ENZIMAS HIDROLITICAS DE USO INDUSTRIAL

Se emplean para ruptura de polimeros naturales Grandes volumenes (ton) Bajo costo Purificacion sencilla (en general, parcial)

Fuentes: Plantas, Animales y Microbianas Plantas : Proteasas : papaina, bromelina

Amiloliticas: beta amilasas de los cereales. La mayoria se emplea como extractos secos sin purificar.

Animales (en general de glandulas u organos)

proteasas: tripsina, pepsina, renina lipasas, esterasas Se emplean en variadas calidades, desde extractos a ultrapure

Microbianas (de bacterias y hongos) proteasas, lipasas y carbohidrasas

PRINCIPALES ENZIMAS HIDROLITICAS INDUSTRIALES

Enzima
Proteasas alcalinas

Proceso
detergentes
elaboracion de quesos

Fuente
bacterias
hongos

60 %

Proteasas acidas Proteasas neutras Amilasas Isomerasas Invertasa Lactasa celulasas Pectinasas

30 %

Varios Bacterias, plantas y animales (cueros,farmaceuticos,carnes) industria del almidon (destilados, bacterias, hongos y plantas fermentaciones, alimentos, textiles) jarabes de fructosa Bacterias, hongos Levaduras jarabes de fructosa leches levaduras celulosas hongos vinos, cerveza, condimentos hongos

10 %

Lipasas

Varios (sintesis quimica, detergentes, etc)

bacterias, hongos y levaduras, animales

Caracteristicas de los microorganismos

Hongos : Generos Aspergillus, Saccharomyces Facilmente cultivables en medios baratos Enzimas exo-celulares Preferentemente termoestables y resistentes a stress (pH, concentracion salina)

Glicosil hidrolasas (Carbohidrasas) * Mas de 20 enzimas diferentes segun sustrato y producto formado
Enzyme Amylosucrase Sucrose phosphorylase Glucan branching enzyme Cyclomaltodextrin glycosyltransferase Amylomaltase Maltopentaose-forming alpha-amylase Alpha-amylase Oligo-1,6-glucosidase Alpha-glucosidase Amylopullulanase Cyclomaltodextrinase Isopullulanase Isoamylase Maltotetraose-forming alpha-amylase Glucodextranase Amylopectin Trehalose-6-phosphate hydrolase Maltohexaose-forming alpha-amylase Maltogenic amylase (Beta amilasa) Neopullulanase Malto-oligosyl trehalase hydrolase Malto-oligosyl trehalose synthase Main substrate Sucrose Sucrose Starch, glycogen Starch Starch Starch, glycogen Starch Starch Starch 1,6-alpha-D-glucosidic linkages in some oligosaccharides, Starch Pullulan linear and cyclomaltodextrin Starch Trehalose Starch Starch Pullulan Trehalose Maltose

CARBOHIDRASAS MAS IMPORTANTES

AMILASAS PECTINASAS CELULASAS GLUCOSA ISOMERASA INVERTASA BETAGALACTOSIDASA Principales productos que se obtienen (segn grado de hidrolisis)

hidrolizados de almidn

dextrinas
jarabe de maltosa jarabe de glucosa jarabe de fructosa

HIDROLISIS DEL ALMIDON

amilosa (uniones glu 1-4)

proporcion variable
segn tipo de grano

Composicion

amilopectina (uniones glu 1-6)

Tipo de hidrolisis

quimica :calentamiento en medio acido

enzimatica

Producto
- amilasa :1-4(endo) glucosidasa glucoamilasa :1-4(exo) glucosidasa y (1-6) en mucha menor proporcion Enzimas Y Productos - amilasa : 1-4(exo) glucosidasa pululanasa : 1-6 glucosidasa isoamilasa : 1-6 glucosidasa dextrinas glucosa

maltosa

glucosa

ALFA- AMILASAS
MICROORGANISMOS PRODUCTORES: Bacillus amiloliquefaciens y Bacillus licheniformis (enzima termoestable, Ta optima: 90oC). La secuencia se ha clonado en plantas de tabaco y obtenido semillas transgenicas pero no se emplean industrialmente Aspergillus oryzae y Aspergillus niger (menor Ta pero mas estabilidad al pH)

ENZIMAS Peso molecular aproximado : 50 Kda pH optimo : neutro ; requieren Ca 2+ Exocelulares. Segn el tipo de enzima y la concentracion del sustrato pueden obtenerse distintos grados de hidrolisis llegando a liquefaccion: oligosacaridos o sacarogenica.

APLICACIN: Primera etapa de la hidrolisis del almidon: Se disminuye su

viscosidad. METODO DE PRODUCCION

Cultivo en batch o batch alimentado. Las cepas presentan gran variabilidad, por lo cual no puede emplearse el cultivo continuo . Tipo de cultivo : sumergido y aireado. Condiciones : pH : neutro. Temperatura : 40-45 o C (cepas termofilas) La produccin comienza al finalizarse la fase exponencial de crecimiento, previo a la entrada en esporulacion. Requiere inductor (almidon). Hay represin catablica por glucosa. No se sintetizan bajo limitacion de nitrogeno. Las amilasas fngicas tienen similar modo de produccin

pero el proceso es mas lento (3-4 das)

Beta - AMILASAS
1- ORIGEN VEGETAL : CEBADAS . Durante su germinacion actuan las alfa y beta amilasas para producir la malta. MICROBIANAS : Bacillus polymixa y B. circulans.

2- ENZIMAS

Para los productos fermentados naturales se usan en

general las vegetales pero las microbianas son mas estables a la

temperatura y los pH extremos.

Por accion de esta enzima sobre el

almidon se obtiene una mezcla de jarabe de maltosa + dextrinas

GLUCOAMILASAS
1- ORIGEN

Fungico : Aspergillus niger Rhizopus niveus 2- ENZIMA Se producen como ISOENZIMAS cuyo perfil varia con las composicion del medio y el modo de produccion. Las isoenzimas tienen distinta reactividad sobre el almidon, con lo cual pueden hacer variar el tiempo de contacto, el tipo de producto y las cantidades requeridas. Las enzimas son TERMOLABILES. Son EXOCELULARES 3- PRODUCTOS DE REACCION : glucosa, maltosa y dextrinas. Hidroliza uniones 1-4 y 1-6, aunque estas ultimas a menor velocidad. 4- METODO DE PRODUCCION Cultivo sumergido aireado batch o continuo. Requiere inductores (almidon o dextrinas). Glucosa, acido glutamico y lactosa producen represion catabolica. Pueden producirse simultaneamente proteasas y glicosidasas que varian el perfil de isoenzimas. (SENSIBILIDAD A PROTEASAS!) Produccion en el comienzo de la fase estacionaria.

PRODUCCION INDUSTRIAL DE JARABES DE GLUCOSA Y FRUCTOSA (Novo Industries. Desde 1977)

En Argentina: productos de Maiz http://www.pdm.com.ar Almidon de maiz al 40 % P/V Agua desionizada Ca2+ (20 ppm) 5 min a 105 oC (gelatinizacion) Ph= 5.8- 6.5 (ajuste desde 4.5)

alfa- amilasa 0.15 %

Se requiere cambio de pH en las diferentes etapas. 60 min a 95 o C (liquefaccion) pH 4.5, TEMP= 60 o C, filtracion disminucion de la viscosidad

Dilucion (10-20 % peso seco)

Reaccion reversible

glucoamilasa (0.15 U/g almidon)

48 horas a 60 o C

Puede quedar isomaltosa

Sacarosa

invertasa

Jarabe de glucosa (98 % rendimiento)

xilosa isomerasa

Jarabe de glucosa/ fructosa (60 : 40)

GLUCOSA- ISOMERASA
1-

MICROORGANISMOS PRODUCTORES Bacillus coagulans ( Novo) Actinoplanes missouriencis (Gist Brocades) Streptomyces spp (Miles) ENZIMA Es una xilosa isomerasa inducible por sustrato. Es intracelular Temperatura optima elevada Requiere Mg o Co. Es inactivada por colorantes, coloides y sales

2-

METODO DE PRODUCCION. Proceso batch o continuo. Se requieren fuentes de carbono de lenta metabolizacion y el sustrato inductor (xilosa). La glucosa ejerce represion catabolica. El exceso de oxigeno no favorece su produccion. La produccion depende de la fuente de nitrogeno y de carbono.
34-

PRODUCTO : Jarabe de fructosa Inmovilizacion de la enzima o las celulas. Materia prima : jarabe de glucosa 93-96 % diluido al 40-45% (peso seco) con agua desionizada Filtrar por C activado . Aadir Mg, llevar a pH = 8.5 y temp= 60-65 o C. Incubar 1 a 4 Hs. Recuperacion : acidificar, filtrar, intercambio ionico.

ENZIMAS PROTEOLITICAS

MAYORMENTE DE ORIGEN MICROBIANO EXOCELULARES SE CLASIFICAN SEGN PH OPTIMO EN: ALCALINAS : para productos de lavar y cueros. NEUTRAS : para panificacion, saborizar quesos y productos lacteos, bebidas, carnes, produccion de gelatinas, condimentos (Japon). ACIDAS : para queseria.

Nota: Las PROTEASAS NEUTRAS que se usan con fines medicos son de origen vegetal o animal (pancreas).

1- PROTEASAS ALCALINAS
1- MICROORGANISMOS Bacillus (licheniformis, megaterium, amiloliquefaciens) Streptomyces (griseus, fradie, etc) Aspergillus (niger, oryzae, flavus) 2- ENZIMAS DE Bacillus : subtilisinas serina -proteasas no inhibidas por EDTA estabilidad a altas temperaturas pH optimo alcalino (9 a 11) estabilidad frente a quelantes poco estables a los surfactantes se comercializan como granulos o particulas (no en polvo) 3- PRODUCCION Cultivo sumergido en batch o batch alimentado. - Amonio y aminoacidos deben mantenerse en baja concentracin ya que inhiben su produccion

2- PROTEASAS ACIDAS

Su uso mas importante es como sustitutos de la quimosina bovina en la elaboracion de quesos. Provocan la coagulacion de la caseina por hidrolisis de un enlace peptidico especifico sin hidrolisis generalizada. Previamente deben agregarse cultivos starters que producen la acidificacion por formacion de acido lactico. 1- MICROORGANISMOS
HONGOS

Mucor pusillus Endothia parasitica Mucor miehei

Desde 1990 se emplea industrialmente la renina (bovina) recombinante clonada en E. coli o en Levadura (Gist Brocades- Pfizer) Salvo en quesos especiales artesanales 2- PRODUCCION: En sustrato solido o en medio liquido, segn el tipo de organismos

Otra aplicacin importante de las proteasas acidas es en la sintesis del aspartame. Se emplea la termolisina obtenida de Bacillus

Reacciones catalizadas por Lipasas:

Hidrolisis de esteres
Sintesis de esteres (medios no acuosos) Transesterificaciones

Caracteristicas de lipasas microbianas

REGULACION DE LA EXPRESION (lip) Y PRODUCCION DE UNA LIPASA BACTERIANA -La produccion/secrecion de lipasa es un fenomeno de fase estacionaria temprana - Pueden o no se inducidas por lipidos e inhibidas por acidos grasos - La enzima sufre rapida degradacion - Los polimeros tienden a estabilizarla (es enzima de superficie y requiere de una interfase hidro/lipofilica) - En algunos casos se expresa conjuntamente con su chaperona que ayuda a la secrecion en el espacio periplasmico

Modelos de secrecion de distintas lipasas microbianas

ABC (Tipo 1) no tienen peptido seal

Atraviesan la pared con foldasas periplasmicas mas o menos especificas Sec y TAT : tienen secuencia seal que en TAT es una twin Arg (en Gram + y -)

Sec

Lipases and Esterases Lipases and Esterases hydrolyze fats and oils. Most of the enzymes listed below are designed for use in food systems such as enzyme modified cheese. They are not designed for use in large scale commercial processes. ENZECO ESTERASE / LIPASE Derived from Mucor miehei, primarily esterase activity. Hydrolyzes triglycerides and produces high levels of short chain fatty acids without excessive production of the longer chain fatty acids.(blue cheese) ENZECO MICROBIAL LIPASE 50,000 Derived from A. niger. Random cleaving of the 1,3 positions on fats and oils. Commonly used for enzyme modified cheese when a kosher non animal derived lipase is required. ENZECO MICROBIAL LIPASE CONCENTRATE Derived from A. niger. It is a high activity material. The enzyme will hydrolyze fats and oils most commonly at the 1,3 position. It is a powder preparation that is most commonly used as the source of lipase for dietary supplements when a non animal derived lipase is desired. ENZECO MICROBIAL LIPASE RO Derived from Rhizopus oryzae. This enzyme produces high amounts of short chain fatty acids but does not produce as many long chain fatty acids as the A. niger or pancreatic lipase. Very good for enzyme modified cream. ENZECO LIPASE XX From Candida rugosa. An aggressive lipase that can hydrolyze 90%+ triglycerides to fatty acids. Most effective if temperatures do not exceed 35 degrees C. This preparation is commonly used in non food systems. ENZECO LIPASE CONCENTRATE From Candida cylindracea. An aggressive lipase that can hydrolyze 90%+ triglycerides to fatty acids. Most effective if temperatures do not exceed 35 degrees C.

Estrategias para la busqueda de nuevas enzimas con caracteristicas mejoradas Ejemplo de la empresa Novozymes:
For the past years a considerable effort has been made within Novozymes to build up a microbial screening and cloning platform focusing on the utilization of nature biodiversity in the discovery of new industrial enzymes. This has triggered the research scientists within Novozymes to undertake the cloning of a large number of microbial enzymes, in attempts to create new products with potential industrial interest. Recent developments in molecular techniques, especially expression cloning and molecular screening by PCR, have significantly contributed to the efficiency and accuracy by which the new enzymes have been discovered.
Expression cloning of fungal enzyme cDNAs combines the ability of baker yeast (Saccharomyces cerevisiae) to express heterologous (fungal) enzyme genes with the utilization of sensitive, simple and reliable enzyme assays. The fungus of interest is fermented under conditions that give high-level production of the desired enzyme(s), poly(A)+RNA is subsequently isolated from fungal mycelium and used to construct a cDNA expression library in a yeast or a fungal expression vector. Plasmid DNA isolated from subpools of the library is transformed into the yeast and the relevant cDNA clones are detected and isolated directly based on the encoded enzyme activity. After characterization and classification of the cDNAs by sequencing, a representative cDNA for each enzyme is subcloned into e.g. an Aspergillus expression vector for high-level production of the monocomponent enzyme in e.g. Aspergillus oryzae.