CAPTULO 8 AMPLIFICACIN DE SECUENCIAS ADN REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Objetivos
Conocer:
Los fundamentos de la tcnica de amplificacin de DNA por PCR

Usos y aplicaciones del PCR

Ventajas y desventajas del PCR Mtodos de secuenciacin de DNA

Reaccin en Cadena de la Polimerasa

Fue diseada por el Dr. Kary Mullis en 1987. Gan el premio Nbel de Qumica en 1993 por su invento.

Utilizo el PCR para amplificacin del gen de -hemoglobina humana, y el diagnostico prenatal de anemia falciforme.

El proceso de PCR incluye 3 pasos bsicos que se repiten 25 veces o ms:

1. Desnaturalizacin: Consiste en separar la doble hebra de DNA y convertirla en hebra sencilla. -Tpicamente se usa una temperatura de 95C - 97C, por 15 a 40 segundos el tiempo depende del tamao del genoma-

2. Apareamiento o anneling: Los cebadores primers previamente diseados, reaccionan con la hebra sencilla de DNA y se pegan en lugares especficos por complementariedad de bases. Para esto, se baja la temperatura -ej: 55C por 30 segundos-. La temperatura y el tiempo puede variar entre cebadores segn sea el caso.

3. Polimerizacin o Extensin.
Una Polimerasa de DNA extiende los primers, en el espacio comprendido entre ambos primers, y coloca dinucleotidos trifosfatados (dNTPs) de 5a 3 leyendo el DNA de 3a 5. De estas forma sintetiza la secuencia complementaria de las hebras de DNA molde Se efecta a 70C por 1 minutos (puede variar segn sea necesario)

Los pasos 1, 2 y 3 se repiten cuantas veces sea necesario.

En el PCR hay una amplificacin exponencial

Reactivos necesarios para PCR

Los buffer de PCR que se utilizan normalmente contienen KCl, Tris y MgCl2. El MgCl2 es el componente que ms influye en la especificidad y rendimiento de la Buffer de reaccin, actan como cofactores de la polimerasa. amplificac La concentracin ptima de MgCl2 est en torno a 1.5 mM. in La longitud de cada uno de los primers debe estar comprendida entre 18 y 24 bases Ambos primers deben tener una Tm similar La secuencia de los primers debe comenzar y terminar con 1-2 bases pricas. Para evitar la formacin de dmeros de primers es necesario comprobar que los primers no contengan secuencias complementarias entre s.

Primers

Las concentraciones de dNTPs que suelen usarse estn en torno a 200 M para cada uno de ellos. En un volumen de reaccin de 25 l con esta concentracin de dNTPs se sintetizaran entre 6-6.5 g de ADN. Desoxinu La concentracin de dNTPs y de MgCl2 va relacionadas ya que el Mg se une a los dNTPs con lo que concentraciones elevadas de dNTPs inhibiran la reaccin al no tener cletidos trifosfatos la Taq polimerasa suficiente Mg como para incorporar dNTPs. Para una concentracin de 200 M de cada dNTP se suele aadir MgCl2 a una concentracin de 1.5 mM.

Taq-Polimerasa

Las cantidades ptimas de Taq polimerasa necesarias para la sntesis de ADN estn alrededor de 2 unidades en 25 l de volumen final de reaccin. La actividad de este enzima se ve influenciada por la concentracin de dNTPs, de Mg2+ y de algunos iones monovalentes de manera que concentraciones elevadas de los mismos inhiben dicha actividad. Por otro lado, pequeas concentraciones de KCl estimulan la actividad sinttica de la Taq en un 50-60% con un mximo aparente cuando su concentracin es de 50 mM. Del marcador que se va a amplificar: hay marcadores cuyos primers son ms especficos o bien cuyas condiciones de amplificacin estn mejor optimizadas que las de otros. Por esta razn puede darse el caso de que cierta cantidad de amplifique para unos marcadores pero no para otros. Calidad del ADN: Cuando se trabaja con ADN cuya calidad es ptima no suele haber problemas en la amplificacin y cantidades del mismo por encima e incluso por debajo de los 5 ng rinden buenos resultados.

ADN MOLDE O TEMPLATE"

ADYUVANTES DE LA PCR

Son elementos que mejoran el rendimiento y la especificidad de la PCR. Se usa DMSO, glicerol o BSA. El adyuvante ms utilizado es el BSA. A concentraciones por encima de 0.8 g/l el BSA incrementa la eficiencia de la PCR ya acta como una protena captadora de iones que pueden ser inhibidores de la Taq polimerasa

Ventajas y desventajas de la PCR:

Rapidez y sencillez de uso.

La PCR permite clonar ADN en pocas horas, utilizando equipos relativamente poco sofisticados. Una reaccin de PCR tpica consiste en 30 ciclos de desnaturalizacin, sntesis y reasociacin.

Sensibilidad.

La PCR puede amplificar secuencias a partir de cantidades nfimas de ADN diana, incluso a partir de ADN contenido en una sola clula.

Robustez.

La PCR permite la amplificacin de secuencias especficas de material que contiene ADN muy degradado, o incluido en un medio que hace problemtica su purificacin convencional.

Desventajas de la reaccin
Necesidad de disponer de informacin sobre la secuencia del ADN diana Tamao corto de los productos de la PCR

Para poder construir oligonucletidos especficos que acten como cebadores para la amplificacin selectiva de una secuencia particular de ADN se necesita disponer de alguna informacin previa sobre la propia secuencia a amplificar

Los fragmentos pequeos se amplifican muy fcilmente, pero conforme aumenta su tamao se hace ms difcil obtener una amplificacin eficiente. En la actualidad sin embargo ya es posible amplificar secuencias por PCR de tamaos entre 20 y 40 Kb.

Infidelidad en la replicacin del ADN

La clonacin del ADN en clulas pasa por la replicacin del ADN in vivo, proceso asociado a una gran fidelidad de copiado debido a la existencia, en la clula, de mecanismos de lectura y correccin de errores. Sin embargo, cuando el ADN se replica in vitro la tasa de errores cometidos durante el copiado se dispara. Ya se ha comentado anteriormente que la Taq polimerasa utilizada en la reaccin no tiene actividad exonuclesica.

Peligro de contaminaci n

"Si se pasa un papel de filtro por los pomos de las puertas, o la superficie del termociclador, se puede rescatar suficiente ADN como para obtener una seal

Aplicaciones de la PCR
Construccin de bibliotecas de ADNc Una biblioteca de ADNc es el conjunto de clones obtenidos a partir de los ARNm de un tejido determinado de un organismo completo. El ADNc se sintetiza a partir de un mensajero y un cebador por accin de la transcriptasa inversa. Los clones de ADNc tienen una utilidad especial, ya que al proceder de los mensajeros correspondientes, carecen de intrones. Los procariotas carecen de intrones en sus mensajeros y por eso no son capaces de procesar los ARNm eucariticos correctamente. Si lo que se pretende es expresar un gen eucariota en un sistema procaritico, se deber clonar a partir de su ADNc y no de su secuencia genmica. La mayora de los genes eucariticos clonados han sido aislados a partir de bibliotecas de ADNc. La elaboracin de una biblioteca de ADNc implica el aislamiento de la poblacin total de mensajeros celulares y su transcripcin revertida a ADN.

Figura 5: Modo de accin de la transcriptasa inversa en el proceso de construccin de una biblioteca de ADNc. i) La transcriptasa inversa utiliza el ARNm como molde para sintetizar una hebra de ADN complementaria utilizando como cebador una cola de oligo-dT ii) La misma polimerasa (gracias a su actividad ARNasa) destruye la hebra de ARNm molde y forma una especie de "gancho" dejando un extremo 3' OH libre. El gancho servir de cebador a la ADN polimerasa I para sintetizar la segunda cadena del ADNc y posteriormente se eliminar por la accin de la nucleasa S1 que corta especficamente cadenas sencillas del ADN. iii) El ADNc as obtenido ser convenientemente tratado para ser incorporado a un vector y ser clonado in vivo para obtener una biblioteca de ADNc

Amplificacin de molculas de ARNm previo paso a ADNc

En la mayora de los casos en que se amplifican molculas de ARNm es necesario partir de un sistema rico en este. Cuando el mensajero que se va a clonar es abundante no es necesario su enriquecimiento previo, pero cuando no lo es hay que proceder al enriquecimiento ya sea de una forma natural o artificial. Un enriquecimiento natural lo presentan las clulas de tejidos especializados o tumores concretos; por ejemplo, las clulas del pncreas o los insulinomas representaran un sistema de enriquecimiento para aislar el gen que codifica la insulina. Una reaccin en cadena de la polimerasa puede amplificar artificialmente alguno de los mensajeros previo paso a ADNc facilitando as su posterior clonaje. Uno de los mtodos consiste en poner las dos polimerasas, la transcriptasa inversa y una ADN polimerasa termoresistente desde el comienzo en el mismo tubo de reaccin, junto con los cebadores de ambos extremos, desoxinucletidos y sulfato de magnesio. En un principio, durante unos 45 minutos y a 48 oC se sintetiza la primera hebra del ADNc, copia del ARNm; a continuacin se sube la temperatura a 94 oC durante unos 2 minutos, con lo que se desnaturaliza el molde, las hebras se separan, sintetizndose seguidamente la segunda hebra del ADNc y las mltiples copias de ambas hebras (una de las cuales es ARNm) durante 40 ciclos.

Clonacin de secuencias desconocidas de ADN que flanquean una regin conocida.

Una de las limitaciones con la que se encuentra la reaccin de la PCR estndar es que amplifica secuencias de ADN comprendidas entre dos cebadores convergentes, es decir, cada uno de ellos inicia la sntesis del ADN en la direccin del otro (extremos 3' OH enfrentados). Muchas veces puede interesar conocer qu tipo de secuencias de ADN no caracterizadas ocupan la regin adyacente externa a una regin conocida (por ejemplo, conocer la regin reguladora flanqueante de un gen de secuencia ya conocida). Una variante de la tcnica estndar, la PCR inversa, lo permite. El mtodo se basa en el empleo de cebadores divergentes, es decir, cebadores cuyos extremos 3' OH se dirijan hacia el exterior de la secuencia conocida. Con cebadores de este tipo, una reaccin PCR estndar no funciona. En la PCR inversa, se trata el ADN con una enzima de restriccin de forma que la regin deseada quede comprendida en un pequeo fragmento de restriccin, al que se permite la circularizacin por complementariedad de los extremos cohesivos. Una vez circularizado el fragmento, se procede a una reaccin de PCR estndar utilizando los cebadores divergentes, que ahora s permiten que se desarrolle la reaccin.

Figura 5 Clonacin de secuencias de ADN flanqueantes a partir de un molde circularizado. Las regiones X e Y representan las secuencias desconocidas que se desea clonar. Los cebadores se disean de forma que se unan a la secuencia de ADN caracterizada, pero con sus extremos 3' orientados en sentidos opuestos. Tras la recuperacin de la secuencia caracterizada y de sus regiones flanqueantes en forma de un fragmento de restriccin, se circulariza la molcula, de manera que las secuencias flanqueantes quedan en contacto y los extremos 3' de los cebadores quedan orientados para que pueda tener lugar ahora la PCR estndar.

Secuenciacin del ADN y obtencin de sondas para hibridaciones

El mtodo de secuenciacin de ADN requiere que el ADN est en forma de cadena simple antes de su utilizacin. Pese a que la desnaturalizacin del ADN de los productos de PCR puede proporcionar los sustratos monocatenarios necesarios para la secuenciacin, la calidad de la secuencia de ADN aumenta si el producto de partida es monocatenario en origen. La PCR asimtrica es una variante de la PCR estndar que permite generar un gran nmero de molculas de ADN de banda simple que se pueden utilizar directamente para secuenciar o como sondas para hibridaciones. El mtodo consiste en poner proporciones diferentes de cebadores de manera que uno de los dos est a concentracin limitante. As, hasta los primeros 20 a 25 ciclos se amplifican las dos hebras del ADN, pero al agotarse uno de los cebadores, los 5 a 10 ciclos siguientes sern de ADN de banda simple. La concentracin de uno de los cebadores suele fijarse en 100 veces la concentracin del otro; utilizando, por ejemplo, una relacin de 50 picomoles de un cebador y 0,5 del otro, se obtiene despus de 30 ciclos, de 1 a 3 picomoles de ADN de banda simple.

Figura 6: Esquema del procedimiento empleado en la PCR asimtrica para generar ADN de banda simple

Diagrama de la extraccin del DNA genmico (previamente realizado)

Condiciones para reaccin en el termociclador:

1 ciclo : 94C por 2.5 minutos. 32 ciclos: 94 C por 30 segundos 54 C por 1 minutos 72 C por 70 segundos 1 ciclo: 72 C por 10 minutos

Lleve a reaccionar en el termociclador.