UNIVERSIDAD ALAS PERUANAS FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE TECNOLOGIA MEDICA Lic. T.M.

TRIGOSO AVALOS, WILSON E. CTMP 6226

Fase inicial de crecimiento de la instrumentacin de Laboratorio empez a principios de los aos 50. nfasis en las tcnicas clsicas de qumica analtica cuantitativa y recuento celular manual. Habilidades manuales de pipeteo y mantenimiento de protocolos rgidos. Fotmetros simples , pHmetros eran los nicos instrumentos presentes en un Laboratorio Clnico. Fraccionamiento proteico mediante electroforesis, cromatografia lquida para aminocidos. Requeran el pipeteo manual de muestras y una labor intensa.

En los 60, los analizadores de un solo canal se expandieron para dar analizadores multicanal. Desde entonces, los perfiles qumicos integran la rutina de ensayo para los pacientes. Se incorpora los reactivos en compartimientos.

En los 70, empezaron a integrarse los microprocesadores en muchos analizadores analticos. Los microprocesadores integrados captaban cambios en la absorbancia y los convertan en concentraciones. Al final de la dcada, los fabricantes incorporaban puertos de comunicacin en los instrumentos para interaccionar con una variedad de sistemas de informacin del Laboratorio. Destaco la aplicacin de electrodos selectivos para los iones (anlisis rutinario de sodio y potasio). Se avanzo en el WBC (Recuento diferencial de glbulos blancos).

En los 80, apareci el ANALIZADOR DE ACCESO DIRECTO (nuevo sistema automatizado) incluan los reactivos necesarios para 30 ensayos diferentes, y el operador poda seleccionar cualquier combinacin de determinaciones para una alcuota de muestra (sistema Ektachem de Kodak-Johnson & Johnson Diagnostic). La reaccin (reactivo muestra) a travs de una serie de capas de pelcula, y la concentracin se media mediante fotometra de reflexin. Se desarrollaron instrumentos de electroforesis capilar (CE) (alcuotas en picolitros); podan medirse cidos nucleicos y pptidos.

ESPECTROFOTOMETRIA. ESPECTROFOTOMETRIA DE EMISION Y ABSORCION ATOMICA. ESPECTROSCOPIA DE LUMINISCENCIA MOLECULAR (FLUORIMETRIA) NEFELOMETRIA. TURBIDIMETRIA. REFRACTOMETRIA.

OSMOMETRIA.

CITOMETRIA DE FLUJO ELECTROQUIMICA DENSITOMETRIA

CONDUCTOMETRIA Y RESITENCIA. ELECTROFORESIS

ISOELECTROENFOQUE

CROMATOGRAFIA. BIOSENSORES.

ESPECTROMETRIA DE MASAS. CONTADORES DE CENTELLO.

ESPECTROFOTOMETRIA: medir la energa lumnica absorbida o transmitida. Los fotones o paquetes de energa (hv) poseen frecuencias nicas. El espectro de frecuencias de la EMR (radiacin electromagntica) se extiende desde valores muy bajos sobre un rango de ondas (hasta la luz visible) y alcanza valores elevados (UV, rayos X, rayos Gamma). Los fotones de la energa radiante se intercambian siempre que interaccionan con partculas subatmicas elctricamente cargadas. Cuando estos electrones se mueven de una orbita a otra, parte de la energa es absorbida o emitida.

Los instrumentos espectrofotomtricos miden luz de diversas maneras. Aparte de los Espectrofotmetros de absorcin molecular existen: - Espectrofotmetro de emisin atmica.- mide la luz emitida por tomos sencillos quemados en una llama. - Fotmetros de absorcin atmica.- mide la luz absorbida por tomos disociados por calor. Espectrofotmetro de luminiscencia molecular (fluormetro).- mide la luz de una determinada longitud de onda que emite una molcula despus de ser excitada por una RE de una energa dada.

ESPECTROFOTOMETRO mide la absorcin de luz monocromtica producida por una red monocromadora. LEY DE BEER LAMBERT establece que la concentracin de una sustancia es directamente proporcional a la cantidad de luz absorbida o inversamente proporcional al logaritmo de la luz transmitida.
Importante: - Radiacin incidente monocromtica, absorcin del disolvente insignificante en comparacin con la del soluto, concentracin del soluto dentro de lmites lineares, no reaccin qumica entre las molculas de inters y otras.

Un espectrofotmetro posee cuatro componentes bsicos: una fuente de radiacin que tiene intensidad constante en el rango de longitud de onda. un compartimiento para la muestra. un monocromador que separa la banda de longitud de onda deseada del resto del espectro y la dispersa al compartimiento de la muestra. un fotodetector, que mide cuantitativamente la radiacin que pasa por la muestra.

Comparando la longitud de onda y la intensidad del mximo de absorcin de luz de una muestra versus soluciones Standard, es posible determinar la concentracin en la muestra.

Muchos anlisis en el Laboratorio Clnico implican un sistema completo de tratamiento de la muestra, separacin y anlisis. Estos mtodos son a menudo largos y laboriosos. El proceso de anlisis puede automatizarse para aumentar su velocidad y precisin. Las mejoras en la tecnologa y en la automatizacin han resultado en un sistema de anlisis total (TAS)

La automatizacin, es el proceso por el cual se hace un traspaso de funciones del hombre a la mquina para realizar las actividades que anteriormente este realizaba. Sirve para agilizar el procesamiento de las pruebas de rutina, tanto como las especiales en una gama ms amplia y obtener resultados ms confiables.

Los analizadores automatizados permiten a los Laboratorios procesar un gran volumen de ensayos rpidamente, debido al incremento de la velocidad de anlisis.
Este aumento en la tasa de ensayos ha sido posible gracias a la automatizacin de muchos pasos manuales.

Algunos pasos manuales que han sido automatizados son: - Medida y adicin de reactivos. - Mezclado de la muestra y de los reactivos. - Incubacin de la mezcla y de la muestra. - Calibracin del Ensayo. - Medida y lectura de la reaccin de la muestra. - Almacenamiento y anlisis de los datos de la muestra.

La mayora de los analizadores automatizados son de flujo continuo o discretos. - En los de flujo continuo, las muestras fluyen a travs de una ruta de reaccin comn. - En los analizadores discretos, viajan a travs del instrumento en su propio conducto de reaccin.

El diseo del flujo del analizador por el que viajan las muestras puede ser secuencial, paralelo, en grupo o de acceso directo.

Ensayos secuenciales: mltiples ensayos analizados uno detrs de otro en una determinada muestra. Ensayos en grupo: todas las muestras se cargan simultneamente y se realiza un solo ensayo en cada muestra. Ensayos en paralelo: se realiza mas de un ensayo simultneamente en una muestra clnica. Ensayos de acceso directo: puede realizarse cualquier ensayo en cualquier muestra y en cualquier secuencia.

PRINCIPALES COMPONENTES DE LOS ANALIZADORES AUTOMATIZADOS: - Identificacin del paciente. - Muestreo. - Transporte de la muestra. - Dilucin. - Mezcla. - Incubacin. - Unidades de reaccin. - Anlisis de la medida. - Anlisis de datos.

La configuracin e integracin de los instrumentos de Laboratorio hoy en da son diversos y cambiantes. Los Laboratorios buscan instrumentos y/o equipos que puedan utilizar mas de una metodologa. La fase pre-analtica es, a menudo; tediosa y una fuente de errores. Se han desarrollado mdulos pre-analticos: Lectura de cdigos de barras, Separacin, Transporte, Centrifugacin, Destapado de tubos, Preparacin de alcuotas, Nivel de deteccin y evaluacin de la integridad de las muestras, Almacenamiento.

Enfoque de Software y otro de Hardware. La tecnologa de la automatizacin del Laboratorio Clnico deriva su utilidad de la funcionalidad.

Diseo de los sistemas de automatizacin, implementacin de software de control de proceso, relacin entre la funcin de hardware y software, interfases del usuario en el sistema, interfaz con el sistema de informacin del Laboratorio (SIL), interfaz entre el sistema de automatizacin del Laboratorio (LAS) y otros componentes de hardware, etc

Hay varias dependencias importantes entre el software y el hardware. Si la funcionalidad del Software esta ausente, no puede esperarse que el hardware funcione de forma ptima. Si no hay funcionalidad del hardware, no puede esperarse que el Software active la funcin del hardware.

Funcionalidad de ambos es interdependiente.

Los sistemas basados en Software estn diseados y construidos en torno a una base de datos que contiene:
informacin demogrfica sobre los pacientes, sobre los ensayos pedidos, localizacin de las muestras, estado de las muestras, estado de los instrumentos y estado del proceso (de los instrumentos interfaz).

El Software que controla procesos requiere varios componentes y una funcionalidad importante que incluye:
base en la tecnologa de la informacin moderna (con hardware) y sistemas de operacin que puedan actualizarse de forma vertical, sistema de control del transporte y seguimiento de los recipientes de muestra para localizacin con el sistema automtico, repeticin de ensayos, sistemas de integracin de la informacin.

Desarrollo de un mecanismo incluido en el hardware que desarrolle, en parte o por completo la automatizacin de procesos. Desarrollo de un hardware que puede centrarse en el manejo del material o en el proceso, o en ambos. Generalmente se centra en el recipiente de la muestra. Cuanto mayor sea la variabilidad del recipiente, mayor es la flexibilidad y mas complejo el diseo del hardware de la tecnologa de automatizacin. Flexibilidad Rendimiento o velocidad de procesamiento.

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El equipo suministra dos tipos de resultados: un informe numrico y un informe grafico (histogramas); es recomendable encontrar valores de referencia propios para cada poblacin en estudio.
En el histograma se utilizan grficas de frecuencias de volmenes celulares representados en el eje X graficado contra un numero relativo representado en el eje Y; por ser relativo, no tiene un equivalente numrico real.

CITOMETRIA DE FLUJO: Mide las propiedades de las clulas en suspensin movindose en un medio fluido. Todas las clulas pasan de forma individual por un punto de medida, donde son interceptadas por un has de lser. - La Luz transmitida consiste en pulsos de luz dispersada (hacia delante y en ngulo de 90) y de Luz Fluorescente.

- Los impulsos se dirigen mediante lentes enfocndose en los tubos fotomultiplicadores, cuya seal anloga se convierte en seal digital para su cuantificacin.

Caractersticas Tcnicas: Una lnea de lser: azul (488nm) 3 detectores de fluorescencias independientes (FL1, FL2 y FL3). Filtros: filtros de paso de banda 530/30 nm (FL1), 585/42 nm (FL2), y filtro de paso largo LP670 nm (FL3).

Las seales producidas por la interaccin de las clulas con el haz de luz son de dos tipos: - Seales de dispersin.

- Seales de fluorescencia.

-La luz dispersada en ngulo cnico pequeo (0-10) que casi coincide con la direccin de la luz incidente, llamada FSC (Forward Scatter). Es una medida proporcional al tamao de la partcula que produce la dispersin. -La luz dispersada en ngulo recto llamada SSC (Side Scatter). Es proporcional a la complejidad de la estructura interna de la partcula.

DISCRIMINACIN POR FSC-SSC

Granulocitos

Linfocitos
R1

Monocitos

COMPONENTES DE UN CITOMETRO DE FLUJO. - Incluye un sistema de transporte celular, una fuente de luz lser, una cmara de flujo, filtros monocromticos, lentes, espejos dicroicos, tubos fotomultiplicadores y un ordenador para el anlisis de datos.

Las muestras que se van analizar se preparan dependiendo de la fuente y se resuspenden en un medio. Las alcuotas de suspensin celular se introducen en la cmara de flujo mediante un sistema de presin. A medida que las clulas pasan por la cmara de flujo, se rodean de un lquido de baja presin. Este flujo de lquido externo crea un flujo laminar que mantiene la muestra en el centro y resulta en la alineacin individual de las clulas (ENFOQUE HIDRODINAMICO).

Cada clula de la muestra es interceptada por un haz de rayo lser. La dispersin directa de la luz es proporcional al tamao de la clula y la dispersin lateral o de 90 se relaciona con el grado de reflexin interna (granularidad celular).
La dispersin directa de la luz (hacia adelante) se dirige hacia el fotodetector de dispersin directa. En un ngulo recto con respecto al haz de lser se encuentran unos espejos que dividen la dispersin lateral entre los tubos fotomultiplicadores restantes (detector de dispersin lateral y detector de fluorescencia). El anlisis de las seales simultaneas de la dispersin de la luz directa y lateral permite la separacin de granulocitos, monocitos y linfocitos en funcin de su tamao y complejidad.

La CMF puede ofrecer informacin simultnea de varios parmetros de cada una de las clulas analizadas y la relacin entre los parmetros de una clula y los de otra clula tambin analizada. Permite el anlisis de dos parmetros de dispersin, SSC/FSC y tres de fluorescencia (en equipos con un solo lser), Fl1, Fl2 y Fl3, y de una cuarta fluorescencia en equipos con dos lseres.

Estudio de la complejidad y heterogeneidad del SI. Estudio del crecimiento celular. Estudio de la apoptosis. Cuantificacin de la actividad fagoctica. Cuantificacin de la actividad microbicida.

MARCAJE SUPERFICIAL

Fluorocromos para conjugar Ac.

Absorcin mx.

Emisin mx (nm)

Isotiocianato de fluorescena (FITC) Ficoeritrina B (B-PE) Ficoeritrina R (R-PE) Rojo texas (TXR) Aloficocianina (APC)

495 545/565 488/545/565 595 650

525 (verde) 575 (naranja) 578 (naranja) 620 (rojo) 660 (rojo)

Ficocianina (CPC)
Rojo 613 Peridimin Clorophyll (PerCP)

620
488/565/595 470

648 (rojo)
613 (rojo) 680 rojo)

MARCAJE SUPERFICIAL

FICT CD3

PE CD56

PerCP CD19

NK

MARCAJE SUPERFICIAL
- Caracterizacin fenotpica: CD3, CD56, CD19.

- Diferenciacin celular: CD95, CD45RA, CD45RO.

- Coestimulacin: CD28, ICOS, CTLA-4.

- Recirculacin: CD62L, CLA, a4b7.

- Activacin celular: CD57, CD25, HLA-DR, CD71.