La Molécula de la Vida

Ascaris megalocephala 2 Cebolla 16 Drosophila 8 cromosomas Hombre 46 Perro 78

Los Acidos Nucleícos
ADN, ARN, ATP, NAD, FAD 1) Una base nitrogenada (purina o pirimidina) 2) Un azúcar (pentosa) 3) Una molécula de ácido fosfórico

Purinas:

Pirimidinas:

Estructura del ADN
NH
2

terminal 5'

N

N

HO O

N

N

Adenina A
NH
2

O O P HO O O N

N
O

Citosina C
O N

O P HO O O N N

NH

O

NH

2

Guanina G

O CH O P HO O O N
3

NH O

O

Timina T

OH

terminal 3'

.

.

.

Estructura del ADN Watson y Crick 1953 LA INFORMACION NECESARIA PARA GENERAR LAS PROTEINAS INCUYENDO LAS ENZIMAS SON CODIFICADAS POR GENES. .

Expresión genética promotor Secuencia de unión al ribosoma Gene estructural (secuencia codificante) codón de inicio codón de paro terminador ADN P RBS Transcripción ARN RBS Traducción Proteína .

EXPRESION Transcripción. donde el RNA se utiliza como matriz dirigiendo la secuencia aminoácida específica para la síntesis proteica (ARNm. ARNt. Modificación post-traduccional Eliminación de exones (eucariotes) • • .Preservación y transmisión de la información genética • • • • • GEN: Segmento de ADN que contienen la información necesaria para formar una proteína. Señal: promotor Traducción. (ARN polimerasa. Proceso mediante el cual. el mensaje genético del ADN es transcrito en forma de ARN mensajero. Copia del ADN para formar moléculas hijas idénticas. ribosoma) Señal: RBS. Replicación. ARNm). Proceso por el cual el mensaje genético es descifrado en los ribosomas.

La replicación es realizada por enzimas .

.Replicación del ADN Fenómeno mediante el cual el ADN se duplica usándose a si mismo como templado.

Replicación del ADN .

Dogma Central .

GTP. . CTP and UTP). •Requires DNA-dependent RNA polymerase plus the four nucleotides (ATP.Transcripción •Synthesis of RNA from a DNA Template. •Synthesis begins at a the initiation site on DNA. •The template strand is read 3' to 5' and the mRNA is synthesized 5' to 3„.

Transcripción .

Transcripción .

Código Genético Nirenberg and Khorana. Premio Nobel in Fisiologia 1968 .

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Traducción .

Tecnología del ADN recombinante (Ingeniería genética) • Los genes se pueden: – – – – – Aislar y amplificar (obtener múltiples copias) Secuenciar Expresar con intensidad Desactivar Detectar con sensibilidad y especificidad .

etc) .etc. cósmidos.Herramientas  Enzimas de restricción (endonucleasas) Enzimas de modificación Ligasa ADN polimerasa Nucleasas kinasa.etc. fagos.etc. Vectores (plásmidos. transferasa.

AISLAMIENTO DE UN GEN .

the PCR can generate 100 billion similar molecules in an afternoon. from the tissues of a mummified brain or from a 40. The reaction is easy to execute. from a drop of dried blood at the scene of a crime. The DNA sample that one wishes to copy can be pure." http://nobelprize.org/chemistry/educational/pcr/ . The DNA may come from a hospital tissue specimen. from a single human hair. or it can be a minute part of an extremely complex mixture of biological materials. a few simple reagents and a source of heat.Kary Mullis in Scientific American: "Beginning with a single molecule of the genetic material DNA. It requires no more than a test tube.000-year-old wooly mammoth frozen in a glacier.

Reacción en Cadena de la Polimerasa “PCR” Taq DNA polimerasa 1993 Premio Nobel en Quimica a Kary Mullis .

Enzimas de Restricción .

Enzimas de Restricción .

BfuI BciVI GTATCC(N)6/5^ GCCNNNN^NGGC A^GATCT CC^NGG GACNN^NNGTC GAAGAC(N)2/6^ ^8/13(N)GAG(N)5CTC(N)13/8^ CCTNAGC-5/-2^ GC^TNAGC C^CNNGG ER1501/2 ER0071/2 ER0081/2 ER1421/2 ER1431/2 ER1011/2 ER1311/2 ER1181/2 ER0091/2 ER1081 ER0871/2 ER1711 ER1201/2 ER1261/2 ER1401/2 ER0881/2 ER1441/2 ER1451/2 ER0921/2 ER0891 ER1001/2 ER1461/2 ER0111/2 ER0121 ER0131/2/3 ER0781/2 ER0791/2 ER0931/2 ER1151/2 ER1321/2 ER0831/2 ER0701/2 ER1021/2 ER0141/2 ER0151/2/3 ER1741 Enzimas de Restricción BoxI BpiI PshAI BbvII BglI BglI BglII BglII Bme1390I ScrFI Fermentas Specificity Prototype Enzyme 5'=>3' AarI AarI AasI DrdI AatII Acc65I AdeI AlfI AloI AluI Alw21I Alw26I Alw44I ApaI new BamHI BauI BclI BcnI BcuI BfiI BfmI BfuI AatII KpnI (GGTAC^C) DraIII AlfI AloI AluI HgiAI BsmAI ApaLI ApaI BamHI BsiI BclI CauII SpeI BfiI SfeI BciVI Catalog # CACCTGC(N)4/8^ GACNNNN^NNGTC GACGT^C G^GTACC CACNNN^GTG ^(10/12)GCA(N)6TGC(12/10)^ AG^CT GWGCW^C GTCTC(N)1/5^ G^TGCAC GGGCC^C G^GATCC CACGAG(-5/-1)^ T^GATCA CC^SGG A^CTAGT ACTGGG(N)5/4^ C^TRYAG GTATCC(N)6/5^ GCCNNNN^NGGC A^GATCT CC^NGG GACNN^NNGTC GAAGAC(N)2/6^ ^8/13(N)GAG(N)5CTC(N)13/8^ CCTNAGC-5/-2^ GC^TNAGC C^CNNGG ER1581/2 ER1721/2 ER0991/2 ER0901/2 ER1231/2 ER1801 ER0011/2 ER0021/2 ER0031/2 ER0041/2 ER1411/2 ER0051/2/3 ER1841 ER0721/2 ER0061/2 ER1251/2 ER1591/2 ER1161/2 ER1501/2 ER0071/2 ER0081/2 ER1421/2 ER1431/2 ER1011/2 ER1311/2 ER1181/2new ER0091/2 ER1081 ER0871/2 ER1711 BplI Bpu10I BplI Bpu10I EspI SecI Bpu1102I BseDI BseGI BseJI BseLI BseMI BseMII BseNI BseSI BseXI Bsh1236I Bsh1285I BshNI BshTI Bsp68I Bsp119I Bsp120I Bsp143I Bsp143II Bsp1407I BspLI BspPI BspTI Bst1107I BstXI Bsu15I BsuRI BveI FokI (GGATG(N)9/13^) GGATG(N)2/0^ BsaBI GATNN^NNATC BsiYI CCNNNNN^NNGG BsrDI BseMII BsrI BseSI BbvI FnuDII McrI HgiCI AgeI NruI AsuII ApaI (GGGCC^C) MboI HaeII Bsp1407I NlaIV BinI AflII SnaI BstXI ClaI HaeIII BspMI GCAATG(N)2/0^ CTCAG(N)10/8^ ACTGG(N)1/-1^ GKGCM^C GCAGC(N)8/12^ CG^CG CGRY^CG G^GYRCC A^CCGGT TCG^CGA TT^CGAA G^GGCCC ^GATC RGCGC^Y T^GTACA GGN^NCC GGATC(N)4/5^ C^TTAAG GTA^TAC CCANNNNN^NTGG AT^CGAT GG^CC ACCTGC(N)4/8^ new ^7/12-13(N)GAAC(N)6TCC(N)12-13/7^ ER1491/2 BglI BglI BglII BglII Bme1390I ScrFI BoxI BpiI BplI Bpu10I Bpu1102I BseDI BseGI BseJI PshAI BbvII BplI Bpu10I EspI SecI FokI (GGATG(N)9/13^) GGATG(N)2/0^ BsaBI GATNN^NNATC .

Ligación T4 DNA ligasa .

. Muchas portan genes de resistencia a antibióticos.VECTORES O PLASMIDOS Son moléculas de AND Con origen de replicación. Pueden transferirse de una célula a otra.

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VECTOR DE CLONACION .

Vectores 4363 pb 2686 pb .

Inductores: •Calor •Fuente de carbono •Presencia de algun compuesto inductor .Vectores de expresión PROMOTORES Inducidos por diversos factores.

SELECCION .

Operón lac .

CLONACION DE UN GEN .

TRANSFORMACION DEL PLASMIDO .

ANALISIS DE LAS CLONAS .

DIVERSA Aisla enzimas de fuentes naturales Obtiene muestras de diferentes regiones del mundo. tanto sus capacidades cataliticas como sus propiedades cineticas . Aisla el ADN (metagenoma) Construye bibliotecas genomicas Caracteriza con equipos roboticos miles de clonas a la vez.

Secuenciación del ADN •Maxam-Gilbert •Sanger .

Expresión heteróloga .

ENZIMAS .

PRODUCCION DE ENZIMAS RECOMBINANTES A NIVEL INDUSTRIAL (FERMENTACIONES) .

INGENIERIA DE PROTEINAS .

MUTAGENESIS SITIO DIRIGIDA .

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MUTAGENESIS POR PCR COMBINATORIO .

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Recombinant Chymosin .

PROTEINAS DE LA LECHE .

Chymosin Reaction .

B. . licheniformis could produce the chymosin. but the signal sequences did not allow the secretion of the enzyme into the medium. Another issue with E. increasing process costs cosiderably. The problem with E. is that recombinant proteins are frequently synthesised as intracellular inclusion bodies. by addition of benzoic acid and the chymosin is isolated by filtration. E. coli.Recombinant Chymosin Production The problems outlined above for chymosin and its microbial substitutes can be alleviated by cloning the bovine gene into a suitable production strain and producing the enzyme by fermentation. Bacillus sp. coli is that it is not generally recognised as safe for human consumption. however. There are several possibilities for aproduction host: Eschrichia coli. coli is the favourite organism of molecular biologists and is most frequently used in gene cloning experiments. The most important decisions to be made were the choice of host/vector system. Bacillus species are non-pathogenic and are used industrially to produce several enzymes used in food processing such as amylases.

lactis chromosome and the yeast is grown by fed-batch fermentation. . After fermentation. This host was chosen as it is already used in starter cultures. It was found that the chtmosin could be produced in this host and good levels of secretion into the medium were achieved. Saccharomyces cerevisiae. lactis is used for the production of dairy grade betagalactosidase and its fermentation properties are well understood.Recombinant Chymosin Production Lactococcus lactis. but production levels were found to be very low. K. the yeast is killed by addition of benzoic acid and the chymosin is isolated by filtration. Kluveromyces lactis. Difficulties were experienced in achieving high secretion rates in yeast. The chymosin gene was inserted into the K.