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Citometria de Fluxo

Citometria: Anlise quantitativa de parmetros celulares (clulas, ncleos, cromossomas, mitocndrias, etc)

Citometria de Fluxo: Anlise multiparamtrica de


partculas (uma a uma) em suspenso.

Princpio:

Fazer passar as partculas em suspenso, de uma forma alinhada, por um feixe de luz A interaco das partculas com o feixe gera sinais que so captados por detectores apropriados A informao produzida pode ser gerada: Pela disperso do feixe de luz Pela luz emitida por fluorocromos aps excitao pelo feixe de luz

O que um Citmetro de Fluxo?

Requisitos Bsicos num Citmetro de Fluxo


Suspenso de partculas Fluxo laminar Fonte de iluminao Cmara de Fluxo Filtrao da disperso de luz e fluorescncia Captao da disperso de luz e fluorescncia Converso dos sinais em valores analgico-digitais Electrnica Aquisio, Processamento, Anlise e Armazenamento no computador Fludos ptica

Fludos

Injeco da amostra no lquido de envolvimento (sheath fluid), passando por um pequeno orifcio central do fluxo (50-300 m)
As partculas fluem no centro, no se misturando com o restante lquido de envolvimento A injeco da amostra em fluxo laminar e a regulao da presso so conseguidas atravs: - Presso Diferencial - Velocidade de Fluxo - Fluxo Contnuo

Cmara de Fluxo
Agulha de injeco Lquido de
envolvimento

Laser

Disperso laser

Ponto de Hidrofocagem

ptica

Fontes de iluminao:
Lmpadas de Mercrio

Lasers

Emite num comprimento de onda (ex: 488 nm- azul), monocromtico. Produz um feixe de luz coerente

Laser

Fotosensor de Disperso Frontal (FS)

Capta a intensidade da disperso frontal A intensidade da disperso frontal

proporcional ao tamanho e forma das partculas


.

Laser
Sensor de FS

Fotosensor de Disperso Lateral (SS)


Capta a intensidade e luz dispersa a 90o

A intensidade dessa disperso proporcional ao tamanho, granularidade e forma das partculas


Laser
Sensor de FS

Sensor SS 900

Disperso da Fluorescncia

A fluorescncia emitida detectada por fotosensores que recebem o comprimento de onda seleccionado A especificidade da deteco de cada sensor controlada pela seleco do comprimento de onda, atravs de uma conjugao de filtros e de espelhos.
Laser
Sensor de FS

Detectores de Fluorescncia (PMT1, PMT4 etc.)

Tipos de fluorocromos
Currently Available Fluorochromes (Visible Light Emission)
Fluorochrome FITC Cy3 R-PE (PE) Pe-Cy5 (TC1) PerCP (BD2) PerCP/Cy5.5 (BD) Texas Red APC Cy5 Laser (nm) 488 488 488 488 488 488 595 633, 635 633, 635 Emission (nm) 525 565 575 667 675 695 615 660 667

Espectros de Excitao / Emisso


350
300 nm 400 nm

457

488

514

610 632
600 nm 700 nm

500 nm

Texas Red

PI
Ethidium PE

FITC

Caractersticas dos fluorocromos:


1) Emisso adequada (> 600 nm) de forma a minimizar problemas de autofluorescncia 2) Emisso de intensidade significativamente maior que a de autofluorescncia 3) Espectro no sobreposto com outros fluorocromos 4) Facilmente conjugvel com anticorpos

Fuorescncias derivadas de Energias de Transferncia


Sobreposio de emisso de luz dos fluocromos Tranferncia dessa luz entre o 1 e o 2 fluorocromo O segundo emite num comprimento de onda superior ao primeiro

Filtro ou Espelho Dicrnico Colocado a 45o

Fonte de Luz

Luz Transmitida

Luz Reflecti da

Captao dos Parmetros de Anlise: PMT


4

Cmara de Fluxo

Filtros Dicricos

PMT
3

PMT
2

Filtros PMTBandpass
1

Fotosensores

Laser

Electrnica

Processamento electrnico do sinal gerado nos sensores que traduzido num histograma ou scatter plot

O que pode ento dizer um Citmetro de fluxo de uma clula? Tamanho (FSC) Complexidade (SSC) Fluorescncia relativa. (FL1, FL2, FL3, Complexidade Antgenos celulares Tamanho Metabolismos Enzimas

Receptores

DNA Citocinas

Aplicaes

Imunologia Hematologia Anatomia patolgica Biologia celular Oncologia

Aplicaes diversas
Deteco de apoptose
Permeabilidade membranar

Mudanas do contedo
de DNA Estudos enzimticos funcionais
0 200

G0/G1 S

G2/M
1000

Resistncia a frmacos

600 4N 800 2N DNA content

Separao de clulas sanguneas Diferenciao de sub populaes de linfcitos T


Diferenciao linfcitos B Diferenciao de clulas NK Quantificao antignica Variaes linfoproliferativas (idade, , imunodeficincias, neoplasias, transplantes, doenas autoimunes, inflamaes) Fagocitose

Imunologia - Aplicaes prticas

Separao de clulas sanguneas

Granulcitos

Monocitos
Linfocitos

Diferenciao da subpopulao de linfcitos


Os linfcitos T, originados no Timo experimentam maturao que resulta de um processo de seleco positiva e negativa, durante o qual se formam as clulas CD4 e CD8. Os linfcitos B originados na medula ssea vo expressando sequencialmente antignios especficos CD19+, CD10+ e CD20+, at se diferenciarem terminalmente em Igs. As clulas NK carecem de marcadores das clulas T ou B, mas so constitutivamente citotoxicas. Na sua diferenciao associam-se a marcadores de funes linfocitrias: CD16

Quantificao antignica/ maturao

FACS Fluorescence-activated cell sorter Permite separar subpopulaes de linfcitos com base nas diferentes protenas expressas superfcie (B, TCD4, TCD8) Cada tipo celular marcado com um anticorpo especfico que se encontra acoplado a um corante fluorescente. O citmetro de fluxo detecta e conta individualmente as clulas que passam atravs do laser

488 nm laser

Sensor Fs
Detectores de Fluorescncias

Placas Carregadas

Tubos para Recolha do Produto Separado

FACS: desenhado para a anlise computarizada de clulas e separaa das mesmas

No exemplo, uma populao celular mista marcada com 2 anticorpos especficos de antignios de superfcie : anti-A e anti-B. Os anticorpos anti-A so marcados com fluoresceina e os anti-B com Rodamina. Toda a populao introduzida na camara de FACS. As clulas vo ser expelidas pelo nozzle gerando microgotas, cada contendo uma nica clula. Cada microgota assim que expelida recebe uma pequena carga elctrica-excitao do fluorocromo, aquando da sua passagem pelo laser, sendo a intensidade da fluorescncia emitida e detectada no computador. Esta carga elctrica dirigida por 2 placas de defleco faz que cada microgota possa ser defletida do seu caminho e colectada para um tubo. Isto permite separar as populaes com perfis diferentesPopulao A e Populao B. No computador cada dot representa uma clula, e as clulas que caem esquerda inferior do quadrante do scatter so consideradas background- no reagiram c/ anti-A ou anti-B.

Aplicaes clnicas: so mltiplas principalmente na deteco de antignios target nas clulas sanguneas

Classificao de leucemias Deteco de HIV Marcadores tumorais Na previso da evoluo do curso de doena Deteco microbiolgica : bactrias, fungos,parasitas e vrus Deteco e quantificao de ac.nucleicos virais e antignios virais Teste de susceptibilidade a drogas