Rôle de l’AICAR et l’interaction entre AICAR et l’autre

facteur de transcription chez Saccharomyces cerevisiae

Soutenance de stage
Le 29 août 2008

SANVITTAYAGUL Prongsagorn

Stage d’UE Expérience Professionnelle

Licence 3 SDV BCP
IBGC Institut de Biochimie et Génétique Cellulaire
Équipe Génétique des Réseaux Métaboliques (GRM)
JUIN-JUILLET 2008
Responsable : Marc LANDRY, Odile VIRATELLE
 PLAN
I. Le contexte et objectifs du stage
A. Équipe Génétique des Réseaux Métaboliques (GRM)
B. Biosynthèse des nucléotides puriques
C. Objectifs du stage

• Présentation du travail
A. Hypothèse et stratégie
B. Manipulations et Résultats

III. Discussion et conclusion

 PLAN
I. Le contexte et objectifs du stage
A. Équipe Génétique des Réseaux Métaboliques (GRM)
B. Biosynthèse des nucléotides puriques
C. Objectifs du stage

• Présentation du travail
A. Hypothèse et stratégie
B. Manipulations et Résultats

III. Discussion et conclusion

I. Le contexte et objectifs du stage
 A. Équipe Génétique des Réseaux Métaboliques (GRM)
Recherche fondamentale

• Régulation de voies métaboliques

chez la levure Saccharomyces cerevisiae

• Identification des signaux responsables

de la régulation transcriptionnelle
Institut de Biochimie et Génétique Cellulaire (IBGC)
• Réponse aux variations de
l'environnement des voies métaboliques
Responsable : Bertrand Daignan-Fornier
• Compréhension sur les bases
Chercheurs : 4 Cherchers
moléculaires de pathologies métaboliques
d'origine génétique
Post-doctorants : 1 post-doctorants
• Recherche sur le vieillissement cellulaire
ITA/IATOS : 2 personnels
et la mise en place de la polarité
Doctorants : 1 doctorants
B. Biosynthèse des nucléotides puriques
 Adénosine Guanosine

Voie de recyclage
Voie de novo
Travail pendant le stage
 C. Objectifs du stage

- Confirmer l’interaction et la fixation de AICAR sur Bas2p

- Trouver la séquence de la zone de fixation de AICAR sur Bas2p

ARN polymérase
Bas2p

AICAR Bas1p
Opérateur ADE17
 C. Objectifs du stage

- Confirmer l’interaction et la fixation de AICAR sur Bas2p

- Trouver la séquence de la zone de fixation de AICAR sur Bas2p

ARN polymérase
Bas2p

Bas1p
Opérateur ADE17
 C. Objectifs du stage

- Confirmer l’interaction et la fixation de AICAR sur Bas2p

- Trouver la séquence de la zone de fixation de AICAR sur Bas2p

ARN polymérase
Bas2p

Bas1p
Opérateur ADE17
 C. Objectifs du stage

- Confirmer l’interaction et la fixation de AICAR sur Bas2p

- Trouver la séquence de la zone de fixation de AICAR sur Bas2p

ARN polymérase

5’
Bas2p Transcription
Bas1p ARN
Opérateur ADE17

3’

Protéine ADE17 Traduction

 C. Objectifs du stage

- Confirmer l’interaction et la fixation de AICAR sur Bas2p

- Trouver la séquence de la zone de fixation de AICAR sur Bas2p

Bas2p

?
 C. Objectifs du stage

- Confirmer l’interaction et la fixation de AICAR sur Bas2p

- Trouver la séquence de la zone de fixation de AICAR sur Bas2p

?
?
Bas2p
? ?
?
?
 PLAN
I. Le contexte et objectifs du stage
A. Équipe Génétique des Réseaux Métaboliques (GRM)
B. Biosynthèse des nucléotides puriques
C. Objectifs du stage

• Présentation du travail
A. Hypothèse et stratégie
B. Manipulations et Résultats

III. Discussion et conclusion

II. Présentation du travail
 A. Hypothèse et stratégie

- Si Bas2p se fixe sur l’AICAR donc un mutant Bas2p qui fixe CAIR à la place d’AICAR
va être capable aussi d’activer la transcription du gène ADE 17 chez le mutant ade1
qui ne produit pas d’AICAR mais qui accumule le CAIR

Accumulation de CAIR
 A. Hypothèse et stratégie

- Si Bas2p se fixe sur l’AICAR donc un mutant Bas2p qui fixe CAIR à la place d’AICAR
va être capable aussi d’activer la transcription du gène ADE 17 chez le mutant ade1
qui ne produit pas d’AICAR mais qui accumule le CAIR

Mutant ade1∆ bas2∆

Y3455

Noyau
 A. Hypothèse et stratégie

- Si Bas2p se fixe sur l’AICAR donc un mutant Bas2p qui fixe CAIR à la place d’AICAR
va être capable aussi d’activer la transcription du gène ADE 17 chez le mutant ade1
qui ne produit pas d’AICAR mais qui accumule le CAIR

Bas2p sauvage

CAIR

Bas1p sauvage
 A. Hypothèse et stratégie

- Si Bas2p se fixe sur l’AICAR donc un mutant Bas2p qui fixe CAIR à la place d’AICAR
va être capable aussi d’activer la transcription du gène ADE 17 chez le mutant ade1
qui ne produit pas d’AICAR mais qui accumule le CAIR

CAIR ?
 A. Hypothèse et stratégie

- Si Bas2p se fixe sur l’AICAR donc un mutant Bas2p qui fixe CAIR à la place d’AICAR
va être capable aussi d’activer la transcription du gène ADE 17 chez le mutant ade1
qui ne produit pas d’AICAR mais qui accumule le CAIR

5’ Traduction
ARN
?
?
3’
Transcription
Protéine ADE17-LACZ
+
Test X-Gal

Colonie BLEU
 B. Manipulations et Résultats
PCR mutagenèse
- Taq polymérase
- 4 dNTP
mais concentration réduit
en G ou C et
en A ou T
- Amorce soit 1880-1881 ou
soit 1882-1883
- Plasmide P3455
- MgCl
- H2O

+ contrôle négatif sans ADN

 B. Manipulations et Résultats
PCR mutagenèse

BAS2

1880-1881
 B. Manipulations et Résultats
PCR mutagenèse

BAS2

1880-1881
 B. Manipulations et Résultats
PCR mutagenèse

BAS2

1882-1883
 B. Manipulations et Résultats
PCR mutagenèse

≈ 1600 pb
≈ 750 pb
 B. Manipulations et Résultats
Digestion
- Plasmide P3455
- Enzyme de restriction
soit Pfl232 + Pst1 ou
soit BamH1+ Pst1
- Tampon spécifique de l’enzyme
(1X)

+ contrôle négatif sans ADN

Pfl232 Pst1 BamH1

BAS2
 B. Manipulations et Résultats
Digestion

≈ 1600 pb

≈ 750 pb
 B. Manipulations et Résultats
Transformation et « GAP repair»

- Transformation par acétate de lithium (LiCH3COO)

- Choc thermique 45°C 30 minute
- Transformation des fragment PCR et des plasmides digérés
soit P3455 coupée/Pfl232 + Pst1 et fragment PCR 1880+1881
soit P3455 coupée/BamH1+ PST1 et fragment PCR 1882+1883

+ contrôle
- Sans ADN
- Plasmide sauvage(P3455)
- Fragments PCR seul
- Plasmides coupés seul
 B. Manipulations et Résultats
Transformation et « GAP repair»

-Leu -Ura -Leu -Ura

Laisser pousser pendant 48h

Réplique 2 copies chacun

 B. Manipulations et Résultats
Transformation et « GAP repair»

P3455 coupée/BamH1+ PST1

et fragment PCR 1882+1883

P3455 coupée/Pfl232 + Pst1

et fragment PCR 1880+1881
 B. Manipulations et Résultats
Transformation et « GAP repair»
EX. P3455 coupée/BamH1+ PST1 et fragment PCR 1882+1883

Pfl232 Pst1 BamH1

BAS2
 B. Manipulations et Résultats
Transformation et « GAP repair»
EX. P3455 coupée/BamH1+ PST1 et fragment PCR 1882+1883

Pfl232 Pst1 BamH1

BAS2
 B. Manipulations et Résultats
Transformation et « GAP repair»
EX. P3455 coupée/BamH1+ PST1 et fragment PCR 1882+1883

BAS2
 B. Manipulations et Résultats
Transformation et « GAP repair»
EX. P3455 coupée/BamH1+ PST1 et fragment PCR 1882+1883

BAS2
 B. Manipulations et Résultats
Transformation et « GAP repair»
EX. P3455 coupée/BamH1+ PST1 et fragment PCR 1882+1883

BAS2
 B. Manipulations et Résultats
Test X-Gal

Candidat de la souche Y3165

transformé par le PCR (1880-1881)
et le plasmide digéré (Pfl232+Pst1)
 B. Manipulations et Résultats
Isolation
 B. Manipulations et Résultats
Isolation
Isolée la colonie à partir des répliques

Cultivée dans la même milieu en liquide

Extraire des plasmides

Retransformer des plasmides dans E.coli

Étaler sur le milieu

LB +Amp + X-Gal
 B. Manipulations et Résultats
Isolation

Milieu LB + Amp + X-gal

 B. Manipulations et Résultats
Isolation

Extraire le plasmide ?
Et séquençage ?
 B. Manipulations et Résultats
Vérification
Cultivé chaque clone de bactéries dans un milieu liquide

Extraire le plasmide

Retransformer des plasmides dans la souche Y3155

Test X-Gal

Toutes les colonie sont blanc ! ! !

III. Discussion et conclusion
 Pourquoi Toutes les colonies sont blanc ?

- Faux positif
Hypothèse possible : Le plasmide P753 de souche de départ a subit une mutation
au niveau de l’opérateur du gène ADE17 pendant la
transformation

Expression constitutif

Colonie Bleu
 Conclusion

- Le résultat obtenu n’est pas conclusif

- La zone et la séquence de fixation de AICAR sur Bas2p

n’est pas encore trouvé

- Pour améliorer il vaut mieux d’avoir plusieurs candidats

qui sont bleu

- Et aussi qu’il vaut mieux de trouver la nouvelle technique pour

la transformation des levures car la technique actuelle est mutagène
 BIBLIOGRAPHIE

• Thèse n° 1054 université Bordeaux II (2003), K. Rébora. Régulation de la

voie de biosynthèse de l’AMP et co-régulation avec la voie de biosynthèse de
l’histidine chez la levure Saccharomyces cerevisae.

• K. Rébora, B. Laloo and B. Daignan-Fornier. 2005. Revisiting Purine-

Histidine Cross-Pathway Regulation in Saccharomyces cerevisae: A central
Role for a small molecule. Genet. 170: 61-70.

• Nucleic Acids Research, Vol. 20. No. 14, K. Robzyk, Y. Kassir. 1992.
A simple and highly efficient procedure for rescuing autonomous plasmids
from yeast.

• A. Oulmouden, D. Delourme, A. Maftah, Jean-Michel. P., R. Julien.

Génétique, DUNOD.
FIN