Cortes con enzimas de restriccin

Yudy Alvear Carvajal Natalia Carolina Castiblanco Nstor Julin Zarate Herrn

ENZIMAS DE RESTRICCIN
Las enzimas de restriccin, tuvieron su primera aparicin en 1950 principalmente en organismos bacterifagos, estas enzimas adoptaron el nombre a partir del hecho de q que prevenan la invasin de ADN forneo tal como el ADN viral, cortndolo, adicionalmente, las enzimas cortaban preferencialmente en sitios internos del ADN foraneo, por esta razn recibieron el nombre de endonucleasas. Se observ en experimentos de laboratorio, que ciertas cepas de bacterias eran capaces de restringir el crecimiento de virus crecidos previamente en estas cepas. Este efecto fue atribuido a enzimas de restriccin.

El trmino endonucleasa de restriccin fue adoptado por Cohen y Boyer y fue asignado a las enzimas que producan restriccin. En los aos sesenta Swewaert Linn y Wernwr Arber, fueron quienes descubrieron las endonucleasas de restriccin en Escherichia coli. Lin y Arber esperaban que las enzimas que descubrieron pudieran cortar el ADN en sitios especficos y as producir Tajadas de ADN, aunque no fue lo que observaron. Posteriormente, Hamilton Smith descubri una enzima aislada de Haemoplitus influenzae aislada de la cepa R, que cortaba el ADN en un especifico. A esta enzima se le denomin Hind II.

 Las enzimas de restriccin tiene como ventaja principal su habilidad al cortar cadenas de ADN de una manera reproducible en los mismos sitios. Las dos cadenas de ADN que cortan en forma de escalera denominados as por la forma que deja en las cadenas, que hace que los extremos puedan encontrar complementariedad entre si mismo o/y con otros extremos; por lo que se denominan extremos adhesivos. Propiedad que tiene numerosas aplicaciones en tcnicas moleculares, como en la Clonacin.

1. Cohen y Boyer aprovecharon los extremos adhesivos y empezaron a crear experimentos de clonacin. 2. Implementacin de 2 plsmidos que conferan resistencia a antibiticos. 3. Utilizacin de la endonucleasa EcoRI.

Accin de la DNA ligasa. Formacin de un plsmido que incluye mas resistencia.

Reglas generales de nomenclatura en las enzimas de restriccin

Primera E. de restriccin y endonucleasa de restriccin son sinnimos; se abrevia Reasa- Enasa.

Las metiltransferasas (metilasas), tienen por abreviacin MTasa.

Segunda

Tercera

las tres primeras letras que corresponden al nombre cientfico del microrganismo (en cursiva). La cuarta letra a la cepa o estirpe si la hubiese

Cuarta

En nmeros romanos, se distingue la presencia de ms de una endonucleasa aislada de esa misma especie.

El prefijo M, R o RM indica la funcin de la enzima Ej. RM. Eco571.

Quinta

Sexta

Cuando genes codificantes para REasas o MTasas estn asociados en un solo sistema R-M, deben ser referidos con el segundo carcter del prefijo y utilizar numero arbicos. Ej los productos de dos genes M de HphI de un sistema R-M va a ser M1 HphI y M2 HphI

Los isosquizomeros difieren de los neoesquizomeros.

Septima

Tipos de enzimas de restriccin

Tipo I

Tipo II

Tipo III

Tipo IV

Formado por Protenas de mltiples subunidades 2-R; 2M y 1S

Cuando actan sobre sustratos no metilados funcionan como REasas

Tipo I
La localizacin de los sitios de escisin se da por la colisin y dilatacin de dos complejos durante la translocacin.

Cuando se encuentra un sustrato hemimetilado, el complejo actua como MTasa. Usa Sadenosilmetionina.

La nomenclatura que toman se relaciona con la secuencia que corta o la estructura que tiene

Reconocen secuencias palindrmicas y realizar cortan de manera simtrica

Endonucleasas de restriccin Tipo II

Reconocen secuencias de ADN especificas.

Necesitan Mg como cofactor.

Actuan de manera independiente de las MTasas La MTapas transfieren un grupo metil a partir del Sadenosil-L-metionina.

Tipo IIP
Se encuentran las enzimas que reconocen secuencias simtricas Cortan sitios fijos simtricos en la molcula o adyacentes

5 G A A T T C 3 3 C T T A A G 5

Tipo IIA

Se encuentran todas las enzimas de tipo II que reconocen secuencias asimetricas. Tienen un gen codificante para una REasa y dos MTasa

Enzimas tipo II B
Corte doble de la secuencia de reconocimiento. Ej: BcgI ( 10/12)S.C ; (12/10) Escisin

Enzimas tipo IIC

Enzimas hibridas con ambos dominios de escisin, modificando una sola protena. Contienes las IIB,II G Y IIH.

Enzimas tipo IIE y IIT

Interaccin con 2 copias de reconocimiento. Regiones blanco ( escisin/ efecto alexitrico ( Mg++) Ej: EcoRII IIT: subunidades heterodimericas

Enzimas Tipo IIF y IIG

IIF: coordinada con 2 secuencias de reconocimiento. IIG: 1 solo poli pptido fusionado.( R-M) AdoMet ( donador del grupo metilo) Secuencias de reconocimiento variadas.

Enzimas Tipo IIH, IIM y IIS

IIH: caractersticas similares a tipo I y bioqumicamente iguales a tipo II. IIM: Secuencias metiladas, Sitio fijo de corte IIS: Sub categoria de IIA que corta al menos 1 de las cadenas de DNA fuera de la S.R.

Nicking Enzimas
Reasas de corte incompleto (N 1 chain) ej: Bpu10I ( inactivacin de 1 de las subunidades). M5c-Mtasas ( mismatch de apareamiento errneo de G/T)

Protenas de control
Genes adicionales Codificacin de enzimas que regulan la expresin de Gen R. Ej: Pvu II Y C.BamHI genes c(ACTIVADORES TRANSCRIPCIONALES) - acumulacin protegiendo REasa.

Endonucleasas Tipo III

Sistemas (Mod/res) SITIO DE reconocimiento DUO + ATP DNA no palndromo y secuencias de forma inversa, Corte en secuencia especifica de una de las copias de secuencia de reconocimiento. M6A - Hemimetilacion. EJ: EcoP 1I

Endonucleasas Tipo IV
Solo DNA modificado( metilado, hidroximetilado, y glucosil/metilado) EcoKMcrBC: Reconocimiento de 2 dinucleotidos de la forma RmC. 30 bases lejos de reconocimiento

Enzimas Hipotticas
Similitud o inferencia en secuencias especificas en un plsmido o DNA bacteriano METILADO. P comprobacin

Sistemas R/M : Formas Mnimas de Vida

Mantenido en bacterias como defensa a infecciones como: DNA viral, plsmido etc. HIPOTESIS DE DEFENSA CELULAR Muerte celular si hay perdida de sistema o arreglos genmicos para supervivencia. HIPOTESIS DEL GEN EGOISTA Variacin genmica Diagnostico de enfermedades genticas con cambios en secuencia de DNA ( mutaciones, delecciones o inserciones) o Enf. Infecciosas.