Recombinant DNA Technology I

Lodish Chapters 5.2

…it all began with the discovery of the bacterial “defense” system
that RESTRICTS phage growth.  In the late 1960’s, Stewart Linn
and Werner Arber discovered two classes of enzymes: methylases
and RESTRICTION endonucleases. 

At the same time, Charles Richardson had purified DNA ligase of
the E.coli phage T4…….all you needed to do was to “cut and ligate”..

And that’s what Paul Berg did in the 70’s…and he received the
Nobel Prize in 1980.
   
 Restriction enzymes cut DNA molecules 
at specific sequences

   
Most restriction enzymes recognize short palindromes and
cut unmethylated DNA

Frequency of 6 cutters: 46 = once every 4096 bp
  Frequency of 4 cutters: 4  4 = once every 256 bp
 Today we know more than 600 different
 restriction endonucleases

   
 DNA cloning with plasmid vectors

• Recombinant DNA technology depends on the ability 
to produce large numbers of identical DNA molecules 
(clones)
• Clones are typically generated by placing a DNA 
fragment of interest into a vector DNA molecule, 
which can replicate in a host cell 
• When a single vector containing a single DNA 
fragment is introduced into a host cell, large numbers 
of the fragment are reproduced along with the vector

   
Plasmid vectors have an ori, a resistance marker
 and a multi­cloning site (polylinker)

   
   
Cloning is a 2 step process: 1) integrate DNA
 fragment into vector…

   
 …and 2) transform E.coli to multiply DNA

   
   
Identical E.coli clones carry identical (cloned) DNA

Usually great to clone short fragment of a few kb
   
Complementary DNA (cDNA) libraries 
are prepared from isolated mRNAs

   
 Preparation of a cDNA library

   
   
   
   
   
 How do you identify a clone that
carries a specific gene?
   
 How will I obtain the sequence of my cDNA?
 The Sanger (dideoxy) method

   
   
 Sample printout from an automated sequencer

N = nucleotide cannot be assigned

   
Polymerase chain reaction: an alternative 
to cloning

• The polymerase chain reaction (PCR) can be used to 
amplify rare specific DNA sequences from a complex 
mixture when the ends of the sequence are known
• PCR comes in two flavors: 1) DNA template based, 
or 2) RNA template based (reverse transcriptase 
PCR)

….Kary Mullis, surfing father of PCR sold the technology
to Cetus for $10,000.  Cetus sold the technology  for a
stunning $300,000,000 a few years later…
Mullis received the Nobel Prize in 1993 and turned his back
  on both academia and industry.
 
 Polymerase chain reaction

thermostable
polymerase

   
PCR products can be cloned into vectors (e.g., for protein expression)

   
 Reverse transcriptase PCR
(can be used in clinic to probe patient sample for oral pathogens) 

Start with single stranded
template (mRNA)

RNase H

gene­specific primer

  add  second gene­specific primer
 
to amplify (by regular PCR)
Transposon mutagenesis

This strategy is widely used
to create mutants in bacteria
and allows for easy
identification of the
disrupted gene. 

   
What you need to know:
Definition of recombinant DNA (artificially ligated DNA fragment)
Purpose of restriction enzymes (cut DNA, naturally used in defense
against phages)
Definition of cloning (making lots of identical organisms/DNAs)
Requirements for cloning vectors (3: ori, selection marker, polylinker)
Principal of DNA sequencing (use ddNTPs to terminate chain extension)
Principal of PCR (use thermostable polymerase and specific primers to 
amplify a DNA fragment in multiple rounds of strand melting, primer
annealing, primer extension). Principle of transposon mutagenesis.
When to use PCR vs traditional cloning:
­ DNA sample is limited
­ some sequence information is available (there are thousands of bugs that
 have NOT been sequenced but play a role in human pathologies).
­in general, it is cheaper to create large amounts of recomb. DNA by cloning, 
 and bacterial enzymes have proofreading activities (PCR can create errors) 
Why would you want to know about cDNA cloning?
­gives you information on what sequences are expressed (transcribed and
 translated) rather than just encoded in the genome
   
­many drugs (e.g., insulin) are produced recombinantly (from cloned sequences)