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Metodologas para la determinacin estructural

de frmacos y el estudio de fenmenos de
reconocimiento molecular



Programa de doctorado en Qumica Mdica
Escalas de tiempo en RMN

Gema Domnguez Martn



USP-CEU
2 USP-CEU
Escalas de tiempo en RMN




Procesos de relajacin. Relajacin espn-red. Relajacin espn-
espn. Determinacin de T1. Determinacin de T2, secuencia
de eco de espn. Tcnicas de doble resonancia.
Deacoplamiento homonuclear. Desacoplamiento heteronuclear.
Espectros editados utilizando secuencias de eco de espn:
modulacin por la constante de acoplamiento (SEFT y APT).
Transferencia de polarizacin por irradiacin selectiva (SPT).
Transferencia de polarizacin por inversin de poblacin (SPI).
Experimento INEPT. Experimento DEPT.
3 USP-CEU
Procesos de relajacin


En un campo magntico esttico B0, la magnetizacin longitudinal Mz (en el
eje z) crece progresivamente desde cero hasta un valor mximo M0. En ese
momento el sistema habr alcanzado el equilibrio trmodinmico y la
ocupacin de los niveles vendr gobernada por la estadstica de Boltzman: el
estado de espn (es decir, aquel orientado como el campo B0) estar ms
poblado que el estado de espn -, por lo que aparecer una magnetizacin
M0.
4 USP-CEU
Procesos de relajacin


Si en esta situacin aplicamos un pulso de radiofrecuencia de duracin t a la
frecuencia de resonancia, la muestra se ver afectada por la accin de un
nuevo campo magntico dependiente del tiempo B1(t).
El sistema absorbe energa provocando un aumento del nmero de estados
con espn - y una disminucin del nmero de estados con espn .
Se produce una prdida de
magnetizacin longitudinal
y un incremento de
magnetizacin transversal
5 USP-CEU
Procesos de relajacin


Tras aplicar un pulso de 90, el extremo del vector (vector de magnetizacin)
desciende hacia el plano transversal xy describiendo una espiral y los
protones adquieren la misma fase apareciendo la magnetizacin transversal
(Mt)
6 USP-CEU
Procesos de relajacin
7 USP-CEU
Procesos de relajacin


Si se aplica un pulso de 180, los protones no se detienen en el plano
transversal, continan su movimiento en espiral volvindose a desfasar y
aparece un componente negativo de la imantacin longitudinal (-Ml).
8
Procesos de relajacin



Cuando finaliza el pulso de radiofrecuencia (RF) se necesita un tiempo para
que la magnetizacin vuelva a alcanzar el equilibrio. Debido a que en RMN la
emisin espontnea es muy poco efectiva, el retorno al equilibrio se logra a
travs de los procesos de relajacin .

Procesos de relajacin (PR): Diferentes tipos de transiciones sin radiacin
mediante los cuales un ncleo en un estado de espn excitado vuelve al
estado inferior o fundamental.

Los procesos de relajacin se dividen en dos categoras:

- Relajacin espn-red (o longitudinal), en la misma direccin que
el campo aplicado.

- Relajacin espn-espn (o transversal), perpendicular a la direccin
del campo.




USP-CEU
9 USP-CEU
Procesos de relajacin


Durante la relajacin, el vector de cada protn regresa desde el plano
transversal a su posicin original recorriendo a la inversa la misma espiral
pero a una velocidad de precesin diferente en funcin del tipo de protn.





En primer lugar, los espines se desfasan
mientras precesionan hasta que la
distribucin es uniforme. Por consiguiente,
la magnetizacin transversal decrece
progresivamente hasta cero.

En segundo lugar, la desexcitacin de un
gran nmero de espines reestablece la
magnetizacin longitudinal Mz hasta su
valor en el equilibrio trmico M0.
10
Procesos de relajacin




Cada proceso de relajacin ocurre en un periodo de tiempo determinado,
denominados tiempo de relajacin longitudinal y tiempo de relajacin
transversal, T1 y T2, respectivamente (o sus recprocos, las velocidades
especficas de relajacin longitudinal y transversal R1 y R2).




Los procesos de relajacin determinan la anchura de la seal. El principio de
incertidumbre de Heissenberg demuestra que la anchura natural de una
banda es inversamente proporcional al tiempo medio que el sistema
permanece en el estado excitado.




Desde un punto de vista operativo, la velocidad de relajacin determina el
tiempo que tenemos que esperar para que dos medidas consecutivas
realizadas sobre el mismo sistema sean realmente idnticas o la intensidad y
la velocidad de repeticin mximas de los pulsos que no cause saturacin.


USP-CEU
11 USP-CEU
Relajacin espn-red, espn-retculo o longitudinal




La relajacin espn-red es conjunto de procesos mediante los que se
recupera la magnetizacin longitudinal perdida tras el pulso de
radiofrecuencia y se alcanza la magnetizacin del equilibrio termodinmico
(M0).
La interaccin entre los espines nucleares en estado excitado y los campos
magnticos fluctuantes generados por el entorno molecular o retculo
devuelve el espn excitado al estado fundamental desprendiendo calor.

La constante de tiempo que regula este proceso se denomina tiempo de
relajacin longitudinal T1.

La relajacin espn-red, que depende de la movilidad del retculo, es
relativamente eficiente en los lquidos (T1 del orden de 1s), pero no lo es en
los lquidos viscosos y en los slidos cristalinos donde las movilidades son
bajas, en esos casos T1 suele ser grande (T1 del orden de 102s).

T1 disminuye a temperaturas elevadas porque aumenta la movilidad del
sistema.
12 USP-CEU
Relajacin espn-espn o transversal




La relajacin transversal es conjunto de procesos mediante los que la
magnetizacin transversal decae hasta prcticamente cero tras un pulso de
radiofrecuencia

En la relajacin transversal o espn-espn los espines nucleares dejan de
precesionar perdiendo la magnetizacin transversal (en el plano xy).

Este desfase est producido por tres fenmenos:

La interaccin dipolar entre un espn en su estado excitado y otro
espn del mismo tipo en su estado fundamental, el espn excitado
retorna al estado fundamental transfiriendo energa al otro espn que
sufre la transicin al estado excitado.

Desplazamiento qumico: los ncleos con diferente desplazamiento
precesan a diferentes frecuencias.

Inhomogeneidades en el campo magntico externo: ncleos bajo
diferentes valores del campo magntico externo precesan a diferentes
frecuencias.
13 USP-CEU
Relajacin espn-espn o transversal




La componente esttica (paralela a B0) no interviene en la relajacin. Vara
de un ncleo a otro bajo el efecto de los campos producidos por los otros
ncleos.

Componente giratoria: si hay 2 ncleos vecinos de igual naturaleza,
experimentarn mutuamente la accin de estas componentes giratorias y se
pueden inducir transiciones entre las diferentes orientaciones de los espines
nucleares. Ambos ncleos podrn interactuar intercambiando energa entre
ellos. Este proceso se denomina inversin mutua de espines o flip-flop.
USP-CEU 14
T2 pequeo
relajacin rpida
T2 grande
relajacin lenta
Relajacin espn-espn o transversal

La interaccin entre espines no cambia la poblacin neta del estado excitado
porque las poblaciones N1 y N2 no se ven modificadas, pero que la duracin
de vida del ncleo en el estado excitado disminuye y en consecuencia la
seal se ensancha.

Este fenmeno, que es irreversible, se caracteriza por un tiempo de
relajacin transversal T2.

En molculas pequeas normalmente T2 T1 (tiempo largo de
reestablecimiento del equilibrio). En molculas grandes T1 >>> T2.
= 1 / T*2
15 USP-CEU
Ih
Transverse T2
Relaxation
Longitudinal
T1Relaxation
Relaxation Longitudinal and transverse

NET
Magnetization
Magnetic
field
Randomization in XY plane:
Magnetization Decays





A 90 pulse flips the
z-magnetization to xy-plane
CLICK !
Random
Alignment..
t
16 USP-CEU
Anchura de las bandas

Normalmente, T2 condiciona la anchura de la seal.

Sin embargo, en ciertos casos las seales se ensanchan de forma marcada
al producirse un descenso muy acentuado de T1:

- La presencia de electrones desapareados (radicales). Los radicales
orgnicos, el oxgeno molecular (dirradical) o las sales de metales de
transicin (iones paramagnticos) producen ensanchamiento de las seales.

- La presencia de ncleos cuadrupolares (I > ), como el 14N, puede
producir tambin ensanchamientos en las seales de ncleos vecinos no
cuadrupolares. As los protones unidos a un 14N (Q = 1) o en posiciones
prximas, dan lugar a seales notablemente ms anchas que el resto de los
protones de la molcula.
Estado
fsico
Relajacin
espn-red
Relajacin
espn-espn
Caractersticas
Lquido Eficiente
T1
Pocoeficiente
T2
Sealesfinasenelespectro.
Rpidarestauracindel
equilibriotrmico
Slido Pocoeficiente
T1
Eficiente
T2
Sealesanchasenelespectro.
Muylentarecuperacindel
equilibriotrmico(saturacin)
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Una relajacin espn-red eficaz es una condicin necesaria para que exista
una distribucin en los niveles de espn que no alcance la saturacin y as
poder observar la seal de absorcin de radiofrecuencia de una manera
continua.

En la prctica esa condicin no siempre se cumple y entonces la seal
disminuye con el tiempo llegando incluso a desaparecer.


USP-CEU
18
Procesos de relajacin: Determinacin de T1 y T2




Los tiempos de relajacin T1 y T2 nos van a proporcionar una valiosa
informacin sobre la muestra, debido a que estn asociados a procesos
relacionados tanto con la interaccin entre los espines nucleares y sus
entornos moleculares (T1) como con las interacciones entre los propios
espines nucleares (T2).

Nos van a permitir la utilizacin ptima del tiempo disponible para acumular
los espectros y optimizar experimentos como el NOE o el STD que estn
basados en la relajacin.

T1 se determina usando secuencias multipulso, es decir, se generan varios
pulsos de radiofrecuencias separados por intervalos de tiempo determinados.
Para T1 se utilizan dos secuencias diferentes:

Tcnica de recuperacin de saturacin.

Tcnica de recuperacin de la inversin

T2 se determina mediante los multipulsos de eco de espn.
USP-CEU
19 USP-CEU
Procesos de relajacin: Determinacin de T1 y T2



Un pulso de radiofrecuencias equivale a la irradiacin simultnea de un
determinado rango de frecuencias y tambin a aplicar un campo magntico a la
muestra, dada la relacin entre frecuencia y campo:
Las secuencias de pulsos son una serie de eventos (bsicamente pulsos de
radiofrecuencia separados por periodos de tiempos o delays) aplicados en el
tiempo de modo secuencial, ordenado y predefinido, que provocan una
modificacin especfica sobre el estado de los espines que luego se pueden
relacionar con algn parmetro molecular a partir del anlisis del espectro de
RMN resultante.


Pulso de 90 iguala las poblaciones
Pulso de 180 invierte las poblaciones
= B0(1 - ()

2
20 USP-CEU
Determinacin experimental de T1.
Experimento de recuperacin de la inversin



Se aplica un pulso inicial de 180 que invierte la magnetizacin y los niveles
poblacionales de la transicin sobre la que acta. Durante el intervalo de
tiempo siguiente se produce relajacin longitudinal cuya magnitud depende
de la duracin de dicho intervalo. Como la magnetizatin en el eje z no es
detectable, se aplica un pulso final de 90 para dirigir el vector de
magnetizacin hacia el plano xy y as pueda ser detectado.
valor de T1 para las distintas seales en el espectro.




Segn el intervalo que usemos veremos seales cuya intensidad vara en
funcin del tiempo de relajacin T1.
Repitiendo el experimento a diferentes valores de puede determinarse el
21 USP-CEU
Segn el intervalo que
usemos veremos seales cuya
intensidad vara en funcin del
tiempo de relajacin T1.

Repitiendo el experimento a
diferentes valores de se
puede determinar el valor de T1
para las distintas seales en el
espectro.
y
(= 0
z
y
(> 0
z
y
(>> 0
y
z
y
z
y
Determinacin experimental de T1.
Experimento de recuperacin de la inversin

z

x TF
x 90
x 90
x 90 x TF
x TF
180


z
22 USP-CEU
Procesos de relajacin: Determinacin de T1
Recuperacin de la inversin
Secuencia: 180 - - 90 - Adquisicin
23 USP-CEU
Procesos de relajacin: Determinacin de T1
Recuperacin de la saturacin
Secuencia: 90 - - 90 - Adquisicin
Se usan secuencias de dos pulsos de 90
separados por un tiempo ( determinado.

El primer pulso tumba la magnetizacin al
plano xy, es decir anula Mz, luego se deja
que la magnetizacin se recupere durante
un tiempo y finalmente se vuelve a tumbar
al plano xy para poder medirla (el
espectrmetro mide la componente x).

Variando el tiempo ( se obtienen puntos
que se ajustan a una exponencial
T1 como decreciente, obteniendo
parmetro del ajuste.
24 USP-CEU
Experimento de recuperacin de la inversin para evaluar los tiempos de
relajacin longitudinales de 13C en H2O
Espectros con = 1-12s y 50s. El C4 tiene una relajacin
longitudinal ms efectiva que los otros carbonos.
25 USP-CEU

Si el tiempo de espera entre pulsos (irradiacin) es demasiado rpido la
magnetizacin no se recuperar entre una irradiacin y la siguiente, la seal
se atenuar y en casos extremos puede desaparecer.
En una medida donde no se permite relajacin total entre pulso y pulso las
seales de ncleos de mayor T1 (por ejemplo, 13C cuaternarios o carbonilos)
tendrn menor intensidad que los de menor T1 (CH y CH2).
26 USP-CEU
Determinacin experimental de T2.
Eco de espines



El campo magntico creado por el imn no es totalmente homogneo. Las
desviaciones de la homogeneidad hacen que los ncleos "sientan" un campo
ligeramente distinto en funcin de su situacin en el tubo de muestra. As,
los vectores magnticos de los ncleos individuales, que componen la
magnetizacin transversal del plano xy, se abrirn en abanico, disminuyendo
la intensidad de este tipo de magnetizacin.

En principio la evaluacin de T2 podra realizarse mediante la medicin de la
anchura de las seales a altura media, pero en la prctica este parmetro
est dominado por las inhomogeneidades del campo magntico, que es de
carcter instrumental.

El ancho de la seal se asocia entonces con el valor de T2 efectivo, T2*,

(T2* T2).

Para evaluar al tiempo de relajacin transversal T2, eliminando el efecto de
las inhomogeneidades del campo B0, se hace uso de la tcnica del eco de
espines desarrollada por Hahn en 1950.
27
Determinacin experimental de T2.
Eco de espines



La secuencia de pulsos del eco de espines o de Hahn se muestra en la
siguiente figura:
Se aplica un primer pulso de 90 en x (para hacer bascular el vector de
magnetizacin longitudinal al plano transversal) seguido de un tiempo (,
posteriormente se aplican conjuntos formados por pulsos de 180 en y o en x
(el pulso de 180 reenfoca los espines desfasados) seguidos de intervalos
de tiempo 2(.

USP-CEU
28 USP-CEU
Determinacin experimental de T2.
Eco de espines
Veamos lo que ocurre
despus del pulso de 90:
z
x
y
x
y
o
x
y
(
y




x



reenfoque



z
y
(
















o
x















x
y















y
desfase





180














AQ
Volvemos a las coordenadas xyz:
29 USP-CEU
Determinacin experimental de T2.
Eco de espines



Si adquirimos la FID justo despus del eco, la intensidad de la seal slo
estar afectada por T2 y no por las inhomogeneidades del campo B0.
Mxy(t) = Mxy(0) e-(/T2
evolucin deteccin
eco
30 USP-CEU
Determinacin experimental de T2.
Eco de espines
N N a 90oC
Mxy(t) = Mxy(0) e-(/T2
reenfoque del
acoplamiento 31
Eco de espn y acoplamientos heteronucleares




El eco de espines reenfoca la evolucin del desplazamiento qumico, si el pulso
inicial de 90 para un ncleo determinado est ligeramente fuera de resonancia, el
pulso de 180 lo reenfoca:
Tambin reenfoca los efectos del acoplamiento heteronuclear, el pulso de 180
slo afecta al 13C:
32
Eco de espn y acoplamientos homonucleares




El eco de espines no reenfoca los efectos del acoplamiento homonuclear. El
pulso de 180 no selectivo, afecta tanto a los dos ncleos involucrados en el
acoplamiento como a los espines de su pareja de acoplamiento:
evolucin del
acoplamiento


La secuencia de eco de espines se utiliza en diferentes experimentos
multipulsos y multidimensionales. La secuencia elimina la evolucin de los
desplazamientos qumicos y/o los acoplamientos heteronucleares.





USP-CEU
33 USP-CEU
Tcnicas de doble resonancia




Las tcnicas de doble resonancia consisten, en trminos generales, en la
irradiacin de la muestra con una frecuencia determinada (por ejemplo la de un
protn o la de todos los protones) y al mismo tiempo registrar el espectro de la
muestra de forma convencional, con lo que el espectro aparecer como si dicho
protn no existiera y por tanto desaparecern los acoplamiento con l.

Las tcnicas de doble resonancia son una herramienta importante para:

- Simplificar el espectro

- Determinar la posicin relativa de los protones de una molcula

- Localizar absorciones ocultas por otras

Desacoplamiento homonuclear: se usa fundamentalmente en 1H-RMN para
desacoplar unos protones de otros.

Desacoplamiento heteronuclear: se utiliza fundamentalmente en 13C-RMN
donde los espectros se realizan con desacoplamiento protnico, lo cual
simplifica enormemente los espectros al no observarse acoplamientos 13C-1H.
USP-CEU 34
Desacoplamiento Homonuclear. Desacoplamiento espn-espn

Se irradia a la frecuencia de un protn determinado (en el centro de la seal si se
trata de un multiplete) y se registra el espectro de protones.

Los acoplamientos del protn irradiado con el resto de los protones de la
molcula desaparecen, el espectro se suele simplificar bastante y las
asignaciones se pueden realizar de una manera ms eficaz.

Ejemplo: desacoplamiento homonuclear en la 3-aminoacrolena




La irradiacin en el centro del
doblete a 8.5 ppm (COH) hace
que se simplifique la seal a
5,25 ppm (que queda como un
doblete) y por tanto sta debe
corresponder a la seal del
protn vecino al grupo aldehdo,
de igual modo, la irradiacin del
protn olefnico a 7,3 ppm hace
que tambin se simplifique la
seal a 5.25 ppm.
35 USP-CEU
Como resultado desaparecen los acoplamientos 13C-1H y las seales de 13C
aparecen como singletes con una intensidad mayor.

El inconveniente es que se pierde informacin sobre las constantes de
acoplamiento 13C-1H.
Desacoplamiento Heteronuclear. Desacoplamiento de banda ancha




El desacoplamiento de hidrgeno de banda ancha (BB decoupling) es otra
tcnica de Doble Resonancia.

Se irradia con una potencia elevada una banda de frecuencias que abarque el
intervalo completo de desplazamiento de todos los protones. Para lograrlo, se
modula la frecuencia del desacoplador mediante ruido de baja frecuencia.

As, los ncleos de 1H acoplados cambian de forma tan rpida la orientacin de
sus espines que los 13C acoplados con ellos, slo ven un valor promedio que
es nulo.
36 USP-CEU
Ejemplo: espectro de 13C RMN desacoplado del adamantano.
Mientras que el triplete a
~ 30 ppm es fcilmente
identificable como un CH2,
en el resto de las las
seales los multipletes
estn solapados.
El espectro de 13C RMN
desacoplado muestra
claramente la existencia
de tres tipos de carbonos
37 USP-CEU
Desacoplamiento Heteronuclear. Desacoplamiento off resonance



Si se irradia en una zona muy cercana a la frecuencia de resonancia de los
protones sin coincidir exactamente con sta, lo que se obtiene es un espectro
que denominamos de off resonance.

Las seales aparecen como multipletes pero con una disminucin significativa de
las JCH, no hay tanto solapamiento de seales como en el espectro acoplado.
Ventajas: sabemos el tipo de carbono que es cada una de las seales (metilo,
metileno, metino o carbono cuaternario) dependiendo de la multiplicidad que
presenten las mismas, informacin que se pierde en el espectro desacoplado o
BB.

Inconvenientes: los desdoblamientos no son siempre suficientemente claros, y si
en un intervalo estrecho de desplazamiento qumico aparecen muchas seales
de carbonos se producen solapamientos que dificultan la identificacin de los
multipletes.
38 USP-CEU
Ejemplo: espectro de 13C RMN off resonance del propanol.
En rojo se representan las 1J
del espectro de 13C acoplado
39 USP-CEU
Espectros editados utilizando secuencias de eco de espn: modulacin
por la constante de acoplamiento (SEFT y APT).




Existen diferentes mtodos, basados en la tcnica del eco de espines o en la
transferencia de polarizacin, que permiten editar un espectro 1D del espn
heteronuclear X (13C o 15N), y que suministran informacin sobre el nmero
de hidrgenos unidos al heterotomo (SEFT, APT, INEPT, DEPT).

La informacin no se extrae de acoplamientos residuales, sino de la
intensidad de las seales que podrn ser positivas, negativas o nulas. Este
efecto se consigue mediante experimentos modulados a travs de J.
La tcnica SEFT (Spin-Echo Fourier Transform) es una de las
aproximaciones ms simples para determinar el nmero de hidrgenos
unidos directamente a cada carbono.
40 USP-CEU
Secuencia de pulsos SEFT
( =1/1J CH
41 USP-CEU
Tcnica del Spin-Echo Fourier Transform (SEFT)




Durante el periodo de evolucin los diferentes componentes de los
multipletes de carbono precesan a sus frecuencias individuales.

La intensidad de las seales est modulada por la evolucin del
acoplamiento heteronuclear (JCH) durante el primer intervalo (. Durante el
segundo intervalo el acoplamiento heteronuclear no evoluciona pues
estamos desacoplando a los protones. Por eso, las seales del espectro de
13C aparecen como singletes.

El pulso de 180 reenfoca los desplazamientos qumicos.

El xito del experimento depende de lo estrecho que sea el intervalo de
valores de 1JCH, lo que constituye una limitacin importante de esta tcnica.
42 USP-CEU
Secuencia SEFT

Evolucin de los vectores de magnetizacin del carbono bajo la influencia
del acoplamiento protn-carbono:
43 USP-CEU
Secuencia SEFT




Espectro de 13C-RMN del alcanfor:

a) espectro convencional (no se muestra la seal del carbonilo)

b) ( = 1/J (\ = 180)
c) ( = 1/2J (\ = 90)
C
CH2
CH CH3
slo aparecen seales de C y CH2
O


3CH3, 3CH2, 1CH, 2C
44 USP-CEU
Tcnica del Attached Proton Test (APT)




La tcnica APT tambin permite determinar el nmero de hidrgenos unidos
directamente a cada carbono lo que facilita la asignacin de espectros de
13C RMN.

El periodo de evolucin suele ser 1/ 1JCH, de este modo las seales de los
CH y CH3 aparecen como picos positivos mientras que los CH2 y carbonos
cuaternarios son negativos.

Secuencia APT:
45 USP-CEU
Espectro APT del acetato de colesterilo en CDCl3
46 USP-CEU
13C
Transferencia de polarizacin (TP)




y 15N: poca abundancia natural y sensibilidad reducida en RMN.
Los ncleos poco sensibles muestran bajas intensidades de seal debido a la
escasa diferencia de ocupacin de los dos estados nucleares en la inversin de
espn.

Transferencia de polarizacin: transferencia del exceso de poblacin de un
ncleo sensible (1H) a ncleos menos sensibles (13C, 15N) antes de perturbarlos.

Se logra que las transiciones (absorciones y emisiones) del ncleo poco sensible
se intensifiquen.
47
Transferencia de Polarizacin por irradiacin Selectiva (SPT).

Caso homonuclear

Para este diagrama usamos dos 1H que estn ligeramente acoplados y
tienen una diferencia grande de '. Se denominan I y S, con un se indica el
el exceso de poblacin de un estado a otro:
Ahora irradiamos y saturamos selectivamente una sola de las transiciones
con un pulso de 90 (la 1,3 de I). Despus de un tiempo, las poblaciones de
esa transicin se igualan y se modifica la intensidad de las transiciones que
dependen de estas diferencias de poblacin :




SPT





USP-CEU
48
Transferencia de Polarizacin por irradiacin Selectiva (SPT).

Caso heteronuclear




A pesar de que podemos usar las secuencias SPT y SPI para identificar
espines en regiones muy complicadas de un espectro 1H, la TP
homonuclear no es tan til como la TP heteronuclear.

El efecto que tiene la saturacin o inversin de una de las transiciones de un
ncleo sobre la distribucin de las intensidades en la seal de otro ncleo
acoplado con aqul es mucho ms significativo en el caso heteronuclear.

En el caso de un grupo 13C-1H (cloroformo), las diferencias de poblacin de
los niveles son ms complejas que en el caso homonuclear.

Si tenemos en cuenta los valores de razones giromagnticas (1H/13C 4),
las diferencias de poblacin corresponden a la relacin 10:8:2:0



USP-CEU
49 USP-CEU
Transferencia de Polarizacin por irradiacin Selectiva (SPT).

Caso heteronuclear
SPT (pulso de 90 sobre la transicin 1,2 de 1H)
50 USP-CEU
SPI: (pulso de 180
sobre transicin 1,3)
Transferencia de Polarizacin por Inversin de poblacin (SPI).

Caso homonuclear

Efectos ms drsticos pueden obtenerse aplicando pulsos selectivos de 180,
los que producen inversin de poblacin entre los estados involucrados en la
transicin, tal como se muestra en la figura:
51 USP-CEU
b
a
OEt
Ha
O



Hb
En este caso se invierte
cada lnea de los protones
olefnicos a y b. Vemos
como las intensidades de
las otras lneas varan.
Ejemplo de secuencia SPI
52 USP-CEU
Transferencia de Polarizacin por Inversin de poblacin (SPI).
Caso heteronuclear.

En la figura se muestra el diagrama de niveles correspondientes al sistema
CH. El doblete del hidrgeno tiene lneas 4 veces ms intensas que el
doblete del carbono.
53 USP-CEU
Transferencia de Polarizacin por Inversin de Poblacin (SPI).
Caso heteronuclear
+ 10 +8
-6 -8
+2 +2
Al manipular las poblaciones de los protones,
la seal de 13C se intensifica cuatro veces
(considerando seales positivas y negativas).
SPI (pulso de 180
sobre la transicin 1,2)
54 USP-CEU
Experimento INEPT (Insensitive Nuclei Enhanced

by Polarization Transfer)




La tcnica INEPT (Morris, Freeman, 1979) est diseada para transferir
polarizacin a travs del acoplamiento 1H-13C a un enlace.
55
Secuencia INEPT
Si J = 125 Hz, ( es 2 ms


De 2 a 7 se representan las magnetizaciones protnicas.
En 8 la magnetizacin de 13C despus de la transferencia de polarizacin. USP-CEU
56 USP-CEU
Secuencia INEPT

Tras el ltimo pulso de 90y en 1H la magnetizacin MHC se encuentra invertida
con respecto a MHC( . La magnetizacin debida a 13C se habr incrementado en
una proporcin de -6 en sentido negativo y de 10 en sentido positivo.

MHC(
MHC
El ltimo pulso de 90x en 13C hace que la seal se vuelva observable al rotarla
hacia el eje y. La informacin obtenida es la misma que la del experimento SPI,
pero se evita utilizar pulsos selectivos.
57 USP-CEU
Experimento INEPT
Ejemplo:
58 USP-CEU
Experimento INEPT Reenfocado




Para eliminar los acoplamientos carbono-protn en el espectro sin cancelar las
seales, es necesario aadir a la secuencia de pulsos INEPT normal dos
pulsos de 180 (para reenfocar) y dos tiempos de espera ( = 1/8J ) en ambos
ncleos despus de los dos ltimos pulsos de 90 y posteriormente adquirir y
desacoplar.

Con este experimento se obtiene una seal completamente desacoplada, en
fase y amplificada por la transferencia de polarizacin.
Secuencia de
pulsos INEPT
reenfocado
59 USP-CEU
Experimento INEPT Reenfocado




Dependiendo del tipo de carbono se utilizan diferentes :




CH = 1/4J (~ 1.79 ms); CH2 = 1/8J (~ 0.89 ms); CH3 = 1/8J




Se necesita una situacin de compromiso, en la prctica suele usarse:




= 3/8J (~ 2.68 ms)




La limitacin principal de la tcnica INEPT radica en su sensibilidad al ajuste
del intervalo . En sistemas con una variacin apreciable de 1JCH, por ejemplo,
en presencia de carbonos con diferente hibridacin, pueden presentarse
problemas con la intensidad y con el signo de las seales.
60 USP-CEU
Secuencia INEPT
61 USP-CEU
Experimento INEPT

Reenfocado




Ejemplo:
62 USP-CEU
Experimento DEPT (Distortionless Enhancement

by Polarization Transfer)




El experimento DEPT (Bendall, Doddrell, Pegg 1981) es la tcnica de edicin
espectral actualmente ms utilizada.

Tambin est basado en la Transferencia de Polarizacin.

Presenta una menor sensibilidad a las variaciones de 1J CH que la tcnica
INEPT, utiliza una secuencia de pulsos ms corta y menos sensible a los
errores que se producen al introducir en el programa parmetros como la achura
de pulso o los delays (dependientes de las constantes de acoplamiento).

Secuencia de pulsos DEPT:
63 USP-CEU
Experimento DEPT (Distortionless Enhancement

by Polarization Transfer)




Se pueden obtener espectros DEPT en los que solamente aparecen las seales
de CH, CH2 o CH3.
Hay que realizar tres espectros DEPT diferentes.

Un espectro DEPT con = 135 muestra a los grupos CH3 y CH como seales
positivas y a los CH2 como seales negativas.
Cuando sea necesario diferenciar grupos CH3 de grupos CH se puede repetir el
experimento con = 90 que slo muestra los grupos CH.

El experimento con = 45 muestra a todos los carbonos hidrogenados como
seales positivas.

Los carbonos cuaternarios se obtienen por diferencia del espectro normal de 13C
desacoplado.
USP-CEU 64 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 60
f1 ppm
13C desacoplado
O
Me H
pulegona
DEPT 135: CH, CH3

CH2
DEPT 90 slo CH
65 USP-CEU

INEPT/DEPT


Para la determinacin de la multiplicidad de los carbonos y para editar
espectros normalmente se utiliza el experimento DEPT (Distortionless
Enhancement by Polarisation Transfer).

La secuencia DEPT es menos sensible que la INEPT a las variaciones
del valor de las JCH porque | es independiente de J. En el el espectro
INEPT ocurren distorsiones cuando en la molcula hay diferentes tipos
de JCH. Por ejemplo: JCH aliftica= 110-130Hz, JCH aromtica= 160-
180Hz. La solucin de compromiso JCH ~ 145 Hz presenta un error del
20%.

La secuencia DEPT genera los multipletes en fase (adquisicin sin
desacoplamiento) con un patrn regular de intensidades, mientras que
la secuencia INEPT bsica genera los multipletes en antifase.
66 USP-CEU
INEPT/DEPT








El experimento INEPT es superior al DEPT en la transferencia de
polarizacin entre ncleos y se usa habitualmente como secuencia bsica
en los experimentos 2D heteronucleares (HSQC).

La secuencia INEPT es ms conveniente en experimentos a baja
temperatura o para muestras con pesos moleculares altos (T2 pequeo)