bacteriofago P1 , 100 Kb

YAC (Yeast artificial Chromosome)

cromosoma de levaduras artificial, 100-1000 Kb

PLASMIDOS
Molcula DNA doble cadena circular extracromosomal que replica en forma autnoma dentro de la bacteria (1.6-300 Kb) FUNCIONES CODIFICADAS POR LOS PLASMIDOS Resistencia a antibiticos Degradacin de compuestos orgnicos (Pseudomonas) Produccin de toxinas (ej E.coli Induccin de tumores (plantas) Sistemas de Restriccin-modificacin Produccin de antibiticos (ej Streptomyces) Resistencia a metales pesados enterotoxinas)

Produccin de bacteriocinas (colicinas, subtilicinas)

CLASIFICACIN DE PLSMIDOS
N DE COPIAS: Alto o bajo N de copias. El N de copias depende del tipo de ori de replicacin 30 Replicones diferentes Bajo N de copias:1-5 copias Alto N de copias : 20-40 copias (hasta 300 copias) CONJUGATIVOS O NO GRUPO DE COMPATIBILIDAD

PLASMIDOS -VECTORES DE CLONADO

CARACTERISTICAS 1) ORI (derivados de ColE1) 2) POLILINKER (MCS) 3) MARCADORES DE SELECCIN

4) SECUENCIAS PARA SCREENING: b-Galactosidasa

MARCADORES DE SELECCIN Permiten la seleccin de aquellas clulas que poseen el vector : - Marcadores de resistencia a antibiticos -Marcadores de auxotrofa (permiten sobrevivir en ausencia de un componente esencial ej aminocidos)

MARCADORES DE SELECCIN
Ampicilina: Interfiere con sntesis de pared bacteriana Resistencia: gen bla (b-lactamasa) Tetraciclina: Inhibe sntesis de protenas por unin a subunidad ribosomal 30s Resistencia: gen tet (protena que se une a membrana bacteriana e impide transporte del antibitico) Kanamicina: Se une a ribosomas 70s , produce misreading del mRNA Resistencia: gen kan (aminoglicosido fosfo transferasa modifica el antibitico)

pUC19

Fago

Vectores de clonado
Fago (2 sitios de corte) < 24 kb

Cromosomas artificiales P1 (derivados del bacterifago P1, pueden aceptar insertos de 80 y 100 kb

Formacin de placa de lisis

Vectores de clonado

Csmido: extremos cos + DNA plsmido (origen replicacin) + DNA forneo + cpisde. ~50 kb
BAC (cromosoma artificial bacteriano): derivado del plsmido F, insertos de 150-300 kb. Usados en la secuencia de genomas Csmido

Husped: E. coli
Introduccin del vector recombinante en el husped: Plsmido: transformacin (solucin diluida cloruro de calcio) y replicacin autnoma

Fago (transduccin, insercin en DNA husped)

Csmido (transduccin como fago y replicacin como plsmido)

Seleccin de vectores recombinantes

Plsmido: resistencia a antibiticos

Fago : Insercin en E. coli (slo se puede empaquetar el DNA de si contiene el inserto forneo)

ETAPAS DE CLONADO EN PLSMIDOS

DIGESTION con ER : Plsmido y ADN a clonar

LIGACION (in vitro, ligasa)

TRANSFORMACION ( bacterias competentes) SELECCIN SCREENING

Como mejorar la reaccin de ligacin

Desfosforilacin del vector: fosfatasa alcalina Ligacin como una reaccin bimolecular en dos etapas 1 reaccin intermolecular entre el vector y el fragmento

favorecida por una elevada concentracin de extremos

2 reaccin intramolecular
favorecida por una baja concentracin de extremos

Como mejorar la reaccin de ligacin

TRANSFORMACION Y SELECCION
TRANSFORMACION Bacterias competentes: Mtodos qumicos: Cl2Ca, DMSO, etc Eficiencia:107 cel/ug DNA

Mtodos fsicos: Electroporacin (pulsos electricos )

Ef: 108cel/ug DNA SELECCIN Presin de seleccin : crecimiento en presencia de antibitico

Mtodos de seleccin de clones recombinantes

para detectar la mlecula de plsmido que posee inserto b-galactosidasa (no es concluyente)

Mapeo de restriccin
PCR (colony PCR) Hibridizacin in situ en la colonia con sonda especfica

Opern Lactosa

Seleccin de clones recombinantes mediante alfa complementacin

Mtodos de seleccin
Resistencia a antibiticos

La resistencia la confieren genes que porta el vector, en este caso a ampicilina y a tetraciclina
El ADN forneo se inserta en el gen de resistencia a Ampicilina

Plsmido pBR322

Mtodos de seleccin
Resistencia a antibiticos

La resistencia la confieren genes que porta el vector

Sin plsmido Sin inserto Con plsmido Con inserto Con plsmido Sin inserto

Con tetraciclina

Con ampicilina y tetraciclina

Vectores de expresin
Protenas expresadas en E. coli
1) Protenas de fusin:
Regin que codifica una protena tag fusionada en marco de lectura a la regin que codifica para la protena target. Cuando se transcribe y traduce genera una protena de fusin purificacin protege de protelisis a la protena de inters mejora la solubilidad de la protena estabiliza a la protena de inters

Esquema genrico del vector

A

Promotor
ATG A B MCS

Secuencia tag: *Dominio con funcin enzimtica *Seales topognicas

Secuencias consenso para Corte con una proteasa

ori

Ampr

MCS

Sitio mltiple de clonado

Optimizacin de la expresin de protenas en E. coli 1) Iniciacin de la traduccin: Promotor fuerte producir altos niveles de mRNA Se requiere optimizar la traduccin.

Secuencia de Shine Dalgarno: Secuencia complementaria a regin en 16S rRNA (subunidad pequea del ribosoma)

Secuencia 6-8 nt a -10 nt del AUG mRNA 5

UAAGGAGG AUUCCUCC

AUG

16S rRNA

small ribosomal subunit

Problemas cuando se expresan protenas eucariticas en cl procariotas: Inestables. Sin actividad biolgica. Contaminantes procariticos.

Soluciones: se han desarrollado sistemas de expresin en eucariotas Esp. importantes para protenas teraputicas. Necesidad de que tengan idnticas propiedades bioqumicas, biofsicas y funcionales a la protena natural.
Modificaciones post-traduccionales Formacin de uniones disulfuro correctas. Clivaje proteoltico del precursor inactivo. Glicosilacin- agregado de residuos de azcar Alteracin de aminocidos en la protena: fosforilacin, acetilacin, agregado de grupos sulfato, agregado de cidos grasos

Vectores de expresin eucariotas

Elementos para clonado en bacterias ori de replicacin Marcador de seleccin bacteriano Sitios mltiples de clonado

Elementos especficos de vectores eucariontes

Promotor eucariota Seal de poliadenilacin Secuencias Kozak y codn ATG Intrn Tags-protenas de fusin ori de replicacin eucarionte como el de SV40 (opcional) Marcador de seleccin para clulas eucariontes (para transfecciones estables) Segmentos de DNA para recombinacin homloga

Vector de expresin eucariota

Vector de fusin a EGFP

Expresin de protenas fluorescentes

Protena fluorescente verde

Hay dos tipos bsicos de bibliotecas de ADN Genmicas cDNA

Bibliotecas de ADN o genotecas Es una coleccin de molculas de DNA consistiendo de fragmentos del genoma entero (Librera genmica) o copias de todos los RNAm producidos por una clula o tipo celular (Librera de cDNA) insertado en un vector de clonacin e introducido en una clula hospedera. Fuentes de RNA???.

Para que se construyen libreras: - Identificar genes. - Identificar secuencias regulatorias. - Identificar genes expresados diferencialmente. - Secuenciar genomas - Conocer secuencias de aminocidos, en libreras de cDNA.

Clonado de gDNA y cDNA

Caminar sobre DNA

Construccin Biblioteca de ADNc

1. Purificacin de ARNm 2. Sntesis de la primera ADNc. 3. Sntesis de la segunda cadena del ADNc. 4. Clonado en el vector

Purificacin ARN

Purificacin ARN

Purificacin de mRNA
Oligo (dt) Celulosa
TTTTT TTTTT
AAAAAA AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

Poly A, hibridiza con Oligo (dt) T T T T TT

A AAA T TT T

A AAA T TT T A AAA T TT T A AAA T TT T

100 Mm NaCl

10 Mm Tris 1mM EDTA

AAAA AAAA AAAA

Poly mRNA eluido

Sntesis de la primera cadena de cDNA

Primer mtodo

Sntesis de la primera cadena de cDNA

Segundo mtodo

Ligacin al vector

Adaptadores

Ligacin

Cmo obtener un animal genticamente modificado

Ratn transgnico: microinyeccin del ADN de inters en el proncleo.

Ratn knockout: inyeccin de clulas embrionarias modificadas con el gen de inters en el blastocisto.

Microinyeccin pronuclear para hacer un ratn transgnico

Los que desarrollan se llaman fundadores y son hemicigotas para el transgen.

Diferencias entre transgnico y knockout

target

gene

microinjection

targeting vector

neo

TK

homologous recombination

gene

neo

transgenic

knockout

Embryonic Stem Cells

totipotent/pluripotent in vivo/in vitro extraordinary proliferation potential in vitro homologous recombination

Positive and Negative Selection of Targeted ES Cells target ES Cells neo

Recombinants with random insertion

TK

Selection for neor positive Con antibitico G418

Selection for TK negative

ES cells with homologous recombination

Generation of Chimeras
X

Targeted ES cells

Goal: obtain germline transmission

Cmo construir el transgen

ADNc Promotor UTR

Intrn

Vector

Peces fluorescentes para todos!