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METHODES OPTIQUES ET SPECTROSCOPIQUES

Les bases de la spectroscopie La spectroscopie peut tre dfinie comme ltude de linteraction des radiations lectromagntiques avec la matire. Les radiations lectromagntiques, dont la lumire visible forme une toute petite part, peuvent tre caractrises par leur longueur donde. Ces longueurs donde sont exprimes en gnral en units de longueurs telles que le micron ou le nanomtre. Plusieurs plages spectrales peuvent prsenter un intrt pour lanalyse des composs biologiques : lultraviolet (longueurs donde entre 200 et 400 nm), le visible (400 -800 nm), le proche infrarouge (800-2500 nm), linfrarouge moyen vibrationnel (250015000 nm), la zone de la rsonance magntique nuclaire (1 5 mtres). Les liaisons chimiques sont lastiques et se comportent comme un systme de masses relies par des ressorts (fig. 1). Cela a pour consquence que les atomes ne restent pas en position fixe les uns par rapport aux autres, mais au contraire, vibrent autour dune position moyenne. Dans une molcule, on peut en gnral observer de nombreuses vibrations. Pour des longueurs donde lumineuses particulires, qui sont spcifiques des groupements chimiques et des molcules, la lumire est absorbe par la molcule, ce qui se traduit par un accroissement de la vibration de la liaison chimique considre. La spectroscopie vibrationnelle consiste ainsi clairer un chantillon avec des rayons lumineux, Exemple de dont on fait varier la longueur d'onde, et enregistrer la quantit de lumire qui Fig.1: a t absorbe par le produit. Le signal ainsi obtenu sappelle un spectre , qui vibration molculaire : la fonction alcool est une sorte dempreinte digitale du produit tudi.

(C-OH)

La plupart des spectromtres de conception rcentes et destins aux applications analytiques peuvent tre quip de fibres optiques. Les fibres optiques sont, en gnral, regroupes en faisceau. Un premier faisceau sert conduire la lumire depuis le spectromtre jusqu lchantillon analyser, tandis quun second collecte la lumire rflchie par lchantillon. Ces faisceaux sont regroups de manire former un cble souple, termin par une sonde de mesure. On peut alors effectuer une mesure spectrale en posant simplement la sonde sur lchantillon. La lumire provenant dun faisceau de fibre passe lintrieur de lchantillon o elle subit une rflexion diffuse. Une partie de cette lumire est alors collecte par un deuxime faisceau de fibre et guide jusquau dtecteur (fig. 2 ). Les spectromtres destins aux applications analytiques sont connects des micro-ordinateurs qui ont pour rle de piloter lappareil et de permettre le stockage, la gestion et l'analyse statistique des donnes spectrales.

Faisceau dentre Source lumineuse

Faisceau de sortie Vers le dtecteur photosensible

fig. 2 : Un spectromtre fibres optiques utilis pour le dosage des fruits entiers

applications dans lanalyse alimentaire


Les mthodes spectroscopiques sont extrmement efficaces, aussi bien en terme de facilit demploi que de prcision des rsultats obtenus. La trs grande majorit des applications porte sur le dosage de constituants biochimiques. Il est possible de doser, sur le mme chantillon, la teneur en eau, en protines et en lipides par exemple, en moins de cinq minutes, alors que ces dosages, par des mthodes conventionnelles, pourraient demander une journe entire. Les applications analytiques de la spectroscopie sont extrmement diversifies et stendent toutes les filires des industries agro-alimentaires : crales, graines alimentaires, olagineux, produits carns, produits laitiers. Il existe galement de trs nombreuses applications dans les industries non alimentaires dans le domaine de la chimie, la pharmacie, lindustrie ptrolire. En raison de leur intrt pratique, deux dosages sont universellement mis en uvre dans toutes les industries agro-alimentaires : ceux de leau et des protines. -Le dosage de leau prsente une importance particulire. Leau est, en effet, un constituant essentiel des aliments. Elle agit comme vecteur des ractions enzymatiques, comme lment du dveloppement de microorganismes (qui peut tre ou non souhait selon la nature des produits). De plus, la teneur en eau fait souvent lobjet dune rglementation et reprsente un lment essentiel du cot dun produit fini. Le dosage de leau par spectroscopie est effectu sur la totalit des denres alimentaires prsentes dans les industries. La justesse et la prcision de la mthode spectroscopique sont gales ou meilleures que celles des mthodes de laboratoire. La mthode par spectroscopie proche infrarouge (SPIR) est largement applique, par exemple pour lanalyse des crales. Elle exige un talonnage pralable, bas sur un grand nombre dchantillons pour lesquels lhumidit a t mesure par une mthode conventionnelle et qui servent construire un modle de prdiction.

- Le dosage des protines est galement trs utile. Dans les industries de l'alimentation animale, les protines reprsentent souvent le constituant le plus cher de laliment. Il est donc ncessaire de les contrler. Le dosage des protines dans les graines et les crales est sans doute lapplication de la spectroscopie proche infrarouge (SPIR) la plus importante.

Il existe des mthodes danalyse directe des protines qui ont t dveloppes pour des aliments spcifiques qui sont des mthodes colorimtriques trs utilises est bas sur la raction avec le ractif de Folin. Ce sont les mthodes les plus utilises en biochimie et dans lindustrie laitire (Lowry et al., 1951; Huang et al., 1976). Elles sont habituellement talonnes avec de lalbumine srique de bovin, qui est disponible avec une grande puret.

Reconnaissance de lauthenticit des denres alimentaires:


Si lon considre quun spectre est une empreinte digitale du produit tudi, on peut esprer qu'il soit suffisamment informatif pour permettre une identification qualitative. Le dveloppement de rglementation internationale donne une grande actualit ce type de contrle. On peut, par spectroscopie proche infrarouge, reconnatre la nature de la matire premire. Dans de nombreuses industries, ceci est mis en uvre, avec des spectromtres fibres optiques, pour sassurer avant utilisation, quil ny a pas derreur sur les ingrdients introduits dans des mlanges. Certains travaux ont galement montr que la spectroscopie permettait didentifier la technologie de production des aliments. Par exemple, des tudes ont port sur les jus de fruits, avec comme objectif de dtecter les ventuelles adultrations (lavages des pulpes, ajout de sucre et dacides amins, pressage renouvel ou trop intense). Elles ont montr que lon pouvait dtecter ces fraudes dans des jus doranges et dautres fruits tels que les pommes, les ananas, les cerises, le cassis. Des essais couronns de succs ont galement port sur des produits trs divers comme le caf et le th, les varits de bls ou les produits carns de diffrentes origines animales.

Les industriels de lagro-alimentaire attachent une grande importance au contrle de la qualit des matires premires et de leurs produits transforms. Ce contrle joue plusieurs rles importants. Tout dabord il sert garantir ladquation entre la matire premire reue et ses usages potentiels. Une matire premire de mauvaise qualit peut engendrer des cots de transformation levs ou mme tre impossible transformer. Au cours de la transformation industrielle, il est galement ncessaire de sassurer que linstallation de production fonctionne correctement. Cela peut se faire par le prlvement et lanalyse dchantillons, intervalles rguliers sur la chane de transformation. Lanalyse permet de vrifier que le produit subit une transformation normale. Enfin, aprs transformation, laliment ne peut tre commercialis que sil respecte des spcifications de qualit, imposes par la lgislation ou habituellement attendues par le consommateur.

PHOTOMETRIE DES MILIEUX TROUBLES:


Certaines solutions sont troubles car elles sont formes par des particules en suspension dans un liquide. Selon leur nature, leur forme, leur dimension, les particules agissent diffremment sur la lumire. L'ensemble de ces phnomnes obit la loi de Rayleigh : I0 = Iabsorbe + Itransmise = Idiffuse I0 = intensit de la lumire incidente Iabsorbe = intensit de la lumire qui est arrte par les particules Itransmise = intensit de la lumire qui traverse la solution sans rencontrer de particules Idiffuse = intensit de la lumire dvie par les particules.

I0 I0

Iabsorbe
I0

Itransmise (Turbidimtrie)
Idiffuse (Nphlmtrie)

PHOTOMETRIE DES MILIEUX TROUBLES:


Nphlomtrie: La nphlomtrie: Cette mthode de dosage est base sur la mesure de la quantit de lumire diffuse par les particules en suspension. Plus les particules sont grosses et plus elles diffusent. Cette mthode donne donc galement des informations sur la masse molaire, la forme, et les dimensions des particules. Elle consiste mesurer la lumire diffuse 90 d'angle par rapport la lumire incidente. L'instrument utilis pour faire les mesures est le nphlomtre (fig.3). Il est gnralement constitu d'une source de lumire blanche ou de lumire infrarouge (fig.4).

Fig.4: Lumire transmise et lumire diffract. Lobservation ne se fait plus dans la direction de propagation du faisceau incident mais plutt un angle a de cette direction dobservation qui se fait un angle de 90 par rapport la direction incidente.

Fig.3: Nphlomtre

Utilisations:
Pour les milieux gazeux: Des analyseurs de poussires en temps rel permettent d'analyser le taux de particules en suspension ou plus prcisment la concentration massique des poussires en suspension dans l'air (air intrieur, locaux industriels, mines, carriresetc.) ou dans un autre gaz. Certains appareils permettent, par l'adjonction d'un cyclone, de sparer dans l'chantillon les particules par catgories de tailles afin de mesurer diffrentes fractions rglementaires. On pourra ainsi mesurer : poussires totales ; poussires PM-10 parfois dites "thoraciques" ou les PM-4 dites poussires alvolaires car pntrant plus profondment les poumons ; poussires PM-2,5. Les analyseurs modernes ajustent automatiquement le dbit d'aspiration selon le seuil granulomtrique dsir et pour compenser les effets d'ventuelles variations de temprature, hygromtrie ou pression atmosphrique.

Pour les milieux liquides: La nphlomtrie est frquemment utilise pour contrler la qualit de l'eau, par exemple dans le traitement des eaux. L'unit de mesure de la turbidit par la technique nphlomtrique est l'UTN (Unit de Turbidit Nphlomtrique) ou en anglais NTU (Nephelometric Turbidity Unit). Classes de turbidit usuelles (NTU, nephelometric turbidity unit) : - NTU < 5 eau claire - 5 < NTU < 30 eau lgrement trouble - NTU > 50 eau trouble

Turbidimtrie:
La turbidimtrie est la mesure du degr de turbidit d'une suspension. Elle est dtermine grce un systme optique, en gnral un spectrophotomtre classique, qui mesure la diminution, due l'absorbance, de l'intensit d'un rayon lumineux de longueur d'onde connue traversant la suspension. La turbidimtrie est utilise en complment la nphlomtrie qui se base plutt sur la diminution de l'intensit par diffusion de la lumire. La turbidimtrie est utilise en microbiologie dans le but d'effectuer une numration bactrienne totale, (aussi bien des bactries "mortes" que vivantes), par la dtermination de la biomasse d'un chantillon. La diffusion de la lumire du faisceau incident, (de longueur d'onde choisie), par les bactries (ou autres corps en suspension) du milieu est nglige. C'est pourquoi on considre en gnral cette mesure comme une simple mesure d'Absorbance (Bien qu'en ralit il s'agisse d'une mesure du degr de turbidit de la suspension). La mesure est donc effectue avec un spectrophotomtre "classique". Puisqu'on nglige l'intensit de lumire rflchie et diffuse, on peut dire que l'Absorbance est proportionnelle la masse bactrienne. Pour effectuer cette mesure turbidimtrique s'apparentant une mesure d'absorbance, on va se placer une longueur d'onde gale 650nm, le milieu dans lequel la suspension est faite devant imprativement tre l'eau physiologique. Si ce n'est pas le cas et que la suspension existe en milieu color, cela risquant de fausser les mesures, on centrifugera pour rcuprer le culot bactrien avec lequel on prparera une nouvelle suspension bactrienne en eau physiologique. Cette technique de mesure de la Biomasse dans le but d'une numration bactrienne totale est trs rapide et assez prcise, c'est pourquoi il s'agit de la technique la plus utilise en Microbiologie.

Tout se passe comme si les molcules qui se trouvent dans lchantillon sous observation, absorbent la lumire incidente et la rmettent dans toutes les directions. Lobservateur se place pour observer la lumire ainsi rmise dans une direction perpendiculaire la direction du faisceau incident. Plusieurs phnomnes sont concerns par ce type de rmission de lumire. Si la lumire diffracte est caractrise par une longueur donde identique celle du faisceau incident, linc = ldiff, il sagit de la diffusion RAYLEIGH de la lumire. Cette technique dobservation de la diffraction de la lumire est particulirement utilise pour lobservation de matires ou de particules solides en suspension. Labsorption du faisceau en lumire transmise, donc dans la direction du faisceau incident sappelle la turbidimtrie. Lobservation de la lumire diffracte selon un angle par rapport la direction incidente sappelle la nphlomtrie (fig.5). Loi de RAYLEIGH: Idiff = k I0 n V2 sin2 4
Dans cette expression l est la longueur donde de la lumire, n est le nombre de particules par unit de volume, V est le volume des particules et k est un facteur de proportionnalit. Lorsque langle dobservation est de 90 , lintensit diffracte est fig.5: Turbidimtrie et nphlomtrie. donc maximum (sin a = 1). La turbidit t de la solution est ainsi dfinie :

1 Ln I0 I
l est la longueur du chemin optique dans la cellule.

La polarimtrie:
Cest la science de la mesure de la polarisation de la lumire. La polarimtrie peut tre utilise pour dterminer un grand nombre de proprits d'un objet, parmi lesquelles on peut trouver la birfringence circulaire (ou pouvoir rotatoire). Pour mesurer la polarisation de la lumire, les instruments les plus modernes font appel l'interfromtrie alors que la plupart font appel des filtres polarisants. Mesure de la rotation optique: Des chantillons optiquement actifs, comme les solutions de molcules chirales (molcule possdant au moins un carbone asymtrique), prsentent souvent une birfringence circulaire qui cause la rotation du plan de polarisation de la lumire quand elle traverse l'chantillon. Un polarimtre simple pour mesurer la rotation est form d'un long tube ferm une extrmit par du verre plat, l'intrieur duquel on place l'chantillon (fig.6). On place un prisme de Nicol chaque extrmit du tube. On fait ensuite passer la lumire dans le tube, puis faire tourner un des prismes jusqu' lobtention de la zone de pnombre. On a immdiatement l'angle de polarisation de l'chantillon.

* Un prisme polariseur * Un tube polarimtrique qui contient la substance analyser * Un second prisme analyseur que lon tourne en tournant un cercle gradue en degr

fig.6: Polarimtre. Une lampe de sodium (lumire monochromatique de longueur donde =589.5 nm)

Le principe de la mesure est simple. Le premier Nicol polarise la lumire incidente disons dans le plan vertical. Pour voir la lumire issue de ce polariseur, il faut ncessairement que le second polariseur ait son plan de polarisation parallle au premier. Cest ce qui se passe lorsque aucun compos chiral ne se trouve sur le chemin optique. Si lon ajoute une solution doue de pouvoir rotatoire, le plan de polarisation de la lumire tourne au fur et mesure quil traverse la solution. Il sort de lchantillon un angle par rapport son orientation originelle. Lobservation de la lumire travers le second Nicol polariseur montre que lintensit transmise sest affaiblie. Pour retrouver lintensit initiale, il faut tourner le plan de polarisation de ce second Nicol justement dun angle (fig. 4). Le pouvoir rotatoire qui est une valeur spcifique est calcul comme suit : [] = [] = pouvoir rotatoire spcifique Cxl en degrs = angle de rotation de la lumire polarise en degrs l = longueur du trajet optique (dm) C = concentration de la solution chorale (g/ml) La mesure de langle de rotation se Fig.7:Observation de la lumire transmise par le polarimtre fait a 20C en utilisant la raie de Na A : avec la cellule vide ; B : avec la cellule remplie ; comme source lumineuse. C : Obtention de zone de pnombre par rotation du Nicol analyseur dun angle .

Rfractomtrie:
La rfractomtrie est une technique qui vise dterminer l'indice de rfraction d'un matriau, le plus souvent liquide, mais galement solide ou gazeux. L'instrument de laboratoire ou de terrain utilis est le rfractomtre. L'indice de rfraction est calcul partir de la loi de Snell-Decartes et peut aussi tre estim partir de la composition de la matire l'aide de la loi de Gladstone. Un tel instrument permet l'identification d'une espce chimique (le plus souvent liquide), mais galement, aprs talonnage, il permet de dterminer la concentration d'un solut dans un solvant connu: c'est le cas de la dtermination du sucre dans le jus de raisin. L'instrument ci-contre (fig.8) est donn pour mesurer l'indice de rfraction de liquide entre les valeurs 1,300 et 1,700.

fig.8: Rfractomtre: Le rfractomtre d'Abbe permet d'avoir une mesure de l'indice de rfraction d'un liquide en le dposant sur une surface en verre, en l'enfermant dans un dispositif optique, et en rglant un bouton pour amener une plage claire au centre d'un rticule.

Principe de la mesure: Cet instrument est constitu de deux prismes en verre flint enfermant une mince couche de 1/20e de millimtre d'paisseur du liquide examiner. Le prisme infrieur sert surtout maintenir le liquide et permettre l'clairage du prisme suprieur. Les rfractomtres modernes, le prisme suprieur sert l'clairage et que le prise infrieur est celui qui permet la mesure (fig.9). L'ide est d'clairer le liquide analyser en lumire rasante et de dterminer l'angle limite not e qui dpend de l'indice n cherch et de l'indice N du matriaux sur lequel repose le liquide et dans lequel le rayon rasant rentre. n = N sin e Ce rayon poursuit son chemin et attaque la face de sortie du prisme avec l'angle r = e.(o est l'angle du prisme). Le rayon sort donc du prisme avec l'angle i tel que N sin r = sin i

fig.9: Principe de fonctionnement du Rfractomtre.

Cytomtrie en flux: La cytomtrie en flux (CMF) est une technique permettant de faire dfiler des particules, molcules ou cellules grande vitesse dans le faisceau d'un laser, en les comptant et en les caractrisant. C'est la lumire rmise (par diffusion ou fluorescence) qui permet de classer la population suivant plusieurs critres et de les trier. La cytomtrie en flux est dfinie comme ltude prcise de particules isoles ou de cellules, bactries,etc (vivantes ou mortes) entranes par un flux liquide ou gazeux. Cest une technique de caractrisation individuelle, quantitative et qualitative de particules en suspension dans un liquide.

Fig. 12: Amplimedical A40 Analyser

Principe: Il s'agit d'analyser les signaux optiques ou physiques mis par une particule coupant le faisceau lumineux dun laser ou dune lampe arc (fig.13). Les signaux mesurs sont essentiellement relatifs : - aux proprits optiques intrinsques des particules ; ils correspondent aux phnomnes de diffusion lumineuse lis aux dimensions de la particule, leur structure interne ou lauto-fluorescence de certaines cellules comme les vgtaux, le phytoplancton, etc; - aux proprits optiques induites de fluorescence obtenues par des marquages spcifiques de structures ou de fonctions cellulaires. Ces signaux spars par des filtres optiques sont collects par des photo-multiplicateurs (PMT), amplifis, numriss, traits et stocks par un ordinateur par l'intermdiaire d'une composante informatique et optique (miroir dichroque et filtre optique). fig.13: Principe de fonctionnement du Cytomtrie en flux.

Ce procd danalyse individuelle (cellule par cellule) est multiparamtrique et peut seffectuer la vitesse de plusieurs milliers dvnements par seconde. Lordinateur calcule les donnes statistiques associes aux distributions des paramtres mesurs et les reprsente sous la forme dhistogrammes (un paramtre) ou de cytogrammes (deux paramtres) sur une ou plusieurs populations dont les proprits cellulaires sont ainsi values. La fonction tri des cytomtres en flux les plus volus permet de trier physiquement une ou deux populations cellulaires dfinies par leurs proprits optiques. Cytomtre en flux analyseur Cytomtre en flux analyseur-trieur

Cytoron Absolute (Ortho-diagnostic Systems)

MoFlo (DakoCytomation)

Analyses des cellules

Analyse des cellules + Tri (sparation physique)

Modes dapplication: Lhmatologie a t lune des premires disciplines mdicales bnficier des applications cliniques de la cytomtrie en flux. Certaines de ces applications sont maintenant utilises rgulirement pour le diagnostic ou le suivi thrapeutique de diffrentes affections. Ces applications concernent aussi bien ltude fonctionnelle de cellules saines que la mise en vidence du caractre pathologique des cellules analyses. En cancrologie, la dtection de la cellule pathologique est lapplication la plus dveloppe. Cette dtection repose essentiellement sur la mesure dun contenu anormal dADN dans le noyau de la cellule tumorale. L'immunologie utilise la CMF pour la dtection ou l'identification des sous-types des cellules impliques dans l'immunit. Le cycle cellulaire reprsente lintgralit de la priode de division, cest--dire lensemble des vnements biochimiques et morphologiques qui sont responsables de la prolifration cellulaire. La CMF offre une mthodologie rapide et simple mettre en uvre pour lanalyse du cycle cellulaire. Elle permet de suivre la distribution des cellules dans les diffrentes phases du cycle en fonction de divers stimulus ou de lajout de certaines drogues. Elle permet aussi de voir la prsence de cellules avec des contenus anormaux dADN. En ocanologie, la cytomtrie en flux est devenue une mthode de routine pour compter les diffrents populations du picoplancton photosynthtique sur la base de la fluorescence des pigments tel que la chlorophylle. Aprs marquage des chantillons avec des marqueurs de l'ADN tels que le SYBR-Green, on peut aussi numrer les bactries et les virus. Dautres recherches font appel la CMF : lanalyse des chromosomes, la physiologie vgtale (plodie, contenu en ADN, pour la slection des plantes les plus rsistantes), etc.