SEMINARIOS BIOQUÍMICA I

• CROMATOGRAFÍA

• Electroforesis

• Técnicas de ADN Recombinante

 INTRODUCCIÓN
CROMATOGRAFÍA “escribir en colores”
(chroma-color y graphein-escribir)

Separación de biomoléculas… • proteínas Mikhail Tswett

• péptidos 1906
• aminoácidos
• lípidos
• ADN/ARN …
… en función de su diferente
distribución en dos FASES
análisis y
(¡siempre!)  Principio de
retención selectiva purificación

F. MÓVIL: líquido
A
(solvente) gas
B
F. ESTACIONARIA: sólida
FASE
MÓVIL
FASE
ESTACIONARIA (retenida en un SOPORTE) líquida
 INTRODUCCIÓN

CROMATOGRAFÍA

Los componentes de una mezcla son disueltos en una

fase móvil que se desplaza a través de una fase
estacionaria.
Cada molécula interacciona en distinta forma con la f.
móvil y la f. estacionaria (según sus PROPIEDADES
FÍSICO-QUÍMICAS)  atraviesan la fase estacionaria
a diferente velocidad

SEPARACIÓN O FRACCIONAMIENTO

F. MÓVIL: líquido
A
(solvente) gas
B
F. ESTACIONARIA: sólida
FASE
MÓVIL
FASE
ESTACIONARIA (retenida en un SOPORTE) líquida
 CLASIFICACIÓN
3 CRITERIOS

1_ Según el estado físico de la fase móvil:

FASE MÓVIL líquido  Cromatografía de LÍQUIDOS

gas  Cromatografía de GASES

2_ Según la causa por la que se separan los componentes de la muestra

(relacionado con las propiedades físico-químicas de las biomoléculas):

• Solubilidad • Hidrofobicidad
• Tamaño • Interacciones por afinidad biológica
• Carga eléctrica • Interacciones inespecíficas

3_ Según la metodología utilizada para el desarrollo de la cromatografía

(relacionado con la fase estacionaria: tipo de SOPORTE que la contiene):

FASE ESTACIONARIA  Sobre superficie plana

 En columna
 TIPOS DE CROMATOGRAFÍA
Fase Fase Tipo
móvil estac. Clase (propiedad) Nombre Ejemplo
Líquida Líquida Reparto Solubilidad Fase normal EN PAPEL (superficie plana)

Fase inversa

Tamaño Exclusión GEL FILTRACIÓN

(columna)

Interacciones Intercambio INTERCAMBIO IÓNICO

Sólida Adsorción
electrostáticas iónico (columna)
(¡NO
aBsorción!) Hidrofobicidad Interacción EN CAPA FINA o TLC
Hidrofóbica (superficie plana)

HIDROFÓBICA
Interacciones Afinidad AFINIDAD (GST)
por afinidad (columna)
biológica
Interacciones Adsorción HIDROXIAPATITO
inespecíficas
 CROMATOGRAFÍA EN SUPERFICIE PLANA
CÁMARA
F. ESTACIONARIA
CROMATOGRÁFICA
(polar)

FLUJO
propiciado por
MUESTRA
CAPILARIDAD

Superficie plana = soporte

FASE MÓVIL
FRENTE de avance del solvente (apolar)

distancia avanzada por la molécula

hidrofóbica Rf=
distancia avanzada por el frente

Rf es característico para cada sustancia

hidrofílica para una composición dada de fase móvil y
un determinado tipo de superficie
 CROMATOGRAFÍA EN PAPEL

PROPIEDAD: Solubilidad

SOPORTE  celulosa de papel de filtro

F. ESTACIONARIA  (LÍQUIDA) H2O absorbida en la

celulosa.
F. MÓVIL  (LÍQUIDA) Disolvente orgánico

H2O H2O
H2O H2O
H2O H- H2O
H-
H2O H- H2O
H2O
H2O H2O

Molec. Hidrofílica  LENTA Molec. Hidrofóbica  RÁPIDA

(soluble) (insoluble)
Retenida por f. estacionaria Disuelta en fase móvil RESULTADO
 CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (TLC)

PROPIEDAD: Hidrofobicidad

SOPORTE  plancha de metal o vidrio

F. ESTACIONARIA  (SÓLIDA) sólido pulverizado

sobre plancha de metal o vidrio. El más usado es el gel de
sílica.

F. MÓVIL  (LÍQUIDA) Disolvente orgánico

-Si-OH H-
-Si-OH
-Si-OH H-
-Si-OH
-Si-OH H-
-Si-OH
-Si-OH -Si-OH
-Si-OH -Si-OH

Molec. Hidrofílica  LENTA Molec. Hidrofóbica  RÁPIDA

Retenida por f. estacionaria Disuelta en fase móvil
 CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
EMPAQUETADOAPLICACIÓN
ELUCIÓN Y RECOGIDA DE FRACCIONES
COLUMNA MUESTRA

RESERVORIO
f. móvil
LECHO
CROMATOGRÁFICO
f. estacionaria

COLUMNA MUESTRA

FLUJO
gravedad

DIFUSIÓN
llave

SEPARACIÓN O FRACCIONAMIENTO
 CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

PERFIL DE ELUCIÓN

Moléc. distribuida
en f.móvil
Moléc. distribuida
en f.estacionaria

FRACCIONES

respuesta del detector

ANÁLISIS DEL
CONTENIDO DE LAS
FRACCIONES
1 2 3 4 5 6 7 8 9

Pero normalmente las

fracciones no presentan Espectrofotométrico
diferente coloración… 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Abs 280nm – Proteínas fracción

Otras Abs - Colorantes
 CROMATOGRAFÍA DE GEL FILTRACIÓN

PROPIEDAD: Tamaño (y forma)

SOPORTE  Resina de micropartículas esféricas porosas

formadas por polímeros hidrofílicos (dextrano, agarosa,
poliacrilamida o mezcla de ellos). Diámetro de poro FASE MÓVIL
determinado.

Tamaños de poro  intervalo o rango de fraccionamiento.

P.e. Sephadex G25: 1000 – 5000 Da

Sephadex G200: 5000 – 250000 Da
F. ESTACIONARIA

F. ESTACIONARIA  (LÍQUIDA) solvente acuoso (el MICROPARTÍCULAS

mismo que el de la fase móvil) que se encuentra dentro de
micropartículas.

F. MÓVIL  (LÍQUIDA) solvente acuoso que atraviesa la

columna por los espacios intersticiales (entre las
micropartículas).
 CROMATOGRAFÍA DE GEL FILTRACIÓN
Molec. GRANDES  RÁPIDAS

* Avanzan a mayor velocidad a través de los

espacios intersticiales entre las bolas (con f.
móvil)  son eluidas antes

Molec. PEQUEÑAS  LENTAS

* Penetran en los pequeños conductos de las

bolas de gel y avanzan a menor velocidad (con
f. estacionaria)  son eluidas después

PERFIL DE ELUCIÓN
APLICACIÓN grande
MUESTRA
pequeña
respuesta del detector
ELUCIÓN

1 2 3 4 5 6 7 8 9
fracción
 CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

PROPIEDAD: Interacciones electrostáticas (carga eléctrica)

SOPORTE  Resina de micropartículas formadas por

polímeros sintéticos o naturales (dextranos, celulosas,
agarosa).

F. ESTACIONARIA  (SÓLIDA) Grupos con cargas FASE MÓVIL

iónicas unidos al soporte.

Carga positiva (+)  intercambiadores de aniones (-):

cromatografía aniónica
Carga negativa (-)  intercambiadores de cationes (+):
cromatografía catiónica F. ESTACIONARIA

F. MOVIL  (LÍQUIDA) Solvente que anula la interacción MICROPARTÍCULAS

electrostática.

2 posibilidades: Gradientes de pH  cambio de carga

de las moléculas de la muestra.
Gradientes iónicos (salinos)  competencia
por grupos electrófilos.
 CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
•Gradiente de pH
•Gradiente salino Molec. MENOR CARGA (+)  RÁPIDAS

* Son desplazadas más fácilmente por la

f.móvil. Las moléc. (-) son rechazadas por la
f. estacionaria y eluidas directamente.

Molec. MAYOR CARGA (+)  LENTAS

* Son retenidas por los grupos cargados

iónicamente de la f. estacionaria.

PERFIL DE ELUCIÓN
q+
Q+
APLICACIÓN
respuesta del detector

MUESTRA +

Na+
ELUCIÓN

-
* Cromatografía
1 2 3 4 5 6 7 8 9
catiónica fracción
 CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

PROPIEDAD: Interacciones específicas entre dos moléculas

P.e. hormona-receptor
proteína-metal o cofactores como ATP
antígeno-anticuerpo

SOPORTE  Matriz de micropartículas hidrofílicas sin FASE MÓVIL

carga, con rigidez, inerte y estable (agarosa, acrílica).

F. ESTACIONARIA  (SÓLIDA) Ligandos (grupos

químicos) específicos (con afinidad por alguna de las
moléculas a aislar) unidos a la matriz.

-- Comerciales: Concavalina A  une glicoproteínas

Proteína A  une IgG (anticuerpos) F. ESTACIONARIA
-- No comerciales: anclaje covalente ligando - matriz
MICROPARTÍCULAS
F. MÓVIL  (LÍQUIDA) Solución que anula o disminuye la
afinidad con el ligando de la fase estacionaria.

-- Solución con el propio ligando  Molécula + ligando libre

-- Solución con algo que interacciona con el ligando  Molécula
 CROMATOGRAFÍA
DE AFINIDAD
Molec. NO INTERACCIÓN  RÁPIDAS

* No se unen al ligando de la fase

estacionaria  eluyen directamente.

Molec. INTERACCIÓN  LENTAS

* Se unen al ligando de la f. estacionaria.

Elución específica.

PERFIL DE ELUCIÓN
ELUCIÓN
LAVADO ESPECÍFICA

respuesta del detector

molécula

APLICACIÓN
MUESTRA

LAVADO
ELUCIÓN 1 2 3 4 5 6 7 8 9
ESPECÍFICA fracción
 CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
Sistema GST (Glutatión-S-Transferasa)
Purificación de PROTEÍNAS RECOMBINANTES
GST
Cualquier proteína marcada con etiqueta GST
Proteína X

Glut
ELUCIÓN

Glut Glut GST Glut

APLICACIÓN
MUESTRA Glut GST
 CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

Aplicación básica  PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS.

Normalmente se combinan diferentes técnicas para
optimizar el proceso (de menos a más específicas).
 Links a animaciones de cromatografía:

http://biomodel.uah.es/biomodel-misc/anim/cromat/crom-exclusion.html

http://biomodel.uah.es/biomodel-misc/anim/cromat/crom-afinidad.html