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en hematologa ya que muchas hematopatas se diagnostican con solo observar las caractersticas morfolgicas de las clulas circundantes. Por ello la calidad de la extensin debe ser impecable
Es recomendable realizarla en la misma cabecera del enfermo y de ser posible con sangre sin anticoagulante. Esto obedece a que tanto el tiempo como la naturaleza del anticoagulante ejercen un efecto directo sobre la morfologa celular induciendo la aparicin de artefactos(polimorfo neutrfilos y monocitos) o alterando la distribucin de las clulas (sobre todo las plaquetas)
inmediatamente con aire seco a temperatura no mayor de 40C. Previa constatacin del volumen adecuada de muestra y de la ausencia de micro cogulos, contaminacin o crio aglutinacin(en este ultimo caso se aconseja calentar la muestra a 37C y diluir para el recuento, con solucin fisiologica,en iguales condiciones).
apreciar la morfologa eritrocitaria y muy importante para efectuar el recuento diferencial de leucocitos. Para realizar una buena extensin de sangre pueden emplearse procedimientos manuales o mecanizados (automatizados).
REALIZACION MANUAL
PRECAUCIONES O RECOMENDACIONES A SEGUIR: Todo el material a emplear (portaobjetos o cubreobjetos) han de estar escrupulosamente limpios y desengrasados. Si se parte de una puncin digital, debe desecharse siempre la primera gota Si se parte de una puncin venosa debe hacerse con la mxima rapidez, y de ser posible, antes de mezclar la sangre con el anticoagulante
de practicarse dentro de las 2 horas de practicada la extraccin y empleando EDTA-K2 EN PROPORCION DE 1.5 -2.2 mg /ml de sangre.
(EDTA),que han permanecido no mas de 1 hora a temperatura ambiente, presentan pocos cambios en comparacin con los extendidos preparados inmediatamente despus de extraer la muestra. A las 3 horas los cambios empiezan a observarse .
Cambios observables
Los glbulos blancos presentan vacuolas y cambios nucleares
degenerativos . La morfologa de los glbulos rojos no se ve muy afectada si la sangre permanece hasta 6 horas a temperatura ambiente, pero luego de este lapso comienza la crenacion . Todo estos cambios se producen con mayor rapidez si la temperatura ambiente es mas alta .
consiste en extender una gota de sangre sobre un portaobjetos de iguales dimensiones. Se recomienda seguir los siguientes pasos: Colocar una pequea gota de sangre no mas de 3 mm.de dimetro sobre la superficie de un portaobjetos a 2 cm aproximadamente de uno de sus extremos.
parte anterior a la gota de sangre sobre la superficie del primer portaobjetos ,formando un ngulo de aproximadamente de 45 desplazarlo suavemente hacia atrs hasta que alcance la gota de sangre.
manera uniforme .Es aconsejable que la sangre no llegue a los lados del portaobjetos sobre el que se realizara la extensin. Deslizar suavemente y a velocidad moderada un portaobjetos sobre el otro en sentido longitudinal, hasta que la gota de sangre quede bien extendida sobre la superficie del primer portaobjetos.
ngulo que formen entre si ambos .As, si es superior a 45, la extensin obtenida ser gruesa y corta: por el contrario, si es inferior a 45, ser larga y fina. Secado de la extensin a temperatura ambiente y en posicin vertical.
UNA BUENA EXTENSION REALIZADA PRESENTARA 3 AREAS DE DIFERENTE GROSOR Y CON UNA DISTRIBUCION TAMBIEN DISTINTA DE LEUCOCITOS: ZONA EXCESIVAMENTE GRUESA. Se halla en la regin inmediata al punto de partida de la extensin (cabeza).En ella se aprecia siempre un aumento del numero de linfocitos.
extensin y termina con un rea donde las clulas adoptan una disposicin acordonada (barbas).En esta regin se observa un exceso de granulocitos y monocitos. ZONA IDEAL. Corresponde a la regin situada entre las dos anteriores (zona intermedia) y en ella existe un reparto equilibrado de las clulas.
leucocitos ,este procedimiento tiene el inconveniente de que produce en ellos cierto traumatismo.
cubreobjetos Colocar un segundo cubreobjetos sobre la gota de sangre de forma cruzada de modo que ambos cubreobjetos formen una imagen de una estrella de 8 puntas. Esperar a que por capilaridad la sangre se halla distribuido de manera uniforme entre ambas superficies
REALIZACION MECANICA.
Consiste en la realizacin de una extensin sangunea sobre el portaobjetos mediante sistemas mecnicos que eliminan la variabilidad tcnica propia del mtodo manual. han desaparecido ,sustituidos por equipos de anlisis computarizados. Permiten estandarizar el mtodo Facilitan la distribucin homognea de las clulas sanguneas sobre el portaobjetos.
AUTOANALIZADORES HEMATOLOGICOS
Un sistema que automticamente se desplaza un cristal esmerilado sobre la superficie del portaobjetos. Se adapta a cada espcimen de forma individualizada, de manera que el grosor se ajusta automticamente segn el valor del hematocrito proporcionado por el mismo autoanalizador
redcellreyes
lo antes posible (nunca mas de 24 horas)a un proceso de fijacin para poder ser teida mediante el colorante de eleccin . los mtodos empleados para teir las clulas se basan en el mtodo de Romanoswsky constituido fundamentalmente por la mezcla de eosina y azul de metileno.
El mtodo de Romanowsky en hematologa requiere dos premisas fundamentales: La fijacin de la sangre extendida sobre el portaobjetos antes de la aplicacin del colorante El empleo junto a la eosina y el azul de metileno de derivados por oxidacin del azul de metileno, que se conocen con el nombre de azures (azur A, azur B y azur C) . Estas sustancias son las responsables de la coloracin purpura de la cromatina leucocitaria y de ciertas granulaciones citoplasmticas, que por ello se denominan azurofilas
ASPECTOS MORFOLOGICOS DE LAS CELULAS Forma ,dimensiones y contorno de las clulas Ncleo celular y restos de cromatina(color purpura) Citoplasma de los linfocitos (color azul) Citoplasma de los monocitos (color grisceo) Granulaciones de los polimorfonucleares: Eosinofilos:color naranja Basofilos: azul oscuro Neutrofilos: color pardo Eritrocitos :color rosa plido Reticulocitos:color azulado
PRINCIPIO
Tanto la eosina como el azul de metileno son muy sensibles a las variaciones de ph de las diferentes estructuras celulares, de forma que las que tien carcter bsico fijan en mayor medida la eosina(colorante acido) ,mientras que las que poseen propiedades acidas fijan principalmente el azul de metileno(colorante bsico).
en el ncleo(nucleolo) o en el citoplasma (ribosomas) se colorean de azul, mientras que otros componentes acidofilos como la hemoglobina adquieren un color rosado. De igual modo, la diferente afinidad de ciertas granulaciones citoplasmticas por dichos colorantes permite clasificar los leucocitos polimorfonucleares en tres grupos:
posee compuestos neutros que fijan ambos colorantes simultaneamente.El color resultante es pardo y las granulaciones se denominan neutrofilas. GRANULOCITOS EOSINOFILOS, en los que la granulacin especifica contiene sustancias de intenso carcter bsico(espermina y derivados),que fijan fundamentalmente los colorantes cidos(compuestos acidofilos). El color resultante es rojo-naranja.
sustancias de fuerte carcter acido( heparina) ,que fijan los colorantes basicos como el azul de metileno(compuestos basofilos) .El color resultante es azul oscuro.
El azur B tie de color purpura la granulacion primaria de los neutrofilos, la fina granulacion de los monocitos y la que puede observarse en ciertos linfocitos de gran tamao y abundante citoplasma(linfocitos grandes granulados).
eritrocitarias derivadas de la cariorrexis( punteado azurofilo o polvillo nuclear) o los hemoparasitos. Entre los mtodos de tincin basados en el empleo de colorantes tipo Romanowsky, los mas utilizados son el Giemsa,May-Grunwald-Giemsa y el de Wright.
CAUSAS
TINCION PROLONGADA LAVADO INADECUADO ALCALINIDAD DEMASIADO ALTA DEL COLORANTE O DEL AMORTIGUADOR O AMBOS FROTIS DE SANGRE GRUESO TINCION INSUFICIENTE LAVADO PROLONGADO ACIDEZ DEMASIADO ALTA DEL COLORANTE O DEL AMORTIGUADOR O AMBOS PORTAOBJETOS SUCIOS DESECACION DURANTE EL PROCESO DE TINCION FILTRADO INADECUADO DEL COLORANTE
TINCIONES CITOQUIMICAS
La citoquimica estudia la clula y permite realizar la localizacin
topogrfica de diversas sustancias, considerndose como un la unin entre la morfologa y la bioqumica, al conjugar forma y funcin. Las sustancias a reconocer en la clula son: glucogeno,(reaccin de PAS),grasas neutras ( Sudn black),enzimas tales como mieloperoxidas,hidrolasas alcalinas(fosfatas alcalina) y otras
PEROXIDASA(MIELOPEROXIDASA)
LA MIELOPEROXIDASA ES UNA ENZIMA CON LA CAPACIDAD DE
CATALIZAR LA OXIDACION DE SUSTANCIAS MEDIANTE PEROXIDO DE HIDROGENO. LOS SITIOS DE ACTIVIDAD DE LA MIELOPEROXIDASA SE IDENTIFICAN POR UN PRODUCTO DE REACCION INSOLUBLE DE COLOR NEGRO PARDO. ESTA ENZIMA ESTA PRESENTE EN NEUTROFILOS Y SUS PRECURSORES, EOSINOFILOS Y MONOCITOS . LOS LINFOCITOS NO EXHIBEN ACTIVIDAD DE MIELOPEROXIDASA . ES UTIL EN LA DIFERENCIACION ENTRE LAS LEUCEMIAS MIELOBLASTICAS AGUDAS Y LEUCEMIAS LINFOBLASTICAS AGUDAS.
SUDAN NEGRO B
ES UN COLORANTE DIAZO QUE TIE FOSFOLIPIDOS ,GRASAS NEUTRAS Y
ESTEROLES . LOS COMPONENTES CELULARES QUE CONTIENEN LIPIDOS SE TIEN DE COLOR NEGRO PARDO CON EL COLORANTE TIE LOS GRANULOS PRIMARIOS Y SECUNDARIOS DE LA LINEA CELULAR GRANULOCITICA . LOS NEUTROFILOS,LOS PRECURSORES DE LOS NEUTROFILOS Y LOS EOSINOFILOS MUESTRAN GRANULACION INTRACELULAR DE COLOR NEGRO LOS MONOCITOS SE TIEN CON MENOS INTENSIDAD LOS LINFOCITOS NO SE TIEN ES UTIL EN LA DIFERENCIACION ENTRE LEUCEMIAS MIELOBLASTICAS AGUDAS Y LEUCEMIAS LINFOBLASTICAS AGUDAS
ESPECIFICA PARA LA LINEA DE CELULAS GRANULOCITICAS . LOS SITIOS DE ACTIVIDAD DE LA ENZIMA MUESTRAN GRANULACION ROJO BRILLANTE . LA ACTIVIDAD ENZIMATICA ES DEBIL O ESTA AUSENTE EN LOS MONOCITOS Y LOS LINFOCITOS ES UTIL PARA LA DIFERENCIACION ENTRE LAS LEUCEMIAS MIELOBLASTICAS AGUDAS Y LEUCEMIAS LINFOBLASTICAS GUDAS.
MUCOPOLISACARIDOS Y GLUC OPROTEINAS POSEEN LOS GRUPOS 1,2 GLICOL Y SE TIEN . LA TINCION ACIDO PERYODICO DE SCHIFF(PAS)SE VE EN CASI TODAS LAS CELULAS HEMATOPOYETICAS NORMALES . EN LA LINEA CELULAR GRANULOCITICA ,LA INTENSIDAD DE LA TINCION AUMENTA CON LA MADUREZ. LOS MONOCITOS EXHIBEN UN PATRON DIFUSO ,LOS LINFOCITOS PUEDEN SER NEGATIVOS O MOSTRAR UNOS CUANTOS GRANULOS POSITIVOS A PAS . LOS MEGACARIOCITOS Y LAS PLAQUETAS SE TIEN DE MANERA INTENSA LOS ERITROBLASTOS NORMALES NO SE TIEN .
(RESERVA DE HIERRO ) EN LA MEDULA OSEA Y DE HIERRO TINGIBLE EN LOS ERITROBLASTOS (SIDEROBLASTOS) O ERITROCITOS (SIDEROCITOS). El HIERRO LIBERADO SE PRESENTA COMO UN MATERIAL DIFUSO DE COLOR AZUL VERDE Y LOS NUCLEOS DE COLOR ROJO. ES UTIL EN LA CLASIFICACION DE LAS ANEMIAS VINCULADAS CON LA SINTESIS DEFECTUOSA DE LA HEMOGLOBINA . LA PRESENCIA DE CUERPOS DE PAPPENHEIMER PUEDEN CONFIRMARSE CON EL AZUL DE PRUSIA .
OTRAS TINCIONES
TINCIONES SUPRAVITALES
NO EVALUA MORFOLOGIA EN EL RECUENTO RETICULOCITARIO SE RECONOCE LA RED DE RETICULINA. AZUL DE METILENO BRILLANTE DE CRESILO