ELECTROFORESIS CAPILAR ELECTROSMOSIS

MI Maria del Rosario Martnez Macias

Qu es la electroforesis?
Tcnica de separacin que se basa en la diferente movilidad o velocidad de migracin de partculas cargadas debido a la accin de un campo elctrico

SEPARACIN DE LOS ELEMENTOS DE UNA MEZCLA

Separa los diferentes elementos que componen una mezcla compleja en funcin de la carga elctrica de los mismos

VELOCIDAD DE LAS PARTICULAS

Depende de ...

La carga de las mismas La intensidad del campo elctrico y Del coeficiente de friccin de las molculas con el medio

APLICACIN DE LA ELECTROFORESIS Fraccionamiento de las hemoglobinas Diferenciacin de la hemoglobina fetal Diagnstico de talasemias, anemias falciformes, etc Protenas sricas Protenas urinarias Lipoprotenas cidos nucleicos Enzimas Inmunoelectroforesis Etc.

Fundamento
Cuando una mezcla de molculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un campo elctrico, estas experimentan una fuerza de atraccin hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las molculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el ctodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el nodo (el polo positivo).

 El movimiento de las molculas esta gobernado tambin por dos fuerzas adicionales; inicialmente la friccin con el solvente dificultar este movimiento originando una fuerza que se opone , por otro lado las molculas tienen que moverse en forma aleatoria o movimiento browniano debido a que poseen energa cintica propia denominado difusin. La energa cintica de las molculas aumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor difusin.

La suma de todas estas fuerzas provoca que las molculas no migren de una manera homognea, de tal manera que, si las molculas son colocadas en un cierto lugar de solucin, los iones comenzaran a moverse formando un frente cuya anchura aumentara con el tiempo. Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el movimiento de las molculas empleando un medio que oponga mas resistencia a dicho movimiento. Una forma comn de hacer esto es formar un gel. El gel consiste de un polmero soluble de muy alto peso molecular que atrapa molculas de agua y forma un tamiz que dificulta el movimiento de los solutos, consecuentemente, la migracin electrofortica de las molculas ser mas lenta, pero el ensanchamiento del frente se vera reducido tambin.

electro migracin
Mucha gente cree que la electro migracin es la "migracin de electrones" pero en realidad es el material que "migra" por causa de un flujo de electrones, por eso se llama electro-migracin La electro migracin es un fenmeno que depende de la temperatura

Tipos de electroforesis
Las separaciones electroforticas se llevan a cabo habitualmente en dos modalidades que difieren notablemente: electroforesis convencional y electroforesis capilar. La primera es la metodologa clsica que ha sido utilizada durante muchos aos para separar especies complejas, de elevado peso molecular, de inters biolgico y bioqumico. Las separaciones convencionales se llevan a cabo sobre una capa delgada y plana o placa de un gel poroso que contiene un tampon acuoso en el interior de sus poros.

Normalmente, esta placa tiene unas dimensiones de unos pocos centmetros de lado, y al igual que las placas de cromatografca en capa fina, es capaz de separar varias muestras simultneamente. Las muestras se disponen como manchas o bandas sobre la placa, y se aplica el potencial de corriente continua, a travs de la placa, durante un perodo de tiempo fijo. Cuando se juzga que las separaciones se han completado, se interrumpe el paso de la corriente, y las especies separadas se detienen para visualizarse de modo similar La electroforesis convencional es, actualmente, la tcnica de separacin ms ampliamente utilizada por bilogos y bioqumicos.

FUNDAMENTO DE LAS SEPARACIONES ELECTROFORETICAS

La velocidad de migracin de un ion, v, en centmetros por segundo, en el seno de un campo elctrico, es igual al producto de la intensidad del campo elctrico E (V cm-1) 2 por la movilidad electrofortica eCAPILAR-1s-1 ), esto es: ELECTROFORESIS (cm V v = eE
La movilidad electrofortica es directamente proporcional a la carga elctrica del analito e inversamente proporcional a los factores de retardo por rozamiento. El campo elctrico acta solamente sobre los iones. Si dos especies difieren bien en la carga o en las fuerzas de rozamiento, se movern a travs del tampn y se separan. Las especies neutras no se separan

ELECTROFORESIS CAPILAR

La electroforesis convencional ha sido y continua siendo de gran utilidad; sin embargo este tipo de separacin electrofortica es lenta, laboriosa y difcil de automatizar, y adems no proporciona resultados cuantitativos precisos. La investigacin y la aplicacin de la electroforesis llevada a cabo en capilares tuvo un crecimiento explosivo durante la segunda mitad de la dcada de los ochenta, ello unido a la aparicin de varios instrumentos comerciales.
La electroforesis capilar da lugar a separaciones con volmenes de muestra extraordinariamente pequeos (de 0,1 a 10 nL, en contraste con la electroforesis convencional en la cual se emplean volmenes de muestra del orden de L) y con una elevada resolucin y rapidez. Adems, las especies separadas eluyen de uno de los extremos del capilar

VELOCIDADES DE MIGRACION Y ALTURAS DE PLATO EN ELECTROFORESIS CAPILAR

Esta relacin indica que es necesario que se apliquen potenciales elevados para obtener migraciones inicas rpidas y una rpida separacin. Si bien es deseable que las separaciones sean rpidas, es an ms importante obtener separaciones de alta resolucin. Por ello, se hace necesario examinar los factores que determinan la resolucin en la electroforesis.

INTRODUCCION DE LA MUESTRA En el mtodo de inyeccin electrocintica, se retiran del deposito del tampn uno de los extremos del capilar y el correspondiente electrodo, y se colocan en un pequeo recipiente donde est situada la muestra. Se aplica entonces un potencial durante un tiempo determinado, lo que hace que la muestra penetre en el capilar debido a la actuacin conjunta de los fenmenos de migracin inica y flujo electro osmtico. El extremo del capilar y el electrodo vuelven a introducirse en la disolucin tampn, donde se mantienen durante el resto del proceso de separacin. Esta tcnica de inyeccin es discriminatoria al introducir mayor cantidad de los iones ms mviles respecto a los ms lentos.

En el mtodo de inyeccin por presin, el extremo del capilar se coloca momentneamente en un pequeo recipiente que contiene la muestra, y se utiliza una diferencia de presin para conducir la muestra al interior del capilar. Esta diferencia de presin proviene de aplicar vaco en el extremo del detector o de la aplicacin de presin en el recipiente que contiene la muestra, o bien se consigue por elevacin del extremo que contiene la muestra. La inyeccin por presin no diferencia los iones segn su movilidad; sin embargo, no puede utilizarse en capilares rellenos de gel.

modalidades de deteccin en electroforesis capilar'

Fundamento de la deteccin Espectrometra Absorcin Fluorescencia Derivatizacion pre columna Derivatizacion en columna Derivatizacion pos columna Fluorescencia indirecta Lentes trmicas Ramanc Espectrometra de masas Electroqumica Conductividadc Potenciometria Amperometria Radiometriac Limite de deteccion (moles detectados) 10-15-10-13 10-17-10-20 8 x 10-16 2 x 10-17 5 x 10-17 4 x 10-17 2 x 10-15 1 x 10-17 1 x 10-16 No 7 x 10-19 1 x 10-19