MEIOS DE CULTURA

A prtica laboratorial em microbiologia depende muito da capacidade de fazer crescer e de manter microrganismos em meio laboratorial, ou seja da capacidade de os cultivar. A cultura de microrganismos apenas possvel se existirem meios de cultura apropriados.

So ainda necessrios meios de cultura especiais para o isolamento de determinados microrganismos, assim como para a sua identificao, para testar a sua sensibilidade a antibiticos, para analisar a qualidade da gua, para analisar a qualidade dos alimentos, etc.

MEIOS DE CULTURA
Apesar de todos os microrganismos necessitarem de fontes de energia, carbono, azoto, factores de crescimento e oligoelementos, a composio especfica de um meio de cultura satisfatrio depende da espcie a cultivar.

O conhecimento do habitat normal de um microrganismo normalmente muito til na seleco do meio de cultura mais apropriado ao seu crescimento.

Adicionalmente, frequente usar o meio de cultura para seleccionar e cultivar microrganismos especficos ou para identificar uma espcie em particular.

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Meios de Composio sintticos: Definida ou Meios

So meios relativamente simples, conhecemos a composio exacta. Podem conter apenas:

Uma fonte de carbono Uma fonte de azoto Uma fonte de fosfato Uma fonte de sulfato Minerais

dos

quais

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Meios Complexos Meios de cultura cuja composio contem alguns ingredientes de composio qumica no definida e em quantidades no definidas. So muito teis, pois podem ser suficientemente ricos e completos para permitir o crescimento de diferentes microrganismos, satisfazendo as suas necessidades nutricionais.

So muitas vezes necessrios pois as necessidades nutricionais de determinado microrganismo podem ser desconhecidas.

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Os meios complexos, contm componentes no definidos como:
Peptonas (hidrolisados proteicos da digesto parcial de carne, casena, soja, gelatina, etc.)
Extrato de carne (extratos aquosos de carne de vaca), contendo aminocidos, peptdeos, nucleotdeos, cidos orgnicos, vitaminas e minerais. Extrato de levedura (extratos aquosos de levedura de cerveja), contendo compostos carbonados e azotados e sendo muito rico em vitaminas do complexo B. Agar MacConkey, Caldo de extrato de carne, etc.

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Meios slidos:
Quando pretendemos obter, por exemplo, colnias isoladas, necessitamos de meios slidos.

Como se obtm um meio slido?

Adicionamos 1-2% de agar (normalmente 1,5%) a meios lquidos.

Agar?
um polmero sulfatado composto sobretudo por Dgalactose, 3,6-anidro-L-galactose e cido D-glicurnico, normalmente extrado de algas vermelhas.

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Agar - Vantagens
Polmero muito til como agente solidificante.

Aps ser derretido em gua em ebulio, pode ser arrefecido at 40-42C sem solidificar.

Aps solidificar, o agar no volta a liquefazer-se at uma temperatura de 80-90C. A maior parte dos microrganismos no o digerem.

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Meios de uso genrico
Meios que suportam o crescimento de muitos microrganismos (Ex. caldo de soja e triptona, agar com soja e triptona).

Meios Enriquecidos
Meios aos quais foram adicionados nutrientes especficos ou sangue para encorajar o crescimento de heterotrficos fastidiosos.

Meios Selectivos
Consistem em meios que favorecem o crescimento de um microrganismo particular.

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Exemplo de Meios Selectivos
A adio de fucsina bsica ou de violeta cristal, favorece o crescimento de bactrias gram-negativo, uma vez que inibe o crescimento de bactrias gram-positivo, mas no afecta as primeiras.

Exemplos destes meios so o agar MacConkey, o endoagar e o agar eosina-azul de metileno, muito usados para deteco de E. coli e coliformes em guas, j que os corantes inibem o crescimento de gram-positivos.
As bactrias tambm podem ser seleccionadas atravs da sua incubao em meios com nutrientes que elas conseguem usar especificamente (ex. celulose).

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Meios Diferenciais
Possibilitam distinguir diferentes grupos de bactrias, permitindo inclusivamente a identificao de bactrias.

O meio de agar e sangue diferencial (mas simultaneamente enriquecido), distinguindo bactrias hemolticas de bactrias no-hemolticas. Neste meio, bactrias hemolticas (ex. estreptococos isolados de gargantas infectadas) produzem halos muito definidos em volta das suas colnias, devido hemlise dos eritrcitos.

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Outros exemplos de Meios Diferenciais
O Agar MacConkey diferencial (e tambm selectivo). Contm lactose e vermelho neutro (corante).

Colnias de bactrias capazes de fermentar lactose surgem a cor-de-rosa avermelhado, sendo fcil detectlas e diferenci-las de colnias de bactrias que no so capazes de fermentar lactose. Assim um meio diferencial.

Tambm um meio selectivo pois, como j vimos, os corantes que inclui, inibem o crescimento de bactrias gram-positivo.

ISOLAMENTO
Cultura Pura:
Populao de clulas provenientes de uma nica

clula.

Obteno de uma cultura pura:

Se uma mistura de clulas for espalhada numa placa de cultura com meio slido de forma que cada clula cresa numa colnia separada, cada agrupamento formado (devido ao crescimento de microrganismos), ou seja cada colnia isolada pode dar origem a uma cultura pura. A tcnica de espalhamento uma metodologia simples para a obteno de culturas puras.

ISOLAMENTO
Tcnica por espalhamento:
Nesta tcnica um pequeno volume de mistura microbiana diluda (com cerca de 100 a 200 clulas) transferido para o centro de um meio de agar numa placa de Petri, sendo espalhado homogeneamente na superfcie do meio.

ISOLAMENTO
Tcnica por espalhamento: Uma pequena amostra de determinada mistura microbiana pipetada e colocada no centro de uma placa de petri com meio slido (agar). De seguida, uma vareta de vidro mergulhada num goblet com etanol. A vareta ainda levada chama e deixada arrefecer. Com a vareta a amostra espalhada homogeneamente sobre o meio de cultura e, de seguida, ser incubada.

ISOLAMENTO
Isolamento em placa por estrias:

Culturas puras tambm podem ser obtidas por mtodo de estrias.

Nesta tcnica, a mistura microbiana transferida para a periferia de uma placa de petri com meio slido (agar), por meio de uma ansa de repicagem. De seguida, a amostra , por meio da ansa, arrastada sucessivas vezes atravs da superfcie do meio de cultura em diversos padres. H medida que se vai dando o estriamento, clulas individuais vo ficando isoladas, desenvolvendo-se ento colnias isoladas.

ISOLAMENTO
Isolamento em placa por estrias:
Nesta imagem, observa-se a transferncia de uma amostra para a placa de Petri, atravs de uma ansa de repicagem

De seguida, procede-se ao estriamento. Um dos padres mais usuais de arrastamento observado nesta imagem.

ISOLAMENTO
Outro mtodo de isolamento em placa por estrias:
Queimar ansa e arrefecer

Queimar ansa e arrefecer

Queimar ansa e arrefecer

Queimar ansa e arrefecer

TANTO NA TCNICA POR ESPALHAMENTO, COMO NA TCNICA POR ESTRIAS, O SUCESSO DEPENDE DA OBTENO DE UMA SEPARAO ESPACIAL DE CLULAS INDIVIDUALIZADAS

CULTURAS POR INCORPORAO

Nesta tcnica tambm possvel obter colnias isoladas e, assim, obter culturas puras. Nesta tcnica, uma diversas vezes, com suficientemente a microbiana, de forma isoladas. amostra inicial diluda o objectivo de reduzir densidade populacional a poder obter colnias

De seguida, pequenos volumes de vrias amostras diludas so misturados com agar liquefeito (arrefecido a 45C) e esta mistura deitada numa placa de Petri esterilizada.

CULTURAS POR INCORPORAO

Obteno de culturas por incorporao

Uma amostra original diluda vrias vezes.

De seguida, as amostras mais diludas so misturadas com meio de cultura liquefeito e deitadas em placas (ou caixas) de Petri.

NORMAS DE SEGURANA
Uso obrigatrio de bata No comer no laboratrio

Ter em ateno que alguns microrganismos que iro ser estudados so potencialmente patognicos
Lavar as mo, aps sair do laboratrio O trabalho chama potencialmente perigoso. Em caso de acidente, fechar imediatamente a torneira de segurana. Na primeira aula laboratorial, observar a localizao das torneiras de segurana. Desligar a lmpada do microscpio sempre que no esteja a ser utilizado. Nunca arrastar o microscpio sobre a bancada. No final da aula, deixar a bancada arrumada.

NORMAS DE SEGURANA
No final da aula, tapar o microscpio e limpar a objectiva de 100x com kleenex. Para marcar as placas de Petri: MA G1,2,3 Nome do trabalho e Data.

A porta do laboratrio deve estar sempre fechada.

No entrar e sair do laboratrio constantemente. Ao trabalhar chama no falar e evitar movimentos que provoquem deslocaes bruscas de ar. No incio de cada aula, feita uma introduo ao trabalho a realizar, assim como se iro rever os assuntos da aula anterior atravs de questes aos alunos.

Assim, importante que no incio de cada aula estejam todos presentes (15 minutos de tolerncia).