UNIVERSIDAD NACIONAL AUT NOMA DE M XICO FACULTAD DE QU MICA

Retos en validacin de mtodos analticos por LC/MS/MS. Supresin inica, contaminacin, efecto de matriz.

POR: LARA ALMAZ N NANCY

Cromatografa Lquida de Alto Rendimiento

La cromatografa es un procedimiento no destructivo, para resolver una mezcla de mltiples componentes traza, se puede aplicar tanto cuantitativa como cualitativamente.

HPLC, es una tcnica analtica usada para separar y determinar solutos orgnicos e inorgnicos en cualquier muestra, especialmente biolgica, farmacutica, alimentaria, medioambiental, e industriales.

No se limita a muestras voltiles y trmicamente estables, y la eleccin de la fase mvil y la fase estacionaria es ms ancha.

Ganesh N Sharma, et al. (2010) Trouble shooting during bioanalytical estimation of drug and metabolites using LC-MS/MS: A review. J Pharm Adv Technol Res.

Tcnica analtica que produce iones a partir de compuestos que se separan en base a su relacin (m / z)
Funcionamiento: a) ionizacin, b)separacin y el anlisis de la masa de los iones, c)Medida, amplificacin y creacin de espectros de masas

Espectrome tra de masas

Permite establecer rutas de fragmentaci n en muestras de alta complejidad

Por lo general se usan espectrmet ros de masas en tndem.

ALTA resolucin, elevada sensibilidad, incluso hasta niveles de pg/L, debido a su alta especificidad.

Espectrmetros de masas tndem (MS-MS) : son instrumentos que tienen ms de un analizador, se utilizan para estudios estructurales y de secuencia.Los analizadores no son necesariamente del mismo tipo, en cuyo caso el instrumento es un hbrido.Los ms populares incluyen: cuadrupolo-cuadrupolo, sector magnticocuadrupolo, y, ms recientemente, las geometras cudruple-tiempo de vuelo.

Ganesh N Sharma, et al. (2010) Trouble shooting during bioanalytical estimation of drug and metabolites using LC-MS/MS: A review. J Pharm Adv Technol Res.

Mejor mtodo; sensible y especifico

El detector puede ser programado para seleccionar ciertos iones a fragmento

LC/MS/ MS

Combina la capacidad de separacin fsica CL con el anlisis de masas MS.

Deteccin especfica e identificacin potencial de productos qumicos en la presencia de otro productos.

Puede hacerse un anlisis en minuto o menos

Ganesh N Sharma, et al. (2010) Trouble shooting during bioanalytical estimation of drug and metabolites using LC-MS/MS: A review. J Pharm Adv Technol Res.

Aplicaciones de LC/MS/MS en bioanlisis

Identificacin y / o cuantificacin de drogas ilcitas en muestras biolgicas .

Pruebas de veneno en usos toxicolgico s y forenses.

Anlisis de elementos traza y sustancias txicas en las ciencias naturales y la investigacin ambiental.

Monitoreo en la concentracin de frmacos y sus metabolitos en tejidos, sangre, plasma, suero y muestras de orina, para una mejor comprensin de la farmacologa y la toxicidad de los frmacos.

Monitorizacin teraputica farmacolgico en pacientes.

en

la

gestin

del

tratamiento

Estudios farmacocinticos: tcnica ms frecuentemente usada en el bioanlisis, siempre y cuando el analito sea adecuadamente ionizado, y sea un corto tiempo DE anlisis

Ganesh N Sharma, et al. (2010) Trouble shooting during bioanalytical estimation of drug and metabolites using LCMS/MS: A review. J Pharm Adv Technol Res.

Puntos Crticos en Bioanlisis con LC-MS/MS

Cules seran las condiciones exactas cromatogrficas incluyendo la seleccin de la columna, fase mvil, las condiciones de flujo, el mtodo de preparacin de la muestra y el sistema de deteccin?

Es el mtodo desarrollado preciso, exacto y reproducible?Es robusto con respecto a la columna, la mquina y analista?

Para resolver estos problemas, hay que validar el mtodo desarrollado en relacin con el frmaco parental y metabolito.

Ganesh N Sharma, et al. (2010) Trouble shooting during bioanalytical estimation of drug and metabolites using LC-MS/MS: A review. J Pharm Adv Technol Res.

Desventaja de LC-MS/MS

Los compuestos coliberadores pueden suprimir o mejorar la ionizacin de los analitos de inters.

Tales efectos, pueden afectar considerablem ente los parmetros de rendimiento del mtodo.

Lmite de deteccin (LOD), lmite de cuantificacin (LC), linealidad, exactitud y precisin.

Yogesh Modhave (2012). Matrix Effect in Bioanalysis: An Overview. Int.J.Pharm.Phytopharmacol.Res.

Retos en validacin de mtodos analticos por LC/MS/MS.

efecto de matriz Supresin inica Contaminacin

EFECTO DE MATRIZ
Matriz: componentes de un muestra que no son el analito.

Efecto de matriz : efecto combinado de todos los componentes de la muestra que no son el analito sobre la forma en que se realiz el anlisis y la calidad de los resultados. Hay una s upresin o mejora de la ionizacin del analito .

El efecto de la matriz cambia la respuesta de un analito, ya sea positiva o negativamente , causada por coeluir compuestos de matriz, relativa a una inyeccin de un estndar puro.

Para contabilizar los efectos de matriz se construye una curva de calibracin utilizando muestras estndar con la concentracin de analito conocida y la que se intenta aproximar a la matriz de la muestra. Yogesh Modhave (2012). Matrix Effect in Bioanalysis: An Overview. Int.J.Pharm.Phytopharmacol.Res. Ganesh N Sharma, et al. (2010) Trouble shooting during bioanalytical estimation of drug and metabolites using LCMS/MS: A review. J Pharm Adv Technol Res.

EFECTO DE MATRIZ DONDE?

En el anlisis de analitos:

Medicamentos pesticidas, biomolculas matrices diversas: sangre, tejido animal suave, tejido de planta.

La medida cuantitativa de los efectos de matriz es el factor de matriz (MF) y se define por la siguiente ecuacin:

Si MF= 1 indica que no hay efecto de matriz MF<1 indica supresin ionica MF>1 indica exaltacin de iones
Yogesh Modhave (2012). Matrix Effect in Bioanalysis: An Overview. Int.J.Pharm.Phytopharmacol.Res.

EFECTO DE MATRIZ CAUSAS?

Procedimiento de preparacin de muestra

Pueden ser muy variables y Calidad de separacin Aditivos de fase mvil cromatografca

difcil de controlar o predecir por electrospray (ESI) es ms

Estndar Interno (SI)
propenso a tales efectos que la presin atmosfrica de ionizacin qumica (APCI).

tipo de ionizacin: Ionizacin

Compuestos exogenos: drogas y / o sus metabolitos

Estos efectos pueden ocurrir principalmente cuando otros compuestos co-eluyen con el analito de inters
Fosfolpidos endgenos Aditivos tales como cido trifluoroactico (TFA) Medios de dosificacin Formulacin de agentes

Modificadores de fase mvil.

Estos efectos pueden ser agravados por impurezas o productos de degradacin y puede ocasionar importantes errores en la exactitud y precisin de mtodos bioanalticos. As como:IDENTIFICACIN ERRONEA (FALSOS POSITIVOS/NEGATIVOS), INCORRECTA CUANTIFICACIN, DISMINUCIN DE LA SENSIBILIDAD y CONTAMINACIN DEL SISTEMA CROMATOGRFICO

Documentos de orientacin actuales de la FDA requieren que estos efectos se evaluen como una parte del desarrollo del mtodo cuantitativo y validacin del LC / MS / MS .

Yogesh Modhave (2012). Matrix Effect in Bioanalysis: An Overview. Int.J.Pharm.Phytopharmacol.Res.

EFECTO DE MATRIZ: IDENTIFICACIN

La principal estrategia para determinar el grado de EM es correr una muestra de matriz y determinar por LC-MS comparar la respuesta con la de una muestra que contenga el analito pos-extraccin

Comparan las respuestas entre una disolucin patrn de referencia en solvente y el extracto blanco forticado con el patrn (a la misma concentracin).

A partir de las respuestas obtenidas se puede calcular el porcentaje de respuesta del analito en la matriz estudiada frente al patrn en solvente sin matriz.

Se hace un supuesto de recobro, y si el % es por debajo del 100% se trata de una supresin y si esta por encima es una exaltacin de respuesta.

Recobro (%) = pico del area del extracto de matriz / pico del area de la muestra post-extraccin * 100
Yogesh Modhave (2012). Matrix Effect in Bioanalysis: An Overview. Int.J.Pharm.Phytopharmacol.Res.

EFECTO DE MATRIZ: IDENTIFICACIN

Terence G. Hall, et al. Identifying and Overcoming Matrix Effects in Drug Discovery and Development. ArQule Inc. USA

Adicin del analito postcolumna

Continua adicin del compuesto, o de un patrn interno, en modo postcolumna mediante una bomba de jeringa Mientras que el inyector automtico introduce una muestra blanco, monitorizando en el detector MS la transicin del analito. Se observara si el analito se ve afectado constantemente por la matriz conforme esta va eluyendo de la columna, dando informacin sobre la evolucin del EM en funcin del tiempo. Esta aproximacin no da informacin sobre los interferentes causantes del eecto.

Inyeccin del extracto en modo full scan

Se visualiza el EM mediante la realizacin de un cromatograma en full scan de la matriz blanco.

Otras alternativas de identificacin.

Se asume que todos los compuestos causantes del EM van a competir con el analito por la ionizacin, por lo que deben compartir el mismo modo de ionizacin que el analito

Al tiempo cromatogrfico en el que eluyen mas compuestos de la matriz, el EM ser mayor.

Desventaja: no tiene presente que habrn otros compuestos que no se ionizan pero si producen EM.

Ventaja: Es posible obtener informacin estructural los interferentes, y por tanto dar una idea de como eliminarlos.

Grimalt Brea Susana (2009). Tesis Dotoral. Instituto Universitario de Plaguicidas y Aguas.

EFECTO DE MATRIZ PREVENCIN

SELECCIN DEL ION/IONES DE CUANTIFICACIN

VALIDACIN DEL MTODO Y/O REVISIN.

PREPARACIN DE ESTANDARS EN MATRIZ

METODOS DE CUANTIFICACIN ALTERNATIVOS

CLEAN-UP DE LAS MUESTRAS

La gua de la US-FDA para la industria sobre la validacin de mtodos bioanalticos requiere la evaluacin de efecto de la matriz durante la validacin del mtodo para los mtodos bioanalticos cuantitativos LC-MS/MS. Este paso es generalmente necesario para eliminar los componentes de la matriz tales como protenas, sales y otros compuestos orgnicos en matrices biolgicas que de otro modo pueden imponer interferencias o supresiones de ionizacin para los analitos.
Ganesh N Sharma, et al. (2010) Trouble shooting during bioanalytical estimation of drug and metabolites using LC-MS/MS: A review. J Pharm Adv Technol Res.

EFECTO DE MATRIZ: PREVENCIN

Efectos de la matriz que pudieran derivarse de compuestos endgeno extrados de la matriz de la muestra, por lo general pueden eliminarse de dos formas.

Optimizar condiciones cromatogrficas para separar el pico del analito a partir de l pico de la matriz causando la supresin inica / mejora,y / o limpieza de las muestras cambiando el mtodo de preparacin de la muestra de inyeccin directa o extraccin en fase slida por la precipitacin de protenas.

Dilucin parece ser otra manera de reducir los efectos de la matriz.

Yogesh Modhave (2012). Matrix Effect in Bioanalysis: An Overview. Int.J.Pharm.Phytopharmacol.Res.

EFECTO DE MATRIZ Alternativas para corregir el efecto matriz en la cuantificacin en LCMS

1. Uso de patrones internos 2. Calibrado en matriz 3. Dilucin del extracto de la muestra 4. Pre-tratamiento de la muestra

Grimalt Brea Susana (2009). Tesis Dotoral. Instituto Universitario de Plaguicidas y Aguas.

EFECTO DE MATRIZ: 1.Uso de patrn interno

La estructura del patrn interno debe ser lo mas parecida posible a la del analito, por ello el patrn ideal para corregir el EM Ventaja: permite minimizacin es el mismo la analito marcadode la etapa de procesamiento de la muestra, isotpicamente. Limitacin de uso de compuestos permitiendo incluso la inyeccin directa de marcados isotpicamente como patrones extractos crudos. internos: no encontrarse en ocasiones disponible comercialmente o que su coste sea excesivamente alto.

Grimalt Brea Susana (2009). Tesis Dotoral. Instituto Universitario de Plaguicidas y Aguas.

EFECTO DE MATRIZ: 3.Calibrado en Matriz

Calibracin del extracto blanco de la matriz De esta forma se iguala el efecto matriz al mismo nivel en los patrones y en las muestras consiguiendo una calibracin adecuada para la correcta cuantificacin de la concentracin en las muestras Inconveniente: Disponer de una muestra blanco que comparta las mismas caractersticas que la matriz de anlisis. Este tipo de alternativa solo corrige el EM para la correcta cuantificacion, pero no lo elimina, por lo que puede ser inadecuado en casos donde se de una supresion muy alta, generando perdida la Grimalt Brea Susana (2009). Tesis Dotoral. Instituto de Universitario de Plaguicidas y Aguas. sensibilidad.

Ventaja:

EFECTO DE MATRIZ: 4.Dilucin del extracto de la muestra

La minimizacin de la presencia de otros componentes de la matriz mediante su dilucin en el extracto puede conseguir que estos sean comparables a los patrones en solvente en LC-MS.

Por ejemplo: en la determinacin de fosetil en extracto de naranjas mediante cromatografa de pares inicos, presenta una mejor forma de pico al diluirse cinco veces el extracto crudo, mejorando tambin la retencin cromatografa, ya que en este caso la formacin del par inico se vea favorecido al no encontrar tantos interferentes de la matriz.

Grimalt Brea Susana (2009). Tesis Dotoral. Instituto Universitario de Plaguicidas y Aguas.

EFECTO DE MATRIZ: Pre-tratamiento de la muestra

Objetivo:

disminuir la presencia de posibles interferentes haciendo uso de los procedimientos de tratamiento de muestra, que purifiquen el extracto de muestra eliminando el mximo numero de componentes que puedan interferir. En algunos casos, en los que se desea pre-concentrar el analito para aumentar la sensibilidad, se puede dar una pre-concentracin de interferentes de la misma magnitud que el analito generndose incluso un mayor efecto matriz.

Inconveniente:

gasto econmico y de tiempo, adems de la probabilidad de introduccin de una mayor cantidad de errores.

Grimalt Brea Susana (2009). Tesis Dotoral. Instituto Universitario de Plaguicidas y Aguas.

EFECTO DE MATRIZ: Ejemplo

Terence G. Hall, et al. Identifying and Overcoming Matrix Effects in Drug Discovery and

SUPRESIN IICA
Ocurre, cuando un compuesto que coeluye suprime la ionizacin de las molculas de la muestra, en la fuente de un espectrmetro de masas . tericamente, puede ocurrir tanto en la fase de solucin o de la fase gas.

Esta supresin de iones es anlogo al del pico de basura grande para el material no retenido comn al comienzo de cromatogramas por deteccin UV. La supresin de iones, como otras interferencias cromatogrficas, en anlisis cuantitativo, puede variar de muestra a muestra.
Ganesh N Sharma, et al. (2010) Trouble shooting during bioanalytical Tambin puede ser dependiente de la estimation of drug and metabolites using LC-MS/MS: A review. J Pharm concentracin del analito que se controla, Adv Technol Res.

SUPRESIN INICA CAUSAS?

Experimentos de extractos biologicos que implican (ESI), ha demostrado que la principal causa de supresin de iones es un cambio en las propiedades de la solucin para formar gotitas, causados por la presencia de solutos no voltiles o menos voltiles . Estos materiales no voltiles (por ejemplo, sales, agentes de emparejamiento de iones, compuestos endgenos, frmacos / metabolitos) cambian la eficiencia de formacin de gotitas o evaporacin de la gotita, que a su vez afecta a la cantidad de iones cargados en la fase gas que finalmente alcanzan el detector.

Se ha demostrado que las molculas de mayor masa suprimen la seal de molculas ms pequeas y que los analitos ms polares son ms susceptibles a la supresin.

Ganesh N Sharma, et al. (2010). Trouble shooting during bioanalytical estimation of drug and metabolites using LC-MS/MS: A review. J Pharm Adv Technol Res.

SUPRESIN INICA: EVALUACIN (COMPARACIONES)

(a)la respuesta del instrumento para calibradores (incluyendo cualquier patrones internos) inyectados directamente en la fase mvil. muestran el efecto de la matriz de la muestra en respuesta MS (supresin de iones)

Proporciona n un valor relativo de respuesta 100%

(b)la misma cantidad de compuesto aadido a las muestras preextraidas.

(c)la misma cantidad de compuesto aadido al espcimen matriz antes de la extraccin

puede resaltar si cualquier prdida de seal es atribuible al proceso de extraccin o a la supresin ionica Ganesh N Sharma, et al. (2010) Trouble shooting during bioanalytical
estimation of drug and metabolites using LC-MS/MS: A review. J Pharm Adv Technol Res.

SUPRESIN INICA CMO CONTRARRESTAR?

Modificar la fase mvil.

Modificar las condiciones cromatogrficas de modo que el compuesto de inters eluya en una regin donde la supresin de iones no se observa.Esto implica generalmente aumentando el tiempo de cromatografa, pero no siempre .

Modificar la cromatografa de manera que el compuesto de inters y el patrn interno coeluyan debido a que la mayora de los ensayos de HPLC incluyen un patrn interno.La supresin de iones para los dos compuestos deben ser iguales si los picos cromatogrficamente coinciden, por lo tanto "correccin" para el grado de supresin.Si un istopo estable patrn interno est disponible, la supresin de iones sera idntica para el analito y el patrn interno.

El uso de un estndar interno no podra resolver completamente los problemas de exactitud o precisin con el ensayo si la supresin de iones exite.Si la supresin de iones reduce significativamente la seal del analito o estndar interno, la seal--ruido puede estar comprometida a un punto donde se vuelve negativa exactitud o precisin afectado.Es por esta razn que la supresin de iones debe ser evaluado incluso si un patrn interno est incluido en el ensayo

Ganesh N Sharma, et al. (2010) Trouble shooting during bioanalytical estimation of drug and metabolites using LC-MS/MS: A review. J Pharm Adv Technol Res.

SUPRESIN INICA: EJEMPLO

Una solucin diluida de paclitaxel fue infundida en LC-MS/MS y el blanco extrado del plasma fue inyectado para obtener el diagrama de arriba. La seal de estado estacionario para paclitaxel disminuy cuando la ionizacin fue suprimida por el ajuste de retencin, de modo que los analitos de inters eluyen despus de la supresin de esta regin, el riesgo de prdida de seal debido a supresin de la ionizacin se reduce considerablemente.

Courtesy of James Little, Eastman Kodak. J Chromatogr. B (2006) submitted for publication.

SUPRESIN INICA: EJEMPLO

Ejemplo de cmo la supresin puede aparecer durante el anlisis de la muestra. La precipitacin en Plasma es un mtodo popular y fcil de limpiar las muestras antes de la inyeccin.

Este ejemplo muestra que aunque las protenas plasmticas pueden ser removidos para que la muestra sea mas clara, los materiales restantes pueden causar la supresin inica grave.

Arriba: plasma de rata precipitado que contiene prednisolona, difenhidramina, betametasona, amitriptilina, naproxin y ibuprofeno.

Abajo:los estndares en disolvente.

C.R. Mallet, Z. Lu, and J.R. Mazzio, Rapid Commun. Mass Spectrom., 18 (2004) 49-58.

CONTAMINACIN
La contaminacin puede afectar negativamente a la exactitud y precisin. Si el pico en las muestras del blanco es mayor del 20% que la respuesta del LLOQ, la contaminacin es significativa y debe ser investigado

Fuentes de contaminac in
Derrames, salpicaduras, aerosoles, mezcla y goteo durante los pasos de transferencia de lquidos. Contenedores secundarios desechables deben utilizarse siempre que sea posible.

Prevenci n
Recipientes de vidrio debern limpiarse a fondo antes de su uso. Banco de trabajo, pipetas, tubos de vaco, y las agujas de evaporacin, etc, deben ser limpiados antes de su uso. Los guantes deben ser cambiados con frecuencia durante la preparacin de la muestra.

Extraccin en fase slida

Extraccin lquidolquido y precipitacin de protenas

Posibilidad de contaminacin es mayor durante las etapas de dilucin, la elucin y la evaporacin

La contaminacin puede ocurrir durante la dilucin, mezcla de disolventes orgnicos, transferencia de sobrenadante o pasos de evaporacin

Whitmire Monica , et al. (2011) LC-MS/MS Bioanalysis Method Development, Validation, and Sample Analysis. Analytical & Bioanalytical

REFERENCIAS
Ann Van Eeckhaut, Katrien Lanckmans, Sophie Sarre, Ilse Smolders, Yvette Michotte(2009). Validation of bioanalytical LCMS/MS assays: Evaluation of matrix effects. Journal of Chromatography B.

Ganesh N Sharma,Man Mohan Singhal,KK Sharma,Jyotsana Sanadya(2010) Trouble shooting during bioanalytical estimation of drug and metabolites using LC-MS/MS: A review. J Pharm Adv Technol Res.
Grimalt Brea Susana (2009). Tesis Dotoral. Nuevas aportaciones de LC-MS con analizadores de triple cuadrupolo y tiempo de vuelo en el anlisis de residuos de plaguicidas y metabolitos en alimentos de origen vegetal.Intituto Universitario de Plaguicidas y Aguas. Yogesh Modhave (2012). Matrix Effect in Bioanalysis: An Overview. Int.J.Pharm.Phytopharmacol.Res. Thomas M. Annesley (2003). Ion Suppression in Mass Spectrometry. Clinical Chemistry C.R. Mallet, Z. Lu, and J.R. Mazzio, Rapid Commun. Mass Spectrom., 18 (2004) 49-58. Courtesy of James Little, Eastman Kodak. J Chromatogr. B (2006) submitted for publication. Monica Whitmire, Jennifer Ammerman, Patricia de Lisio, Jacqueline Killmer, Devon Kyle, Emily Mainstone, Lynann Porter and Tianyi Zhang. (2011) LC-MS/MS Bioanalysis Method Development, Validation, and Sample Analysis: Points to Consider When Conducting Nonclinical and Clinical Studies in Accordance with Current Regulatory Guidances. Analytical & Bioanalytical