4.

ENSAIOS MICROBIOLGICOS PARA PRODUTOS NO ESTREIS

CONTAMINAO MICROBIANA

Alteraes nas propriedades: - fsicas e qumicas e, - riscos de infeces

ANLISE DA QUALIDADE MICROBIANA DE PRODUTOS NO ESTREIS

Produtos cosmticos farmacuticos tpicos e orais

Carga microbiana presente no produto

Qualitativo ou quantitativo No pode comprometer: - Qualidade final do produto e, - Segurana do paciente

Objetivos da anlise: 1. Determinar o nmero de microrganismos viveis; 2. Comprovar a ausncia de microrganismos patognicos

 Portaria no.6 de 31.01.1995 (MS)

Norma Tcnica para Registro de Fitoterpicos Pesquisa de contaminantes microbiolgicos Farmacopia Brasileira ou recomendaes da Organizao Mundial da Sade.

1. PADRES MICROBIANOS

RDC N. 49, DE 23 DE NOVEMBRO DE 2010 Aprova a Farmacopeia Brasileira, 5 edio, v.1, 2010.

4.1. Limites microbianos para produtos no estreis

produtos sintticos e biolgicos
Via administrao Contagem total de bactrias aerbicas UFC/g / mL 102 103 Contagem total de fungos/leveduras UFC/g/mL 101 102 Pesquisa de patgenos em 1 g/mL Ausncia de Escherichia coli Idem

Preparao aquosa para uso oral Preparao no aquosa para uso oral Preparao para uso retal Preparao uso tpico (oromucosa, nasal, gengival, cutneo, auricular)

103 102

102 101

Ausncia de Staph. Aureus, Pseudomonas aeruginosa

Via administrao

Contagem total de bactrias aerbicas UFC/g/ mL 102

Contagem total de fungos/leveduras UFC/g/mL 101

Pesquisa de patgenos em 1 g/mL Ausncia de Staph. aureus, Pseudomonas aeruginosa e bactria Gram negativa bile tolerantea Ausncia de Staph. aureus , Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans

Inalatrios

Preparao vaginal

102

101

 Produtos de origem vegetal, mineral e/ou animal

Via administrao Contagem total de bactrias aerbicas UFC/g/ mL Contagem total de fungos/leveduras UFC/g/mL Pesquisa de patgenos em 1 g/mL

Preparao para uso oral contendo matria-prima de origem natural

104

102

Ausncia de Esch. coli e Staph.aureus/ 1 g, ou mL. Ausncia de Salmonella em 10 g/mL. Limite mx. de 102 bactrias Gram negativa bile tolerante b
Ausncia de Salmonella spp e Esch.coli em 10g

Extrato seco

104

103

Via administrao

Contagem total de bactrias aerbicas UFC/g/ mL 107

Contagem total de fungos/leveduras UFC/g/mL

Pesquisa de patgenos em 1 g/mL

Drogas vegetais que sero submetidas a processos extrativos a quente

104

Limite mximo de 102 Esch.coli em 1 g. Limite mx. de 104 bactrias Gram negativa bile tolerante b em 1 g/ mL. Ausncia de Salmonella em 10 g -

Tintura, Extrato fluido

104

103

Cosmticos & Cosmecuticos

A) COSMTICOS =>intuito de limpar, perfumar boas condies, proteger ou mudar a sua aparncia. B) COSMECUTICOS =>ao cosmtica e teraputica

MATRIAS PRIMAS UTILIZADAS EM COSMETOLOGIA

GUA EXTRATOS BIOLGICOS

CORANTES
CONSERVANTES LCOOIS

 COMPOSTOS LIPDICOS COMPOSTOS GLICDICOS COMPOSTOS DE ORIGEM MINERAL

VITAMINAS
MATRIAS AROMTICAS

Produtos cosmticos aquosos

Shampoos Condicionadores Finalizadores Sabonetes lquidos Delineadores e Rmel Batom lquido

PRODUTOS COSMTICOS

Resoluo no. 481, de 23.09.1999, da Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Produtos cosmticos so subdivididos em 2 grupos: Tipo I e Tipo II

Tipo I:
- produtos para uso infantil, - para rea dos olhos - aqueles que entram em contato com a mucosa. Tipo II: - demais produtos susceptveis contaminao.

PADRO MICROBIOLGICO
Tipo I: > 102 UFC/g(mL) de microrganismos totais aerbicos; Ausncia de: - Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, totais e fecais em 1g(mL)

Coliformes

 Tipo II:
> 103 UFC/g(mL) de microrganismos totais aerbicos;

Ausncia de: - Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, - Coliformes totais e fecais em 1g(mL)

PRODUTOS FARMACUTICOS DE USO ORAL E TPICO

Cpsulas, comprimidos, suspenses, cremes, adesivos, etc. No tm como requerimento serem estreis Controle de contaminao microbiana

4.2. MTODOS DE ANLISE

MEDICAMENTOS NO ESTREIS E COSMTICOS

4 etapas
Amostragem, Coleta e transporte, Quantidade a ser analisada, Preparao da amostra

4.2.1. Amostragem: - Obter fraes da parte inferior, mediana e superior da embalagem

4.2.2. Coleta e transporte - Recipientes, esptulas ou pipetas esterilizados;

- Recipientes de boca larga com capacidade para 100g(mL)

- Transporte em condies adequadas de temperatura

4.2.3. Quantidade a ser analisada

Recomendao das farmacopias 10 g(mL)

4.2.4. Preparao da amostra

Verificar a atividade antimicrobiana do produto (conservantes na frmula) Inativar

Inativantes especficos para agentes antimicrobianos de frmulas farmacuticas e cosmticos

Antimicrobiano
Formaldedo

Inativante
O,1% de histidina no diluente inicial

Clorados
Sais de amnio quaternrio

0,5% de tiossulfato de sdio

3,0% de polissorbato + 0,3% de lecitina

Continuao:

Fenis e derivados diluente inicial

Tensoativos anfteros de lecitina Metais pesados, orgnicos ou ionizados (As, Pb)Cd, Hg, Cr, Mn)

1,0% de polissorbato 80 no

3,0% de polissorbato 80 + 0,3%

0,1% de cistena

PREPARAO DAS AMOSTRAS

1. Produtos hidrossolveis: 10 g ou 10 mL da amostra

+
90mL de soluo tampo fosfato - pH 7,2

+
Preparar diluies decimais com o mesmo diluente

2. Produtos de natureza no lipdica insolveis em gua Preparar suspenso de 10 g ou 10 mL da amostra + Soluo tampo fosfato pH 7,0 + Polissorbato 80 (na concentrao de 1 g/L (agente tensoativo, se necessrio) Preparar diluies decimais com o mesmo diluente

3. Produtos de natureza lipdica

3.1. Mtodo de filtrao por membrana 3.1.1. Preparo do diluente - 100 mL de miristato de isopropila (esterilizado por filtrao em membrana)

Dissolver 1 g ou 1 mL da amostra + 100mL do diluente + polissorbato 80 estril ou outro agente tensoativo no inibitrio (optativo)
Aquecer a 40 45C

3.2. Mtodo de contagem em placa

Frasco contendo 5 g de polissorbato 20 ou 80 estril ou outro agente tensoativo no inibitrio + 10 g ou 10 mL da amostra Aquecer a temperatura entre 40 - 45C (Manter aquecido)

1. Adicionar diluente previamente aquecido proporo 1:10; 2. Misturar, cuidadosamente, mantendo a temperatura mxima de 40 - 45 C durante o tempo necessrio para a formao de uma emulso, em qualquer caso no mais que 30 minutos;

3. Preparar diluies decimais sucessivas com o mesmo diluente acrescido de polissorbato 20 ou 80.

Cremes e pomadas insolveis em miristato de isopropila

10 g da amostra + 90 mL caldo casena-soja contendo 0,1g de tetradecilsulfato de sdio (aquecido a 40 - 45 C)

Agitar at mistura homognea

Preparar diluies decimais sucessivas com o mesmo diluente acrescido de 0,1% de tetradecilsulfato de sdio.

Cpsulas vazias: 10 g de cpsulas vazias + 90 mL de soluo tampo fosfato pH 7,2 aquecido a 40 - 45 C + Agitar no mximo durante 30 minutos

Completar o volume para 100 mL (diluio 5:10)

Preparar diluies decimais sucessivas com o mesmo diluente

Gelatinas 10 g da amostra + 90 mL gua estril aquecida a 40 - 45 C + deixar em repouso durante uma hora (diluio 1:10).

Banho-maria a 45 C
Agitar Preparar diluies decimais sucessivas em gua estril

4.3. Contagem do nmero total de microorganismos mesoflicos

Determinar o nmero total
Bactrias mesfilas e fungos Produtos e matrias-primas no estreis

Satisfaz s exigncias microbiolgicas farmacopeicas

4.3.1. MTODOS DE CONTAGEM DE MICRORGANISMOS 4.3.1.1. Em meio slido, com semeadura da amostra
em profundidade (pour plate):

a. Agar casena-soja ou agar nutriente - bactrias; b. Agar Sabouraud dextrose ou agar batata - fungos c. Fazer diluies decimais do produto

d. alquotas de 1 a 2 mL de cada diluio

Placas de Petri Meio de Cultura (~20 mL)

Homogeneizar
Incubar a 30 - 35C/2-5dias - bactrias 20 - 25C/5-7 dias - bolores e leveduras

1. Fazer contagem das colnias; 1. Considerar a diluio; 1. Resultado: UFC/g (mL)

4.3.1.2. Em meio slido, com semeadura da amostra em superfcie

Placas de Petri contendo meio de cultura apropriado 0,1 a 0,5 mL de cada diluio da amostra Semear com ala de Drigalsky.

4.3.1.3. Membrana filtrante Filtrar 10mL do produto sob a forma lquida ou suas diluies em membranas apropriadas (0,45m ou 0,20 m de poro)
Depositar na mesma posio, sobre placas de Petri contendo meio de cultura apropriado.

4.3.1.4. NMERO MAIS PROVVEL (NMP)

Mtodo utilizado apenas quando outros mtodos mais precisos no puderem ser utilizados

4.4. PESQUISA DE PATGENOS ESPECFICOS - Pseudomonas aeruginosa nas preparaes tpicas, particularmente naquelas envolvendo regies prximas aos olhos; - Staphylococcus aureus nas preparaes tpicas em geral; - Escherichia coli nas preparaes orais; - Salmonella sp. nas preparaes orais

1. Meios de enriquecimento

1. Enriquecimento no seletivo de E. coli e Salmonella sp.

10g(mL) da amostra + 100 mL de caldo lactosado

Incubar a 36+/-1C/24 a 48 horas

Aps o enriquecimento
Semear em gar SS OU gar EMB e/ou gar MacConkey

Incubar 36-37C/24-48 h
Identificao bioqumica

Agar MacConkey

Colnias vermelho-tijolo a prpura com halo de precipitao de bile

COLNIAS LACTOSE POSITIVA E LACTOSE NEGATIVA

Escherichia coli Agar eosina-azul de metileno Clique para editar os estilos do texto mestre
Segundo nvel
Terceiro nvel
Quarto nvel Quinto nvel

Colnias com brilho metlico esverdeado e escuro centro

SALMONELLA SP
- Meios de enriquecimento: a. Caldo selenito-cistina; b. Caldo tetrationato

- Meios de isolamento- seletivo-indicador: a. Agar verde brilhante (colorao transparente); b. Agar sulfito de bismuto (colnia preta ou esverdeada).

GAR SULFITO DE BISMUTO

COLNIA PRETA OU ESVERDEADA
SALMONELLA

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Segundo nvel
Terceiro nvel
Quarto nvel Quinto nvel

GAR VERDE BRILHANTE

SALMONELLA

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Segundo nvel
Terceiro nvel
E.COLI

Quarto nvel Quinto nvel

SALMONELLA

Staphylococcus aureus
a. Agar Baird-Parker
Meio especfico para estafilococos coagulase-positivos (S. aureus) Colnias pretas, halo transparente

STAPHYLOCOCCUS AUREUS

b. Agar Vogel-Johnson Colnias pretas, halo amarelo

STAPHYLOCOCCUS AUREUS Clique para editar os estilos do texto mestre

Segundo nvel
Terceiro nvel
Quarto nvel Quinto nvel

c. gar manitol salgado Colnias amarelas, halo amarelo

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Terceiro nvel
Quarto nvel Quinto nvel

Pseudomonas aeruginosa a. Agar cetrimida

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Segundo nvel
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Quarto nvel Quinto nvel