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Apport des donnes de suivi des croissances bactriennes issues des automates dhmoculture, au diagnostic microbiologique

Florence Loiseau Laurence Mayaud

Gnralits sur lhmoculture

Examens bactriologiques importants quant aux consquences cliniques et thrapeutiques


Septicmie : maladie associe la bactrimie Endocardites ou infections graves (pneumonies, mningites)

Les mthodes ont volu


Manuelles avec lecture visuelle et milieux non standardiss Dveloppement de milieux de composition dfinie et supplments pour dtection de croissance de bactries difficiles Mise au point dautomates dhmocultures.

Premires cultures quantitatives (1) Diagnostic des infections septiques


Point de dpart : matriel / autres

Proposes par Maki et al. en 1977 dans les infections sur cathters veineux centraux
Retrait du cathter Rouler le cathter sur la surface externe dune bote de glose au sang en saidant dune pince strile Incubation 48h 37C Colonisation du matriel si > 15 colonies Spcificit faible 20 50% Seule la partie externe du cathter est tudie

Les premires cultures quantitatives (2) Diagnostic des infections septiques


Point de dpart : matriel /autres

Brun Buisson C et al. en 1987


Chambre implantable et cathters : Retrait du matriel On rince en injectant 1 ml d'eau distille strile On en ensemence 10l sur une glose au sang frais Le seuil de positivit est de 103 UFC/ ml. Incuber 48 heures 37. Mthode simple, spcificit 88% Cette mthode sintresse la face externe et la lumire du cathter

Les premires cultures quantitatives (3) Diagnostic des infections septiques


Point de dpart : matriel / autres

Inconvnients : Ces techniques utilisaient le retrait du cathter


retrait viter chez les patients neutropniques fbriles ou chez des enfants cancreux dans 70 85% des cas suspects dinfections, les cathters taient striles et leur retrait savrait inutile.

Les premires cultures quantitatives (4)

Dterminer lorigine infectieuse dune hmoculture positive en gardant le matriel en place


Utilisation du milieu Isolator
Prlever 2 hmocultures (cathter et au niveau priphrique ) Ensemencer les culots de centrifugation sur glose sang, incuber 72 heures sous atmosphre 5% de CO2. Rsultat significatif si : UFC/ml sur cath > 5 x UFC/ ml sur sang priph Plusieurs inconvnients :
Moins sensible en raison du faible volume de sang inocul A techniquer rapidement car pas de milieu de culture Cot important

Autre mthode
Prlvement de sang intra-luminal (les 10 premiers ml de sang) associ au prlvement de sang priphrique Culture quantitative des 2 prlvements

Les automates dhmoculture

Ces appareils ont bnfici damliorations rapides


Semi automatisation (Bactec NR-660) : mthode invasive (aiguilles) Automatisation complte ( Bactec 9240; Bact/Alert; Bio Argos )

Assurent la dtection automatique du CO2 produit au cours de la croissance bactrienne


Dtection en continue de la pousse bactrienne : augmentation de sensibilit et de rapidit par rapport aux mthodes traditionnelles alerte visuelle, sonore ds laugmentation significative de signal (gnralement en phase exponentielle si la croissance est rapide) lors dun signal initial fort lors du chargement

Les automates dhmoculture

Remarques :
Si, au moment du chargement, on dpasse la phase de croissance pour des espces dont laugmentation du signal est faible (dlai prlvement / chargement trop long), on peut rendre des hmocultures faussement ngatives malgr la prsence de germes Dans ces cas, risolement indispensable des flacons en fin de priode dincubation

Systme de lecture automatique et en continue


Rapidit accrue des techniques et de leurs rsultats Amlioration de la sensibilit et acclration des dlais de lecture Mais perte des donnes quantitatives

Etude des donnes des automates dhmoculture

Etude du Groupe hospitalier Cochin Saint-Vincent de Paul, Paris, France :


BUT :
Obtenir des hmocultures quantitatives bases sur le dlai de dtection de lautomate Aide au diagnostic dinfections sur matriel (cathters...)

Dans un premier temps : Montrer une relation entre le dlai de dtection et linoculum bactrien Dans un deuxime temps : Comparer les dlais en prlevant simultanment une hmoculture priphrique et une hmoculture sur le matriel

Relation entre dtection et inoculum


Dilution des souches dune espce bactrienne dans du srum physiologique pour obtenir une suspension 108 germes par millilitre. Dilutions successives de 10 en 10 pour obtenir des inoculums de 107 1 UFC / ml. 1 ml de linoculum est inject la seringue dans un flacon dhmoculture arobie. Etude faite sur diffrentes souches bactriennes

Relation linaire semi-logarithmique


Les automates dtectent plus rapidement la croissance (sonne) en fonction de la quantit de linoculum du dpart Il existe une relation linaire entre le dlai de dtection et linoculum

Pseudomonas aeruginosa C07 : souches dites "cliniques" T05; T06;T07;T08 : souches "test" (T)

Temps de dtection diffrentiel

Compte tenu de cette relation linaire, on va ensuite comparer les temps de dtection entre les hmocultures sur matriel et priphriques L'analyse comparative des dlais est ralise en prlevant simultanment une hmoculture sur une voie priphrique et sur le matriel (cathter, KT). Dans le cas dune infection septique avec pour point de dpart le matriel, le temps de dtection diffrentiel (TDD) est alors prcis TDD= t hmoculture priphrique - t hmoculture sur matriel (en heures)
(t = temps au bout duquel lautomate dtecte la croissance bactrienne)

Dtermination du temps diffrentiel de dtection Cas de bactrimie avec pour origine le cathter
Dlais moyens de dtection en heure
Nature de la bactrimie (nb dpisodes) S. aureus (2) SCN (4) Enterobacteries (3) Hmocultures sur matriel 9,5 13,7 6,2 Hmocultures priphriques 18,1 21,3 20,1

TDD t hmoc/priph - t
hmoc/matriel

8,6 7,6 13,9

P. aeruginosa (1) 6,8 16,4 9,6 1. Dlai de dtection des hmoc sur matriel < celui des hmoc priph 2. Relation linaire : donc inoculum plus lourd au niveau de lhmoculture sur matriel versus hmoc priphrique ORIGINE DE LA BACTERIEMIE EST LE MATERIEL

Rsum
Si lhmoculture du cathter sort positif avant lhmoc priph : origine de linfection est le cathter Si les hmocultures ( cathter et priphrique) sortent positives en mme temps : origine de linfection nest pas le cathter. Il faudra alors trouver une autre origine la bactrimie et dans ce cas le retrait du cathter savre inutile

Intrt de la technique

Dans le cas dune bactrimie avec pour origine le cathter : le TDD est toujours > 2 h (pour avoir une bonne spcificit et sensibilit) , quelle que soit la bactrie implique (staphylocoques, entrobactries, bacille pyocyanique). De plus, il est corrl, selon lespce, un diffrentiel dinoculum, facilement prcis. Cette technique est facilement applicable car rapide et peu onreuse

Quelques paramtres respecter

1.

Les prlvements doivent tre simultans Les hmocultures doivent tre mis dans lautomate simultanment

2.

Autres articles concernant les hmocultures quantitatives (1)

De nombreuses tudes vont dans le mme sens que ltude du Groupe hospitalier Cochin Saint-Vincent de Paul
Blot F, Nitenberg G et al.:
Diagnosis of catheter-related bacteriemia: a prospective comparison of the time to positivity of hub-blood versus peripheral-blood cultures. The Lancet 1999 Sep25;354(9184)

Quilici N, Audibert G et al.:


Differential quantitative blood cultures in the diagnosis of catheter-related sepsis in intensive care units. Clin Infect Dis.1997 Nov;25(5) : 1066-70

...

Autres articles concernant les hmocultures quantitatives (2)

Quelques tudes reconnaissent lintrt de ce protocole mais uniquement dans certains cas : par exemple septicmies chez des patients cancreux Malgrange VB, Escande MC, Theobald S.
Validity of earlier positivity of central venous blood cultures in comparison with peripheral blood cultures for diagnosing catheter-related bacteremia in cancer patients. J Clin Microbiol.2001 Aug;39(8):3022.

Rijnders BJ, Verwaest C et al.


Difference in time to positivity of hub-blood versus nonhub-blood cultures is not useful for the diagnosis of catheter-related bloodstream infection in critically ill patients. Crit Care Med. 2002 Jun;30(6):1402-3.

Exploitation des courbes de croissance Orientation lidentification bactrienne

Daprs les travaux de recherche du Groupe Hospitalier Cochin Saint Vincent de Paul, Paris

Apport lidentification bactrienne


Dfinitions pralables des paramtres Dlai de dtection : t * t spcifique dune espce ou dun groupe bactrien MAIS * t inversement proportionnel la densit de linoculum * travaux du Groupe Hospitalier Cochin Saint Vincent de Paul, Paris relation semi-logarithmique : t= a log (UFC/ml) + b = Gne lidentification : facteur inoculum

Angle de la phase exponentielle de croissance :


Hauteur de plateau en units de rflectance (pour lautomate Bact/Alert)

Investigation : travaux de recherche Groupe Hospitalier Cochin Saint Vincent de Paul, Paris
tude des germes Staphylocoques aureus, Staphylocoques coagulase ngative, Pseudomonas aeruginosa, entrobactries sur lautomate Bact/Alert

Quantification des paramtres partir dinoculum standardiss (104 UFC/ml) de germes


injection d1ml dinoculum dans un flacon dhmoculture arobie Rq : dilution finale infrieure celle que lon rencontre en pratique en injectant 10 30 ml de sang avec une bactrimie denviron 1 UFC/ml chez ladulte) mesure des paramtres

Vrification prospective des paramtres sur un ensemble dhmocultures positives (arobie et anarobie)
Condition pralable : exclusion des flacons conservs ltuve la nuit avant lintroduction dans lautomate (mesure retarde de la croissance)

Rsultats :
Avec un inoculum 104 UFC/ml :

t
entrobactries S.aureus P.aeruginosa Staphylocoques coagulase ngative 8 9,5h 11,5 13h 11,5 15h S.haemolyticus 11h

86 87, 5 83,5 85,5 40, 5 57 60 73

h
>3000u >2800u 330 470u 1600 2200u

S.Hominis et S.epidermidis >20h

partir des donnes prospectives (en conditions relles)

t (mdiane)
Entrobactries
flacon arobie (FA) et anarobie (FN)

83,5 89,5

h
>3000 (flacon anarobie)

11 12h

S.Aureus
flacon arobie (FA)+ anarobie (FN)

17h (arobie) 20h (anarobie)

82,5 85(flacon arobie)

>2500 (flacon arobie)

P.aeruginosa
flacon en verre flacon en plastique

14,7 16,5 26h


(rpartition trs variable)

52,5 71,3 79

275u 688 996u

Staphylocoques coagulase -

Les donnes absentes pour les flacons anarobie et/ou arobie sont indisponibles ou non tudies

Interprtation des rsultats


t : plus long dans ltude prospective / tude exprimentale utilisant un inoculum de 104 UFC/ml normal, car la concentration finale de germe dans le flacon arobie est environ 1000 fois moins importante dans ltude prospective / tude exprimentale

et h ne semblent pas varier en fonction de linoculum

Conclusion

t, et h

: intrts et limites des facteurs

limites t peu fiable (cf courbe de rpartition) espces dpendant pour les staphylocoques coagulase inoculum dpendant pour lensemble des espces tudies ici *le plus souvent inoculum trop faible par rapport la mdiane (antibiothrapie pralable, collection abdominale cloisonnes) *rarement inoculum plus fort (endocardites, prlvements sur matriel infect par exemple pour les staphylocoques coagulase -)
Intrts et h semblent deux paramtres plus probants diffrencier P.aeruginosa et entrobactries diffrencier staphylocoques dors et les staphylocoques coagulase condition de vrifier en conditions relles les facteurs et h pour les staphylocoques coagulase -

Conclusion de ltude (1)

Avantages

Bon outil complmentaire lexamen direct exemple : bacille gram ngatif mobile ou immobile aide lorientation diagnostique : entrobactries ou pseudomonas aeruginosa aspect particulier de la courbe des fauxpositifs intrt dtudes supplmentaires pour dautres germes

Conclusion de ltude (2)

Inconvnients

Ncessit dun chargement rapide du flacon dhmoculture prlev : contrler le dlai prlvement / chargement, pour une mesure correcte des paramtres t, et h donc : impossible de laisser les flacons dans une tuve la nuit en attendant le chargement garde 24/24H
La mesure de h et ncessite le maintien dans lautomate des flacons pendant un temps variable selon les germes

Perspectives (1)

Dfinir les paramtres pour dautres automates Paramtrer les courbes de croissance dautres germes (anarobies, levures, mningocoque, pneumocoque, brucella, levures....) Paramtrer les courbes de croissance pour les nouveaux flacons en plastique BacT/Alert de Biomrieux (donnes diffrentes daprs les tudes sur le pyocyanique)

Perspectives (2)

Prvoir une tude pour les contaminants : dterminer un dlai de dtection maximal pour une espce donne au dessus duquel on pourrait exclure la probabilit dune contamination t inoculum dpendant : inconvnient pour lidentification bactrienne mais intressant pour le diagnostic de bactrimie sur matriel en comparant 2 hmocultures prleves lune en voie priphrique lautre sur matriel , ayant priori le mme germe

Annexes : courbes de rpartition du nombre dhmocultures dtectes en fonction du temps et du type de flacon

S.aureus

Staphylocoques coagulase -

E.coli

Actualisation des donnes en avril 2004 application pratique l hpital Cochin St-Vincent-de-Paul

ds 2003 : travail la mise en place dun logiciel d exploitation mathmatique des courbes (obtenir les donnes t, et h) pour l heure :
approche qualitative des courbes (approximative) Pendant la journe, les flacons sont retirs ds la dtection du signal (amorce de courbe; exploitation cependant envisageable dans le futur avec l analyse multi-paramtrique des logiciels)