ANALISIS CLINICO

RECONOCIMIENTO DE VIRUS

SIUCE BONIFACIO Encarnacin

VIRUS
Los virus son entidades biolgicas compuestas de material

gentico dentro de una cubierta llamada cpside

Algunos tienen una capa adicional denominada envoltura. No poseen la capacidad de reproducirse por si mismos dependiendo de un husped para replicarse por cual son llamados parsitos intracelulares obligados.

Son genes empaquetados en una cubierta de

protenas, la cual les permite su

transferencia de una clula a otra.

su material gentico es DNA O RNA, organizado armnica para elaborar ms virus. en forma

TAMAO
Son muy pequeos: Desde 20nm (parvovirus) hasta 300nm

(Poxvirus). De 100 a 1000 veces ms pequeos parasitan. Slo se visualizan al microscopio electrnico identificarlas por se lo que para usar que la clula que

suelen

reacciones de infectividad biolgica, serolgica, sondas moleculares.

TAMAO DE LOS VIRONES

18 a 300 nm DE DIMETRO
Escherichia coli (1,000 x 300 nm)

Clula Roja Sangunea (10,000 nm de dimetro)

2,500 nm

750 nm

Ribosomas bacterianos (25 nm)

Poxvirus (200 x 300 nm)

Poliovirus (30 nm) Bacteriofago T4 (50 x 225 nm) Bacteriofago MS2 (24 nm)
Virus del Mosaico del tabaco (15 x 300 nm)

300 nm

MORFOLOGIA
VIRIONES CON MORFOLOGA TUBULAR VIRIONES CON MORFOLOGA ESFERICA

MORFOLOGIA

ESTRUCTURA

ESTRUCTURA VIRUS / VIRIONES

1. GENOMA VIRAL VIRION : DNA - RNA LINEAR CIRCULAR SEGMENTADO O NO SEGMENTADO

2. CAPSIDE VIRAL POLIPEPTIDOS ESPECIFICOS VIRALES PROTECCION DETERMINANTES ANTIGENICOS

3. ENVOLTURA VIRAL GLICOPROTEINAS ESPECIFICAS VIRUS LIPIDOS Y LIPOPROTEINAS HUESPED ANTIGENICOS / INICIAN INFECCION

REPRODUCCION

CICLO LTICO
En el ciclo ltico el ADN bacteriano fabrica las protenas vricas y copias de cidos nucledos. Cuando hay suficiente cantidad de estas molculas, se produce el ensamblaje de la protena y el A.N.

vrico se liberan al medio, produciendo la muerte de

la clula.

CICLO LTICO

CICLO LISOGNICO
En el ciclo lisognico se produce cuando el genoma del virus queda integrado en el genoma de la

bacteria, no expresa sus genes y se replica junto al

de la bacteria. El virus queda en forma de profago.

CICLO LISOGNICO

VIRUS SEGN EL ACIDO NUCLEICO

Clasificacin DNA RNA

VIRUS ADN

VIRUS ARN

CLASIFICACION
HepaDNAvirus: Hepatitis B C. DNA Adenoviridae: Adenovirus RNA Rhabdoviridae (Rabies virus) Caliciviridae (Norwalk)

Pox Viridae:
Molluscum, Viruela, Vaccinia

ORGANO DAO O LESION

ESTRUCTURA Y FUNCION (genotipo, clinica)

Flaviviridae (Dengue, Hepatitis B Fiebre amarilla)

Papova viridae: condiloma.

Papillomaviruses,

wart,

Retroviridae (HIV, Sarcoma)

Paramixoviridae (sarampion, paperas, Parainfluenza, VSR)

TECNICAS DE DIAGNOSTICO

TECNICAS DE DIAGNOSTICO
METODO DIRECTO
1. Cultivos celulares, (Aislamiento viral) 2. Tcnicas inmunolgicas. (Deteccin de Ag Virales)
Inmunofluorescencia (IFD)
Enzimoinmunoanlisis (EIA) Test de aglutinacin.

MTODOS INDIRECTOS
Se basan en la deteccin de Ac especficos mediante TCNICAS

INMUNOLGICAS

Inmunofluorescencia (IFI)
Enzimoinmunoanlisis (EIA) Western blot, etc.).

3. Tcnica de la BCM(Identificacin de la presencia de AN virales )

PCR (Amplificacin de AN virales mediante una reaccin en cadena de la polimerasa)

4. Microscopa electrnica (virus como

partcula viral)

CULTIVOS CELULARES
Biosustrato mas empleado para propagacin de virus. Los mas utilizados para propagar el virus son:
CAVIDAD ALANTOIDEA SACO VITELINO MEMBRANA CORIOALANTOIDEA

Animales de experimentacin

Embriones Animales

CAMARA DE AIRE

SACO AMNITICO

ALBMINA

CULTIVOS CELULARES
Estn formados por clulas disgregadas que han perdido su organizacin tisular.
LNEAS DE CULTIVO A los que tras la obtencin de las clulas de un rgano o tejido pueden propagarse posteriormente invitro
L. C de Tejido embrionario Permite alrededor de 50 cultivos L. C. Neoplasicos Permite ms cultivos Tejidos de 70

CULTIVOS Obtenidos

PRIMARIOS. de clulas

normales de un organismo
animal adulto, se

mantiene vivas por algn

tiempo pero no pueden

propagarse invitro.

FRAGMENTO DE TEJIDO

TRIPSINA

SUSPENSIN CELULAR

INCUBACIN A 37 C 5% CO2

MONOCAPA CELULAR

CULTIVO PRIMARIO

DISGREGACIN CELULAR

SUBCULTIVO O PASE 1:2 LNEA CELULAR

PRINCIPIO BASICO DEL CULTIVO CELULAR

Es la identificacin de los virus se detectan en estos cultivos por accin citopticas (lesin que causan algunos virus a las clulas que infectan)

VIRUS RESPIRATORIO SINCITIAL HUMANO en clulas VERO 24-48 horas pos-infeccin

VIRUS RESPIRATORIO SINCITIAL HUMANO en clulas VERO 72 horas pos-infeccin

VIRUS RESPIRATORIO SINCITIAL HUMANO en clulas VERO 96 horas pos-infeccin

TCNICAS INMUNOLGICAS
Inmunofluorescencia (IF) Enzimoinmunoanlisis (EIA) Test de aglutinacin

INMUNOFLUORESCENCIA (IF)
Consiste en conjugar ciertos colorantes fluorescentes con Ac o en raras ocasiones con Ag, exponiendo

despus estos conjugados al microscopio observa una

florescencia en el foco de interaccin de antgenos anticuerpos.

INMUNOFLUORESCENCIA VIRAL
VENTAJAS
Rpido y verstil Diagnstico simultneo para mltiples virus Detecta de virus viable y noviable Resultado < 24 horas Mejor sensibilidad que las pruebas rpidas
70 -80 % Virus Herpes Simple

DESVENTAJAS:
No diferencia entre
subtipos Requiere experiencia tcnica Requiere de

microscopio de
fluorescencia Costoso

80-95% VRS 71% para Influenza A.

MTODO DIRECTO
El Ac marcado reacciona con el Ag produciendo fluorescencia con luz UV.

La marca fluorescente se conjuga con la protena Ac

PROCEDIMIENTO
Colocar la muestra sobre portaobjetos

donde se dejan secar y fijar

Agregar Ac especficos marcados con isotiocianato de fluorescena que

difunden a travs de la membrana

celular y se combinan con los Ag vricos en el interior de las clulas. La reaccin Ag-Ac se visualiza con el microscopio de fluorescencia, por la aparicin de fluorescencia de color verde manzana.

MTODO INDIRECTO
Reaccin de antiglobulina : El Ac no marcado reacciona con el Ag y se desarrolla la coloracin con anti globulina marcada (antianticuerpo)

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA: PRUEBA POSITIVA

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA: PRUEBA NEGATIVA

TEST DE AGLUTINACION
Dependen de la fijacin inicial de Ac antivirales especficos sobre eritrocitos o partculas de ltex. Luego se incuba con la muestra clnica en el cual se investiga el Ag. Las partculas se aglutinan si el Ag adecuado se encuentra presente. Utilizado para detectar Ag de Rotavirus en heces y de Adenovirus.
VENTAJA: Es rpida y barata

DESVENTAJA: Requiere confirmacin con otros ensayos

REPRESENTACIN ESQUEMTICA DE UN ENSAYO DE AGLUTINACIN

ENZIMOINMUNOANALISIS
Se basan habitualmente en la captura del antgeno por anticuerpos

especficos unidos a una fase slida

El Ag viral presente en la muestra clnica se combina con el Ac fijado a la fase slida y

El Ag viral se detecta mediante la adicin de otro anticuerpo especfico

conjugado a una enzima. La enzima conjugada suele ser peroxidasa o fosfatasa alcalina.

En la reaccin con la peroxidasa el substrato es un perxido capaz de

oxidar un compuesto qumico incoloro que en su forma oxidada tiene un color caracterstico.

ESQUEMA PARA LA DETECCIN DE ANTGENOS POR ENZIMO INMUNO ENSAYO DIRECTO

PRUEBA DE ELISA

(TCNICAS DE ANLISIS INMUNOABSORBENTE LIGADO A ENZIMA )

La deteccin de Ag se basan en la captura del Ag por Ac especficos unidos a una fase
slida. El Ag viral presente en la muestra se combina con el Ac fijado a la fase slida y el Ag viral se detecta mediante la adicin de otro Ac especfico conjugado a una enzima.

La enzima conjugada suele ser peroxidasa o fosfatasa alcalina. En la reaccin con peroxidasa el substrato es un perxido capaz de oxidar un compuesto

qumico incoloro, que en su forma oxidada tiene un color caracterstico.

Si la enzima es fosfatasa, la desfosforilizacin es la responsable directa de la

aparicin del color

RESULTADOS DE UNA PRUEBA DE ELISA

Positiva (desarrollo de color)

Negativa (incolora)

TCNICA DE BIOLOGA MOLECULAR PCR

BASADOS EN LA DETECCION LOS CIDOS

NUCLEICOS
Extraer secuencias especficas de un fragmento de ADN por medio de endonucleasas de restriccin. Luego estas secuencias extradas se pueden una desnaturalizar y marcar con o con un istopo Hibridacin molecular con una sonda marcada. Las hibridaciones pueden ser: ADN - ADN,

ARN-ARN y ADN-ARN.

enzima

radioactivo. A estas cadenas marcadas, que tienen una secuencia de ADN conocida se llaman sondas de cidos

nucleicos.

HIBRIDACIN DE AND CON UNA SONDA MARCADA

DETERMINACION DE AN VIRALES
Tratar las muestras con reactivos que solubilizan y desnaturalizan los AN. Luego se aade un fragmento de ADN marcado, complementario al ADN viral Incuba en condiciones que posibiliten la hibridacin. Finalmente la muestra se pasa por una columna que contiene un gel que separa la sonda ligada al ADN hibridado, de la no hibridada.

Se puede hacer una lectura en un contador gamma, en la cual la cantidad de radiacin medida en la columna es directamente proporcional a la cantidad de ADN viral presente en la muestra problema.
Tambin se puede realizar la electroforesis del ADN hibridado con la sonda marcada, en gel de poliacrilamida y detectar la radioactividad emitida por la sonda mediante la aplicacin de rayos X . Si est marcada con una enzima se detecta por colorimetra.

Citomegalovirus , Papilomavirus y virus EpsteinBarr, han sido identificados usando sondas de cidos nucleicos

ELECTROFORESIS EN GEL

LCR Orina Plasma Biopsia

1er. round
2n copias DNA

ADN PCR 2do. round

Producto nested-PCR Electroforesis en gel

AMPLIFICACIO DE AN VIRALES MEDIANTE REACCION EN CADENA DE POLIMERASA (PCR )

Se basa en el uso de secuencias cortas de nucletidos sintticos llamados primers o cebadores, que se hibridan especficamente con cada una de las cadenas de ADN previamente desnaturalizadas, llamadas moldes o templados. Se usa una enzima ADN polimerasa termoestable y deoxinucletidos trifosfatos. Se sintetiza as una cadena simple de ADN, complementaria y alineada a cada cebador. Se realiza una serie repetida de ciclos, cada uno compuesto por tres pasos bsicos:
Desnaturalizacin del ADN de doble cadena Acoplamiento de los cebadores permitiendo la incorporacin de los deoxinucletidos. Se van sintetizando nuevas cadenas de ADN.

Al final se consiguen miles de copias de ADN del fragmento de ADN limitado por los cebadores. Los fragmentos de ADN obtenidos se pueden identificar por varias tcnicas: visualizacin en geles de agarosa o poliacrilamida con tincin con bromuro de etidio y examen con luz ultravioleta o hibridacin con una sonda marcada.

VENTAJAS DIAGNSTICO POR REAL TIME-PCR Deteccin rpida. Deteccin cualitativa cuantitativa.

No requiere manipulacin postPCR. Menor probabilidad de contaminacin o errores de manipulacin.

RT-PCR TIEMPO REAL

Amplificacin de un segmento especfico de ADN Sondas y primers especficos para la deteccin de:
Influenza A Influenza A/H1 Influenza A/H3

Influenza A/H5a
Influenza A/H5b Influenza B

RT-PCR TIEMPO REAL

VENTAJAS
Altamente especfico Detecta virus viables y no-viables sensible (una sola

DESVENTAJAS
Requiere experiencia

molcula puede ser detectada) y

tcnica
Primers y sondas deben ser actualizados Estandarizacin
de

Herramienta de estudios de alta

complejidad identificacin de variabilidad gentica Procesamiento simultneo

nterlaboratorial limitada

muchas muestras e identificacin de diferentes virus Resultados en < 24 horas

reactivos y equipos
Costoso

MICROSCOPIA ELETRONICA
Con el Se me puede observar la morfologa de los viriones presentes en las muestras clnicas. La limitacin es que necesita una concentracin elevada de viriones, por lo tanto decimos que es poco sensible. Es una tcnica poco usada, ms an con el desarrollo de tcnicas alternativas de similar utilidad.

El ME permite, por ejemplo, obtener resultados positivos rpidos de muestras de

materia fecal de pacientes con diarrea.

Rotavirus, Adenovirus, Coronavirus y Calcivirus pueden ser visualizados e identificados como causantes de esta enfermedad.

MICROSCOPIA ELETRONICA

DIAGNSTICO PATOLGICO

POXVIRUS - VIRUELA CUERPOS DE GUARNIERI

Epiteliales, citoplasma precipitados virales rosados

RHABDOVIRUS CUERPOS DE NEGRY

Cerebelo, Protoplasma precipitados virales y proteinicos

members.tripod.com/~dermpath/dpqz27contpg2.html

MOLUSCO CONTAGIOSO CUERPOS HENDERSON - PATTERSON

Keratinocios, cuerpos de inclusin gigantes

The images can be freely used for educational purposes Dr. Frederick A. Murphy, School of Veterinary Medicine University of California Davis

From: HIV Web Study <www.hivwebstudy.org>

EFECTO CITOPATOGNICO / CUERPOS DE INCLUSION / PATOGNOMICO

HERPES VIRUS CUERPOS DE COWDRY

VSR (Sincitial respiratorio)

Clulas gigantes fusionadas que forman sincitios nucleados

Epiteliales, cromatina marginal (halo), basfilos balon nuclear

www.valuemd.com/.../118682-cowdry-body.html

Sarah M. Castillo - Clinica Corominas, Santiago, Rep. Dominicana

CITOMEGALOVIRUS OJOS DE BUHO

Epiteliales gigantes Fusionadas inclusin basfila Ricas en ADN viral

PAPILLOMAVIRUS KEILOCYTOTIC

clula intermedia-superficial con gran halo claro perinuclear citoplasmtico y ncleos hipercromticos agrandados

H&E stained lung section showing typical owl-eye inclusions. (480X) Submitted by: Dan Wiedbrauk, Ph.D., Warde Medical Laboratory, Ann Arbor, MI.

Dra. Mirtha Ins Ros Hospital General Docente "Enrique Cabrera" CUBA

LA TCNICA DE WESTERN BLOT (WB)

Dicha tcnica se basa en la separacin electrofortica de protenas virales que son posteriormente inmovilizadas en papel de nitrocelulosa, con el objeto de determinar la presencia de Ac especficos contra cada una de esas protenas.
ESTRUCTURA DE LOS VIRIONES DE VIH

ESTRUCTURA DE LOS VIRIONES DE VIH

LA TCNICA DE WESTERN BLOT (WB)

Se realiza esquemticamente en tres pasos.

1. Se realizan cultivos celulares de grandes cantidades de virus que luego son tratados qumicamente para su disgregacin e inactivacin. 2. Los Ag resultantes del lisado viral se separan por electroforesis en gel de poliacrilamida. 3. A continuacin se realiza una transferencia (blotting o electrotransferencia) de los Ag separados a membranas de nitrocelulosa. Por ltimo se coloca el suero del paciente en la membrana de nitrocelulosa y se agregan Ac anti-inmunoglobulina humana unida a una enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina).
Finalmente se agrega el substrato enzimtico para la visualizacin de las bandas reactivas con un producto final coloreado.

GRACIAS POR SU ATENCION

MECANISMO DE ACCIN DE UN VIRUS