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Universidade Estadual do Centro-Oeste UNICENTRO Departamento de Qumica - DEQ

GC e GC/MS: Princpios da Tcnica e Aplicaes Forenses

Jeferson Meira dos Santos Matheus Felipe Viante

Cromatografia Gasosa
- Importante mtodo analtico de separao; - Anlises qualitativas e quantitativas; - Separao rpida e de alta resoluo; - Pode ser acoplado a um MS: importantes aplicaes forenses; - Apresenta limitaes: Quais compostos podem ser separados por GC?

Cromatografia Gasosa
- Fase mvel: uma corrente (fluxo) de gs;
- Fase estacionria: a)Lquida (cromatografia gs-lquido); b)Slida (cromatografia gs-slido).

FM (gs)

FE (slida ou lquida)

Cromatografia Gasosa
Quais compostos podem ser separados por GC? Os compostos devem: - Ser solveis (pelo menos parcialmente) no gs de arraste;

- Devem estar no estado gasoso (misturas volatilizveis);


- Apresentarem pontos de ebulio at 300C; - Ser termicamente estveis.

CG - Instrumentao
1 2 6

5 3

CG - Instrumentao

CG - Instrumentao

GC Gs de arraste
Caractersticas:
- Inerte: NO reage com os componentes da amostra - apenas os carrega pela coluna;

Puro: deve ser degradao da FE;


H2O, O2

isento

de

impurezas

oxida / hidrolisa algumas FE

Hidrocarbonetos

rudo no sinal de DIC

GC Gs de arraste
Caractersticas: - Custo: gases de altssima pureza podem custar muito caro; Maior grau de pureza = Maior custo! - Compatvel com detector: cada detector demanda de um gs especfico para melhor funcionamento;
DCT DIC DCE
He , H2 N2 , H2 N2 (SS), Ar + 5% CH4

GC Gs de arraste
Alimentao de gs:
3 4 2 1 6

1 - Cilindro de Gs 2 - Regulador de Presso Primrio 3 - Traps para eliminar impurezas do gs 4 - Regulador de Presso Secundrio 5 - Regulador de Vazo (Controlador Diferencial de Fluxo) 6 - Medidor de Vazo (Rotmetro)

GC Injeo da amostra Injeo On column:

Microseringa de 10 L:
mbolo agulha (inox 316)

corpo (pirex)

GC Injeo da amostra
Parmetros de injeo:
- Temperatura: Suficientemente elevada para vaporizar a amostra imediatamente, sem degradao;
Regra Geral: 50C acima da TE do composto menos voltil.

- Volume injetado:
COLUNA
empacotada = 3,2 mm (1/4) capilar = 0,25 mm

Amostras Lquidas
0,2 L ... 20 L 0,01 L ... 3 L

Amostras Gasosas
0,1 ml ... 50 mL

0,001 ml ... 0,1 mL

GC Coluna

Recheada com slido pulverizado (FE slida ou FE lquida depositada sobre as partculas do recheio)

EMPACOTADA = 3 a 6 mm L = 0,5 m a 5 m Hidrocarbonetos

CAPILAR = 0,1 a 0,5 mm Lsinal = 5 de m DIC a 100 m rudo no

Paredes internas recobertas com um filme fino (frao de m) de FE lquida ou slida

GC Coluna
Caractersticas de uma FE ideal: - Seletiva: Interagir diferencialmente com os componentes da amostra; = Maior custo! - Estabilidade qumica durabilidade da coluna; e trmica: Maior

- Pouco viscosa: Menor resistncia transferncia do analito entre as fases;

- Elevado grau de pureza: colunas reprodutveis; ausncia de picos fantasma.

GC Coluna
FE lquida SUPORTE Slido inerte poroso Tubo capilar de material inerte

Para minimizar a perda de FE lquida por volatilizao, normalmente ela :

Entrecruzada: as cadeias polimricas so quimicamente ligadas entre si

Quimicamente ligadas: as cadeias polimricas so presas ao suporte por ligaes qumicas

GC Temperatura da coluna
- Alm da interao com a FE, o tempo que um analito demora para percorrer a coluna depende de sua PRESSO DE VAPOR (p0);
- p0

depende da estrutura qumica do analito e da TEMPERATURA DA COLUNA;

Temperatura da coluna

Presso de vapor

Velocidade de migrao

ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE (MENOR RETENO)

GC Temperatura da coluna
TEMPERATURA DA COLUNA

GC Forno da coluna
Caractersticas desejveis de um forno:
- Ampla faixa de temperatura de uso: Pelo menos Tambiente at 400C; = Maior custo!

- Temperatura independente dos demais mdulos: No deve ser afetada pela T do injetor e do detector; - Temperatura uniforme em seu interior: Sistemas de ventilao eficientes para manter a T homognea em todo o forno;

GC Forno da coluna
Caractersticas desejveis de um forno:
- Fcil acesso coluna: A coluna pode ser frequentemente trocada; = Maior custo!

- Aquecimento e resfriamento rpido: Importante em anlises de rotina e novas metodologias;


- Temperatura estvel e reprodutvel: A T deve ser mantida com exatido e preciso de 0,1C.

GC Forno da coluna
Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE: TCOL ALTA:
- Componentes mais volteis no so separados - Componentes menos volteis eluem mais rapidamente

TCOL BAIXA:
- Componentes mais volteis so separados - Componentes menos volteis demoram a eluir, saindo como picos mal definidos

GC Forno da coluna
Programao linear de temperatura:
- A T do forno pode ser variada linearmente durante a separao; = Maior custo!
TEMPERATURA

TFIM
R TINI

tINI TEMPO

tFIM

GC Forno da coluna
Programao linear de temperatura:
Consegue-se boa separao dos componentes da amostra em menor tempo

Desvantagens:
- VARIAES DE VAZO DO GS DE ARRASTE A viscosidade de um gs aumenta com a temperatura.

- DERIVA (DRIFT) NA LINHA DE BASE


Devido ao aumento de volatilizao de FE lquida.

GC Detectores
- Dispositivos que examinam continuamente o material eluido, gerando sinal para as substncias que no o gs de arraste.

Grfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA Idealmente: cada substncia separada aparece como um PICO no cromatograma.

GC Detectores
UNIVERSAIS:
Geram sinal para qualquer substncia eluida.

SELETIVOS:
Detectam apenas substncias com determinada propriedade fsico-qumica.

ESPECFICOS:
Detectam substncias que possuam determinado elemento ou grupo funcional em suas estruturas.

GC Detectores
Detector por condutividade trmica (DCT ou TCD):
PRINCPIO Variao na condutividade trmica do gs quando da
eluio de um analito.

A taxa de transferncia de calor entre um corpo quente e um corpo frio depende da condutividade trmica do gs no espao que separa os corpos

Se a condutividade trmica do gs diminui, a quantidade de calor transferido tambm diminui - o corpo quente se aquece.

GC Detectores
Detector por condutividade trmica (DCT ou TCD):
SELETIVIDADE Observa-se sinal para qualquer substncia eluida diferente do gs de arraste = UNIVERSAL. Com DCT, a rea dos picos cromatogrficos MUITO dependente da vazo do gs de arraste. Gs de arraste com DCT: He ou H2 He ou H2 outro gs

um detector NO-destrutivo!

GC Detectores
Detector por captura de eltrons (DCE ou ECD):
PRINCPIO Supresso de um fluxo de eltrons lentos (termais) causada
pela sua absoro por espcies eletroflicas.

Um fluxo contnuo de eltrons lentos estabelecido entre um nodo (fonte radioativa b -emissora) e um ctodo.

Na passagem de uma substncia eletroflica alguns eltrons so absorvidos, resultando uma supresso de corrente eltrica.

AB + e - AB - + energia

GC Detectores
Detector por captura de eltrons (DCE ou ECD):
GS DE ARRASTE Funcionamento do DCE muito dependente da natureza do gs de arraste MAIS USADOS:

N2 Ar + 5% CH4

Geram eltrons lentos quando bombardeados com b -

O gs deve ser o mais puro possvel !!! (traos de H2O e O2 comprometem o sinal do DCE)

- Alta sensibilidade: halogenados, perxidos, quinonas e grupos nitro;

- Baixa sensibilidade: aminas, lcoois e hidrocarbonetos;


- No altera a amostra significativamente.

GC Detectores
Detector por ionizao em chama (DIC ou FID):
PRINCPIO: Formao de ons quando um composto queimado em uma chama de hidrognio e oxignio.

O efluente da coluna misturado com H2 e O2 e queimado. Como numa chama de H2 + O2 no existem ons, ela no conduz corrente eltrica.

GC Detectores
Detector por ionizao em chama (DIC ou FID):

Quando um composto orgnico elui, ele tambm queimado. Como na sua queima so formados ons, a chama passa a conduzir corrente eltrica

Queima de substncias com ligaes C-H

CH + O CHO+ + e1 on formado a cada ~105 tomos de C queimados

GC Detectores
Detector por ionizao em chama (DIC ou FID):
SELETIVIDADE Seletivo para substncias que contm ligaes C-H em sua estrutura qumica.

Compostos que NO produzem resposta no DIC:


Gases nobres H2, O2, N2 CO, CO2, CS2 CCl4, peralogenados NH3, NxOy SiX4 (X = halognio) H2O HCOOH, HCHO *

Desvantagem: um detector destrutivo!

GC Detectores
Detector de nitrognio-fsforo (NPD):
Modificao do DIC altamente seletiva para compostos orgnicos nitrogenados e fosforados

Prola de sal de metal alcalino: RbCl (normal), KCl

Seletividade para fosforados ou nitrogenados: 10.000 x - 100.000 x em relao a hidrocarbonetos similares

GC Detectores
Detectores Qualitativos
Cromatografia Gasosa com Deteco Espectromtrica de Massas (CG-EM / GC-MS);

Cromatografia Gasosa com Deteco Espectromtrica por Emisso Atmica (CG-EA);


Cromatografia Gasosa com Deteco Espectromtrica por Absoro no Infra-Vermelho (CG-IV).
Identificao muito confivel quando combinados a tcnicas de identificao baseadas em reteno.

GC Detectores Espectrmetro de massa (MS):


PRINCPIO A amostra fragmentada e ionizada em um padro caracterstico da espcie qumica. ABCDE + e- ABCDE.+ + 2 e-

ABCDE.+ AB. + CDE+ ABCDE.+ AB+ + CDE. ABCDE.+ A+ + BCDE.

ABUNDNCIA

O grfico do nmero de ons formados em funo da razo Massa / Carga dos ons o ESPECTRO DE MASSAS do analito.

MASSA / CARGA

GC Detectores
Espectrmetro de massa (MS):
- Interface cromatgrafo - espectrmetro:
Separador Molecular O gs de arraste leve (He) difunde mais rapidamente que o analito e tende a ser drenado para o vcuo.

CG

EM

Vcuo Cmara de Ionizao

Coluna Capilar

Interface Capilar Direta Com colunas capilares a vazo baixa de gs de arraste pode ser drenada pelo sistema de vcuo.

GC Detectores
Espectrmetro de massa (MS):
- Sistema de Controle e Aquisio de Dados :

MANDATRIO que sistemas GC-MS sejam totalmente controlados por microcomputador.

COMPUTADORES RPIDOS E COM GRANDE CAPACIDADE DE ESTOCAGEM DE DADOS

GC Detectores
Espectrmetro de massa (MS):
- Espectros de massas completos
TIC

coletados e arquivados em intervalos regulares de tempo;


- Cromatograma de ons totais (TIC);

- Monitoramento do on selecionado (SIM); TIC


Universal Similar a DIC

SIM

SIM
Seletivo Maior Sensibilidade

GC Detectores
Espectrmetro de massa (MS):
Busca automtica em bibliotecas de espectros: comparao estatstica ( Probability Based Matching )

ESPECTRO DESCONHECIDO

PBM
BIBLIOTECA DE ESPECTROS

Lista com possveis candidatos + porcentagem de confiabilidade

GC Detectores
Espectrmetro de massa (MS):
# 1 NOME 1-dodeceno 1-dodecanol ciclododecano 2-dodeceno 1-undeceno FRM. % C12H24 99 C12H26O 91 C12H24 91 C12H24 66

PBM de um eluato desconhecido (1-dodeceno)

2 3 4 5 6

C11H22 35 8-metil-3-undeceno C12H24 32

Identificao pouco confivel de espectros muito simples

LIMITAES:

Limitada pelo tamanho da base de dados (NIST = 66.000 espectros)


Diferenas entre espectros gerados por diversos EM

rea de Aplicao Resduos de disparo de armas de fogo 5,6

Referncia

Identificao de origem de drogas


Anlise de drogas de abuso em materiais biolgicos Lquidos Inflamveis em escombros Deteco de explosivos Testes de drogas em esporte Autenticao de produtos Proteo de produtos industriais por meio de assinaturas isotpicas Anlise de tintas DNA

7,8
9,10 11,12 13,14 15,16 17,18 19,20 21,22 23,24

Aplicaes da tcnica de Espectrometria de Massas em Cincias Forenses

Estudo de Caso
(Case Report)

Case study: fatal poisoning by malathion


T.S.Thompsona*, R.G.Treblea, A.Maglioccob, J.R.Roettgera, J.C.Eichhorsta
aSaskatchewan

Health, Provincial Laboratory, 3211 Albert Street, Regina, Saskatchewan, Canada S4S5W6 bDepartment of Pathology, College of Medicine, University of Saskatchewan, B419 Health Sciences Building, 107 Wiggins Road, Saskatoon, Saskatchewan, Canada S7N 5E5

Forensic Science International 95 (1998) 8998

GC Estudo de caso
Introduo:
- Malation: inseticida sinttico organofosforado; - Utilizado no controle de pragas em frutas e vegetais;

- Tambm no controle de parasitas animais e tratamento para piolhos;


- Exposio ocupacional: ligeiramente txico;

- Numerosos casos acidentais e


intencionais.

GC Estudo de caso
O caso:
- Uma mulher de 40 anos foi encontrada morta pelo marido s 20h; - Ela estava de bruos no cho do seleiro; - No local havia: Canivete Exxacto, mao de cigarros e cigarros j utilizados; No balco, uma garrafa de 500 mL de malation, com 50-100 mL de lquido. Estava tampada.

GC Estudo de caso
O caso:
- Feridas mltiplas no pulso esquerdo, manchas de sangue no cho e na mo; - No se observou sinais de luta corporal ou trauma;

GC Estudo de caso
O caso:
- Houve incontinncia de fezes e urina ; - Forte odor qumico que exalava do corpo, caracterstico de malation; - Amostras foram retiradas para exames toxicolgicos: Sangue, fgado e contedo gstricos;

- Anlises histolgicas foram realizadas;


- Suspeita de suicdio por malation.

GC Estudo de caso
O caso:
- Vivia com o marido e dois filhos (14 e 16 anos) no stio; - Outubro de 1994 desenvolveu um grave distrbio afetivo com caractersticas paranicas; - Foi tratada com antidepressivos e antipsicticos; - Dezembro de 1994 tentou suicdio por overdose de remdios;

- Um ano mais tarde (1995) seu medicamento foi suspenso;


- Infelizmente, relatou o retorno da depresso 5 meses antes da sua morte; - Encontrou em contato por telefone com o seu mdico, mas no aparecer para pegar o receiturio de medicamentos.

GC Estudo de caso
A anlise:
- Foram feitas as extraes das amostras;
- Posterior anlise utilizando GC-MS:
GC-MS Fisons 8000 cromatgrafo a gs acoplado a um espectrmetro de massa quadrupolo Fisons MD800, EI. Injetado 1 mcL de amostra, temperatura inicial de 120C com rampa de 15C/min at a temperatura final de 300C.

- Calibrao com padres internos de malation curva de calibrao anlise quantitativa;

Malation eludo a 6,69 min.


Pesquisa no banco de dados (60 000 espectros): 97% de probabilidade de ser malation

Malation puro

GC Estudo de caso
Discusso:

-A alta concentrao de malation intacto nos contedos gstricos consistente com outros casos reportados de indivduos que cometeram suicdio por ingesto de grande quantidade de malation; -A falecida tambm cortou os pulsos, alm de ingerir malation.

Aplicaes Forenses da GC e GC/MS

Estudo de Caso
(Case Report)

GC-MS Aplicaes Forenses

GC-MS Aplicaes Forenses


Objetivo Separao e determinao de 5 derivados de anfetamina presentes em amostras de sangue por GC-EI-MS; Amostragem: amostra de sangue de casos post mortem

Concentrao 2ug/g

Concentrao 0,002ug/g

GC-MS Aplicaes Forenses

GC-MS Aplicaes Forenses

O enantimero R cerca de 2 vezes mais ativo que o S

Estudo de Caso II
(Case Report)

Case report

A fatally mistaken fruit juice drink: An unordinary way of cocaine intoxication


R. Garca-Repetto PhD, Tcnico Facultativo Servicio Qumica INTCF, M.P. Gimnez PhD, Jefe Servicio Qumica INTCF, M.C. Martinez PhD, Tcnico Facultativo Servicio Histologa INTCF,M.L. Soria PhD, Directora Departamento Sevilla INTCF * National Institute of Toxicology and Forensic Sciences, Department of Seville, Avda. Dr. Fedriani s/n 41015 Seville, Spain

Journal of Forensic and Legal Medicine 17 (2010) 434-436

GC Estudo de caso
Introduo:
- Consumo de cocana vem aumentando cada vez mais na Espanha e na Europa; - Espanha: Lugar estratgico de entrada do trfico de drogas na Europa; - Usurios: inalao ou injeo intravenosa; - No consumida oralmente (exceo dos Body packers); - Caso curioso de intoxicao de cocana erroneamente consumida.

GC Estudo de caso
O caso:
- Um homem de 40 anos; - Tomou conhecimento, por amigos, de uma fruta tropical chamada noni, que aumenta a energia e o bem-estar;

- Morinda citrifolia, presente em vrios pases, inclusive no Brasil; - Propriedades medicinais: atividades antibitica, antiinflamatria, analgsica, e, at mesmo, inibidora do cncer (mecanismo de ao desconhecido); - Geralmente em forma de suco, permitida pela Unio Europia.

GC Estudo de caso
O caso:
- Encomendou pela internet o suco de noni, atravs de uma distribuidora do Mxico foram trs garrafas; - Quando chegou, ele e sua parceira abriram uma das garrafas e ele bebeu o tal suco;

GC Estudo de caso
O caso:
- Logo depois de beber, de repente ele sentiu-se mal caindo no cho; - A parceira disse que ela quebrou a garrafa; ela ainda tinha em suas mos quando o perito chegou;

- Os sintomas: vmitos, convulses, perda do equilbrio, ataxia, diplopia e xerostomia;


- Ela chamou os paramdicos; - Ele teve uma parada cardiorrespiratria apenas 30 minutos depois de ter bebido o suco;

GC Estudo de caso
O caso:

E o que aconteceu?????

GC Estudo de caso
O caso:
- Familiares e a parceira relataram ao perito que foi chamado ao local que o falecido no usava drogas; - Duas garrafas da cena do crime foram enviadas para o laboratrio de anlise dos autores do artigo;

- Foram numeradas:
Garrafa 1: tinha um lquido verde-escuro; Garrafa 2: observou-se a presena de um slido branco suspenso em lquido claro. - Tambm foram retiradas amostras de sangue femoral, urina e humor vtreo do falecido, para o mesmo laboratrio.

GC Estudo de caso
A anlise:
- Amostras de sangue e urina foram devidamente armazenadas e utilizou-se padres analticos;
- Anlise de etanol no sangue foi feita por GC FID, procedimento realizados segundo normas espanholas; - Preparo das amostras de sangue e urina imunoenzimticos e desproteinizao com acetona;

- Testes preliminares com GC NPD: Varian CP-3800 de gs;


Coluna: slica fundida-Ultra-1coluna revestido com metil-siloxano. Gs transportador foi o hlio a uma taxa de 1,7 mL / min. Injetor e temperaturas do detector foram 280C e 300C respectivamente. Temperatura do forno inicial foi de 60C, mantida durante 2 min, aumentando em 12C / min at 290C, permanecendo a esta temperatura durante 10 min. Volume de injeo foi de 1 mL.

GC Estudo de caso
A anlise:
- Confirmao e quantificao da cocana e dos seus metablitos (etilbenzoilecgonina, benzoilecgonina e metilecgonina) por GC MS;
Resduos secos foram aquecidos20 min a 70C com 50 mL de eagente de derivao BSTFA (N, O-bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida). Modelo cromatgrafo gasoso 5890 II acoplado com um detector HP 5973 MS com impacto de eltrons (EI), sob monitoramento SIM. A coluna utilizada era uma slica fundida coluna capilar de Ultra-1-revestidas com metil-siloxano. Portador de gs era de hlio a uma taxa de 1,7 mL / min. Temperatura do injetor foi 280C. A fonte do MS e as temperaturas do MS foram 230C e 250C, respectivamente. Temperatura do forno inicial foi de 60 C, sustentado por 3 min, aumentando em 12C / min a 290C, permanecendo nesta temperatura durante 10 min. Volume de injeo foi de 1 mL.

GC Estudo de caso
A anlise:

Cocana

Benzoilecgonina: metablito primrio da cocana

Cocaetileno

Metilecgonina

GC Estudo de caso
Resultados toxicolgicos:

It is the rst time, to our knowledge, that cocaethylene formation in vitro by a non-enzymatic pathway is reported.

GC Estudo de caso
Resultados toxicolgicos:

No ethanol was detected in blood. Cocaine, methylecgonine and benzoylecgonine were detected in blood, urine and vitreous humour, as it is shown in Table 2. No other toxic compounds were detected.

GC Estudo de caso
Resultados:
- Realizada autpsia e exames histolgicos corao, coronrias, fgado, pulmo, crebro, bao e rim; - Os achados histolgicos no fgado e corao foram de necrose aguda de etiologia txica.

GC Estudo de caso
Discusso:
- Caso fatal de overdose acidental de cocana; - A concentrao de cocana no sangue encontrada foi de 2,27 mg/L; - A ingesto de cocana no pode ser realmente confirmada, pois a garrafa foi quebrada e amostras do contedo gstrico no foram enviadas para o laboratrio;

- A relevncia dos resultados foi obtida atravs da comparao com trabalhos na literatura.

GC Estudo de caso
Discusso:
- Portanto, neste caso a morte foi atribuda a uma intoxicao aguda de cocana devido sua elevada concentrao no sangue e levando em conta os fatos de que o falecido no era um consumidor regular de cocana, e que outras substncias toxicologicamente relevantes no foram detectados nos biofludos analisados. A morte ocorreu de repente, logo aps beber suco noni e os achados histolgicos de focos necrticos no fgado e corao so concordantes de uma leso aguda txica.

GC Estudo de caso
Concluso:
- Importncia dos exames toxicolgicos em mortes sbitas; - O perigo da compra de remdios e alimentos pela internet oportunidade para organizaes do trfico de drogas; A concluso de que a cocana foi mesmo a causa da morte pode ser considerada apenas porque havia uma compreenso razovel das circunstncias e dos fatos relacionados morte;

Morte acidental por intoxicao por cocana;

- Finalmente, pode-se afirmar que um desvio na rede de distribuio de traficantes conduziram a consequncias fatais a uma pessoa inocente.

Dvidas

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