La cromatografa de lquidos es importante porque la mayora de los compuestos no son suficientemente voltiles para que se les pueda aplicar

la cromatografa de gases.

 La difusin en lquidos es 100 veces mas lenta que en gases. En HPLC, por lo general no es factible usar columnas tubulares abiertas, porque el dimetro de la vena lquida del disolvente es demasiado grande para que lo atraviese una molcula de soluto en poco tiempo. La cromatografa de lquidos se hace con columnas empaquetadas.

 La eficacia de una columna empaquetada aumenta al disminuir el tamao de las partculas de la fase estacionaria. El tamao tpico de las partculas en HPLC es de 3 10 m.

Las partculas pequeas originan mejor resolucin porque permiten un flujo ms uniforme a travs de la columna.
Cuanto mas pequeas son las partculas, menor es la distancia en la que debe difundirse el soluto en la fase mvil. La HPLC precisa presiones de 7-40 MPa para alcanzar caudales de 0,5-5 ml/min debido a la resistencia que ofrecen las partculas pequeas al flujo del disolvente.

El equipo HPLC se la figura 25.1 utiliza columnas de acero o de plstico se una longitud de 5-30 cm y un dimetro interior de 1-5 mm (figura 25.4), Las columnas son caras y se degradan con facilidad por el polvo, o las partculas de las muestras o del disolvente. Por eso, se protege la entrada de la columna con una columna corta, la precolumna, que contiene la misma fase estacionaria que la columna analtica. Las partculas finas y solutos que se adsorben con fuerza quedan retenidos en la precolumna, que hay que remplazar peridicamente.

Calentado una columna cromatogrfica, de ordinario, disminuye la viscosidad del disolvente reducindose as la presin requerida o permitiendo un mayor caudal. Al aumentar la temperatura se acortan los tiempos de retencin (figura 23.18), y mejorar la resolucin, porque aumenta la velocidad de difusin de los solutos. Sin embargo, aumentando la temperatura se puede degradar la fase estacionaria y reducir la vida de la columna. Si no se controla la temperatura de la columna, sta podra fluctuar con la temperatura ambiente. Usando un horno a una temperatura a pocos grados por encima de la temperatura ambiente se mejora la reproducibilidad de los tiempos de retencin, y la precisin del anlisis cuantitativo.

 Partculas microporosas esfricas de slice muy pura, que son permeables al disolvente (ms comunes).

La slice se disuelve en agua a pH superior a 8, por lo que no pude utilizarse por encima de ese pH. Algunas calidades de slice son estables hasta pH 9 10.
Para analizar por cromatografia compuestos bsicos a pH entre 8 y 12, se puede usar soportes polimricos, como el poliestireno. El enlace siloxano (Si-O-SiR) se hidroliza por debajo de pH 2, de modo que la HPLC con una fase enlazada en soporte de slice esta limitada al intervalo de pH 2-8.

La fase mvil de octadecilo (C18) es la ms usada en HPLC. Se le designa como ODS, abreviatura de octadecilsilano.

 En cromatografa de adsorcin el disolvente compite con las molculas del soluto por ocupar los sitios activos de la fase estacionaria.
Se puede describir la elucin como el proceso en el cual el soluto es arrastrado a travs de una fase estacionaria por el movimiento de una fase mvil (disolvente).

 La serie eluotrpica es la ordenacin de los disolventes de acuerdo con su capacidad relativa para desplazar solutos en un determinado adsorbente. La fuerza eluyente () es una medida de la energa de adsorcin del disolvente, supuesto el valor cero para el sistema pentano/slice pura. Cuanto ms polar es el eluyente, mayor es su fuerza eluyente respecto a la slice en cromatografa de adsorcin. Un disolvente ms polar tiene fuerza eluyente mayor.

La elucin isocrtica se lleva a cabo con un nico disolvente (o una mezcla de disolvente de composicin constante). Si un disolvente no permite una elucin suficientemente rpida de todos los componentes, se puede usar una elucin gradiente. En este caso se va aadiendo cantidades crecientes del disolvente B al disolvente A, produciendo un gradiente continuo. Cuando se usa la elucin gradiente, la composicin del disolvente cambia de manera continua o escalonada. Se usan dos o mas

disolventes que difieren significativamente en su polaridad.

Existen varios modos de separar los componentes de una mezcla dada. Tenemos dos opciones dependiendo si la masa molecular del analito sea mayor o menor que 2 000.

En HPLC se necesitan disolventes muy puros y caros, para evitar que se degraden por impurezas las columnas, y para minimizar el fondo de las seales del detector debido a los contaminantes.
Se toma el disolvente del depsito a travs de un filtro para impedir el paso de partcula micromtricas. Los disolventes se deben purgar previamente, burbujeando He a travs de ellos o aplicando vaco, para eliminar el aire disuelto. Las burbujas de aire crean dificultades en las bombas, en las columnas y en los detectores.

Las columnas modernas de HPLC debe ser capaces de dar picos estrechos y simtricos. Si una columna nueva no produce la calidad de separacin de una mezcla estndar, lo que hay que hacer es devolver la columna. El factor de asimetra A/B que aparecen el la figura 23-13 raras veces debe estar fuera del intervalo 0.9-1.5. Las colas de las aminas se eliminan aadiendo a la fase mvil trietilamina 30 mM. Esa gran concentracin de aditivo se une a los puntos activos de la slice, que de lo contrario fijaran con fuerza al analito. La formacin de colas en compuestos cidos se puede elimina acetato de amonio 30 mM.

En el caso de muestras desconocidas, resulta til aadir acetato de trietilamina 30 mM. Si persisten las colas puede ser eficaz dimetiloctilamina o acetato de dimetiloctilamonio 10 mM. Un problema que tiene los aditivos es que aumentan el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio cuando cambia el disolvente.

Por ejemplo, si un pico se eluye a 1 mL/min y tiene una anchura de 0.2 min, el volumen del pico es de 0.2 mL El volumen de inyeccin no debe superar el 15% de 0.2 mL es decir a 30L. El volumen que hay en un equipo cromatogrfico, sin contar el de la columna, desde el punto de inyeccin al punto de deteccin, se llama volumen muerto. Volmenes muertos excesivamente grandes hacen que los picos se ensanchen por difusin o por mezcla. Hay que usar tubos de conexin cortos y estrechos, en cuanto sea posible , y asegurarse que las conexiones estn bien ajustadas, a fin de minimizar el volumen muerto y de ese modo minimizar la dispersin fuera de la columna.

 Bombas y vlvulas de inyeccin. Detectores espectrofotomtricos.

Detector ultravioleta
Detector de ndice de refraccin Detector de dispersin de luz previa evaporacin.

Detector electroqumico.

 La calidad de una bomba HPLC se mide atendiendo a si produce un flujo constante y reproducible. Tenga una salida libre de pulsos. Resistencia a la corrosin por diversos disolventes, capacidad para generar presiones de hasta 600 psi y velocidades de flujo de 0,1-10 mL/min.

Un caudal fluctuante da origen a ruido en el detector, que no deja ver bien las seales dbiles.

Figura 25.15 Bomba con dos pistones de zafiro, que produce un caudal programable constante, de 10 mL/min, a presiones hasta de 40 MPa. Se forman gradientes hasta con cuatro disolventes, ajustando los volmenes de los lquidos a travs de una vlvula de cuatro vas de baja presin, e impulsando la mezcla con la bomba a alta presin. El disolvente que esta a la izquierda se introduce a travs de una vlvula electrnica de entrada, sincronizada con el movimiento de un pistn grande, y diseada para evitar que se formen burbujas de vapor de disolvente durante la embolada de entrada. La vlvula de salida provista de un muelle, mantiene constante la presin de salida, y un amortiguador reduce las oleadas de presin. Las oleadas de presin originadas en el primer pistn disminuyen en el amortiguador, que funciona contra una presin constante de salida. Mientras el pistn grande aspira liquido, el pistn pequeo lo introduce en la columna. El caudal esta controlado por los volmenes de las emboladas.

La vlvula de inyeccin, que se ve en la figura 25-16, permite bucles intercambiables de carga de muestra, cada una de un volumen fijo, que van desde 2 a 1000 mL. Se utiliza una jeringa en la posicin de carga, para lavar y llenar el bucle con nueva muestra a la presin atmosfrica. El lquido que procede de la bomba a alta presin pasa por el segmento de vlvula situado en la parte inferior izquierda. Cuando la vlvula gira 60 en sentido contrario a las agujas del reloj, el contenido del bucle de muestra es inyectado a alta presin en la columna .

 Un detector ideal, de cualquier tipo que sea, debe ser sensible a pequeas concentraciones, dar una respuesta lineal y no ensanchar los picos del cromatograma. No debe ser sensible a variaciones de temperatura y de la composicin del disolvente. Para evitar que se ensanchen los picos, el volumen del detector debe ser menor que el 20% del volumen de la banda cromatogrfica. Las burbujas como las partculas interfieren en el rendimiento de muchos detectores Los gases disueltos producen burbujas en la columna y pueden causar ensanchamiento de la banda.

 El detector ultravioleta ms sencillo utiliza la emisin intensa a 254 nm de una lmpara de mercurio y la deteccin a una sola longitud de onda. En instrumentos ms verstiles se utiliza una lmpara de deuterio y un monocromador para mediciones a longitud de onda variable. Cuando los picos estn suficientemente separados, se puede elegir una longitud de onda para cada pico. Los detectores espectrofotomtricos ms potentes son los que utilizan una fila de fotodiodos para registrar el espectro completo de cada soluto que pasa por el detector. En los detectores de la fila de fotodiodos toda la radiacin procedente de la fuente (lmpara de Deuterio) se hace pasar a travs de la muestra, en lugar de seleccionar previamente una radiacin determinada con un monocromador como en espectrofotometra convencional.

Un detector de ndice de refraccin responde a casi cualquier soluto, pero su lmite de deteccin es aproximadamente 1 000 veces peor que el de un detector de ultravioleta. DESVENTAJAS: Los detectores de ndice de refraccin no sirven en elucin en gradiente, porque es imposible ajustar exactamente la muestra y la referencia mientras vara la composicin del disolvente. Los detectores de ndice de refraccin son sensibles a las variaciones de presin y temperatura. Los detectores de ndice de refraccin no sirven en anlisis de trazas. VENTAJAS: Este detector responde a todos los solutos, incluso aquellos que absorben poco en el ultravioleta.

 Responde a casi todos los solutos que son claramente menos voltiles que la fase mvil.
Responde a la masa del analito, no a su estructura o masa molecular.

Si se observa un pico pequeo y uno grande, se puede estar seguro que el que el pico pequeo corresponde a menos cantidad que la del pico grande.
La respuesta de un detector de dispersin de luz no es lineal. Es compatible con una elucin en gradiente. Si se usa un tampn en el eluyente, debe ser voltil, o de lo contrario se evaporara formando partculas slidas, que dispersaran la luz y no dejaran discernir la seal del analito.

El eluato entra por la parte superior. En el nebulizador, el eluato se mezcla con nitrgeno, y se le fuerza a pasar por un capilar, a cuya salida forma una fina dispersin de gotitas. El nebulizado se fuerza a pasar a travs de un tubo caliente, donde se evapora el disolvente, dejando una nube fina de partculas slidas, que entran en la zona de deteccin situada en el fondo del tubo. Las partculas se detectan por la luz que procede de un diodo laser y que llega al fotodiodo por dispersin.

 Responde a analitos que pueden oxidarse o reducirse, como fenoles, aminas aromticas, perxidos, etc.

Para solutos oxidables, son comunes los electrodos de cobre o de carbn vitrificado.
Para solutos reducibles, un buen electrodo de trabajo puede ser el de gotas de mercurio. El detector es muy sensible a las variaciones de caudal y de temperatura.

 Al desarrollar un mtodo, lo que se busca o se pretende conseguir es una separacin adecuada en un tiempo razonable

Si la columna no dispone de un control de temperatura, se puede al menos aislar para evitar las fluctuaciones de temperatura
La cromatografa de fase inversa es normalmente adecuada para separar mezclas de compuestos orgnicos neutros o cargados de baja masa molecular

Combinado adecuadamente acetonitrilo, metanol y tetrahidrofurano con agua (o un tampn acuoso), se dispone de una gama suficiente de interacciones dipolares, por puentes de hidrgeno, para separar un gran nmero de compuestos por cromatografa de fase inversa. La primera mezcla de disolventes que se puede ensayar es acetonitrilo y agua. El acetonitrilo tiene una viscosidad baja que permite una presin de trabajo relativamente baja y, adems, la deteccin en el ultravioleta hasta 190 nm (tabla 25.2). El metanol es el segundo disolvente orgnico a elegir, porque tiene mayor viscosidad, y una longitud de onda de corte mayor. El tetrahidrofurano es el tercer disolvente que se elegira, porque es menos til en el ultravioleta, se degrada lentamente por oxidacin, y se equilibra ms lentamente con la fase estacionaria. Las condiciones generales iniciales en cromatografa HPLC de fase inversa aparecen en la tabla 25.4.

Las Figuras 25.23 y 25.24 ilustran un proceso para disear una separacin con una combinacin de disolventes. La elaboracin del mtodo se termina cuando la separacin cumple los criterios de seleccin. Es posible conseguir una separacin adecuada sin necesidad de seguir todos los pasos.

Paso 1. Optimizar la separacin con acetonitrilo/tampn, con el resultado del cromatograma A de la figura 25.24.
Paso 2. Optimizar la separacin con metanol/tampn, con el resultado del cromatograma B. Paso 3. Optimizar la separacin con tetrahidrofurano/tampn, con el resultado del cromatograma C. Paso 4. Mezclar los disolventes usados en A, B y C, de dos en dos cada vez, en proporcin 1:1, con el resultado de los cromatogramas D, E y F. Paso 5. Construir una mezcla 1:1:1 con los disolventes con los que se obtuvieron A, B y C, con el resultado del cromatograma G.

Paso 6. Si algunos de los resultados de A a G son bastante buenos, seleccionar los dos mejores, y mezclar los disolventes para obtener combinaciones intermedias entre las de esos dos.

Examinemos la figura 25.24 para ver cmo se aplica el procedimiento sistemtico. El paso 1 genera el cromatograma A, variando las proporciones de acetonitrilo y tampn acuoso (como en la figura 25.10), para obtener la mejor separacin con la restriccin que 0,5 k 20. Con la composicin ptima de 30% y de acetonitrilo/70% y de tampn, no se resuelven adecuadamente los picos 4 y 5, en vistas a un anlisis cuantitativo. En HPLC, al disminuir el caudal generalmente se mejora la resolucin. Para la figura 25.24 se eligi un caudal de 1,0 mL/min, que es mejor que el de 2,0 mL/min recomendado en la tabla 25.4. Con un caudal menor, se decidi mantener k' < 10 (en lugar de <20), para que la duracin del cromatograma continuase por debajo de ~25 min. En el cromatograma A, k' = 1,1 para el pico 1, y k' = 8,1 para el pico 7. Si el caudal hubiese sido 2,0 mL/min, k' hubiese sido <20, y el cromatograma hubiese durado ~25 min.

El paso 2 busca la mezcla metanol/tampn que da la mejor separacin, resultando ser la del cromatograma B. No es necesario empezar de nuevo con un 90% de metanol. La figura 25.25 nos permite seleccionar una mezcla de metanol/agua. que tiene aproximadamente la misma fuerza eluyente que una mezcla dada de acetonitrilo/agua. Una lnea vertical trazada a una composicin de acetonitrilo del 30% (la composicin usada en el cromatograma A) corta a la lnea del metanol, aproximadamente, en un 40%. Por tanto un 40% de metanol tiene la misma fuerza eluyente que un 30% de acetonitrilo. El primer ensayo hecho para fijar el punto B en la figura 25.24 utiliz un 40% de metanol. Mediante un pequeo tanteo (con un 45% y un 35% de metanol) se demostr que un 40% de metano] daba la mejor separacin, aunque la separacin todava es pobre. En el cromatograma B de la figura 25.24, los siete componentes dan slo cinco picos. Cuando cambiamos de acetonitrilo a metanol, vara el orden de elucin de algunos compuestos.

El paso 3 genera el cromatograma C de la figura 25.24, usando tetrahidrofurano. La figura 25.25 nos dice que un 22% de tetrahidrofurano tiene la misma fuerza eluyente que un 30% de acetonitrilo. Cuando se ensaya un 22% de tetrahidrofurano, los tiempos de elucin fueron demasiado largos. Mediante tanteo se vio que un 32% de tetrahidrofurano era la mejor opcin. Los siete compuestos se separan bien en el cromatograma C en un tiempo aceptable. Sin embargo, existe un pico negativo asociado con el frente del disolvente, entre los picos 3 y 1, que interfiere en el anlisis cuantitativo del compuesto 1. Se puede advertir que el orden de elucin con tetrahidrofurano es muy diferente del de acetonitrilo. En general, variar el disolvente es una manera muy eficaz de cambiar la retencin relativa de distintos compuestos.

El paso 4 genera los cromatogramas D, E y F. La composicin de D es una mezcla 1:1 de los disolventes usados en A y B. Dado que se us un 30% de acetonitrilo en A y un 40% de metanol en B, entonces D deba tener un 15% de acetonitrilo/20% de metano1/65% de tampn Anlogamente, E se obtuvo mediante una mezcla 1:1 de los disolventes utilizados en A y C. El cromatograma F se obtuvo con una mezcla 1:1 de los disolventes correspondientes a los cromatogramas B y C. El cromatograma D no es aceptable, porque se solapan los picos 4 y 5. El cromato-grama E es totalmente rechazable, porque los picos 1 y 3 se solapan, lo mismo que los 4, 5 y 6. Pero el cromatograma F es el que se estaba buscando. Todos los picos se separan, y el primer pico (3) se aparta adecuadamente del pico negativo que origina el disolvente. La composicin del disolvente en el punto F (20% de metano1/16% de tetrahidrofurano/64% de tampn) cumple con lo que pretendamos. Los picos 4 y 6 tienen una resolucin mnima de 1.8. (Es verdad que se hubiera preferido una resolucin mayor que 2,0.) Todos los picos son simtricos, y tienen un k' dentro del intervalo 0,9 7,5. La presin de trabajo se mantuvo dentro de un valor razonable para el sistema.

Si ninguno de los ensayos hubiese dado un buen resultado, el paso 5 hubiera generado el cromatograma G, de la figura 25.24 usando una mezcla 1:1:1 de los disolventes usados en A, B y C. A ttulo informativo, se muestra el resultado que se hubiese obtenido en el cromatograma G. Los picos 1 y 3 se solapan, lo mismo que los picos 4 y 7. Si algunas de las composiciones AG fuesen casi satisfactoria, podra ser mejor alguna composicin intermedia. Por ejemplo, si A y D fuesen suficientemente buenas, es posible que una mezcla de A y D fuera mejor.

La variable de la temperatura de la columna puede afectar a la retencin relativa de los diferentes compuestos de una mezcla. La temperatura influye especialmente en compuestos inicos (como en cationes amonio y aniones carboxilato), y en molculas con mltiples sustituyentes polares. La figura 25.26 sugiere un procedimiento sistemtico para desarrollar un mtodo, considerando la composicin del disolvente y la temperatura como las dos variables independientes. Si se trabaja a temperatura elevada, el pH debe ser inferior a 6, para retrasar la disolucin de la fase estacionaria de slice.

La elaboracin de un mtodos se simplifica enormemente mediante simulaciones por ordenador, usando programas comerciales.. Con un ordenador se puede hallar las condiciones ptimas en unos minutos, en lugar de das de trabajo en el laboratorio. Sin duda alguna, se debe verificar la prediccin con una experiencia real. Los programas comerciales pueden ahorrar mucho dinero cuando se prepara un mtodo en laboratorios industriales.

La manera ms rpida de analizar una mezcla nueva, con objeto de decidir si se usa una elucin isocrtica o en gradiente, es aplicar un gradiente aproximado. El tiempo gradiente, tG' es el tiempo a lo largo del cual vara la composicin del disolvente (40 min). Sea t la diferencia de tiempos de retencin de los picos primero y ltimo del cromatograma. El criterio sobre si se debe o no utilizar un gradiente es: Usar gradiente si Usar elucin isocrtica si t/tG > 0,25 tltG < 0,25 El gradiente de elucin se recomienda generalmente para: Muestras que tengan tiempos de retencin semejantes. Muestras de peso molecular mayor a 1000. Muestras de origen biolgico.