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Universidad Nacional Autnoma de Nicaragua Unan Mangua Ministerio de salud MINSA

Tema : Aislamiento Viral Dengue Influenza


Bioanlisis Clnico

Integrantes Maricela Villanueva Diana Sols Laura Esteban Velasquez Cinthia Alans Lopez Cristian Paola Gonzales Luis Miguel RUIZ Namoyure Managua 5 de Julio del 2013

Objetivos 1 Abordar generalidades del Aislamiento viral y tipos de clulas. 2 - Mencionar generalidades del virus del Dengue e Influenza. 3 Mencionar los mtodos diagnsticos del aislamiento viral. 4 Describir Procedimiento de Aislamiento y identificacin del virus del Dengue e Influenza

Introduccin Un aislamiento Viral es una tcnica de alta Sensibilidad y Especificidad que utiliza cultivos celulares como bisustratos. Los sistemas celulares para aislar los virus en el laboratorio son :
Animales de experimentacin Embriones Animales Cultivos Artificiales

Aislamiento viral
Para el aislamiento de un virus se requiere la recoleccin adecuada de la muestra todas las muestras deben de ser contenidas en un recipiente de
laboratorio de seguridad para trasporte.

El Aislamiento viral es obtenido cuando - Se produce el efecto citopatico. - Aparece una protena codificada por el virus. - Hemodorcion. - Alteracin especifica o muerte del Animal - Aparicin de placa en el huevo Embrionario.

Cuando se requiere un Aislamiento viral


- Cuando ocurren nuevas epidemias. - Para confirmar un diagnostico Presuntivo Realizado al microscopio Electrnico. - Cuando las Pruebas serolgicas se traslapan. - Cuando una misma enfermedad es causada por diferentes agentes.

Los sistemas de crecimiento de los virus son

Inoculacin
La inoculacin es usualmente intracerebral con inculos de 0.03 ml tambin pueden ser subcutneo, intramuscular y de dosis mayores del inoculo.

Parmetros que deben tomarse en cuenta


Sitio de inoculacin Especie y animal Patologa que se produce

Los animales no son muy usados ya que tienen varios inconvenientes

- Pueden ser portador de virus que producen infeccion latente. - Costo de mantener colonias sanas. - Los virus pueden crecer en huspedes diferentes.

Huevos henbrionados Pueden ser utilizados para aislamiento y cultivo de virus. Los huevos henbrionados pueden inocularse diferentes vas dependiendo del de agente que se pretende estudiar. la inoculacin en membrana cariolantoide que es muy til para diferenciar herpes simple la cavidad alantoidea.

Cultivos celulares
El aislamiento en cultivos celulares es la tcnica de oro para la deteccin de un virus . Se derivan del crecimiento de clulas que migran de un tejido o por dispersin enzimtica.

Estas tcnicas dependen de


La adecuada seleccin de lneas celulares La inoculacin de muestra adecuada El correcto mantenimiento de clulas inoculadas Constante seguimiento Confirmacin del aislamiento por mtodos inmunolgicos

Tipos de cultivos celulares


-

Cultivos Primarios: Obtenidos mediante la dispersin de tejidos tomados directamente del organismo y soportan hasta tres pases Ej. (Rin Embrionario). Lneas celulares diploides : clulas que toleran un numero mayor de pases hasta 50 pases pero presentan un crecimiento normal ya que conservan hasta 75% de su cariotipo original Ej.(Fibroblasto de pulmn). Lneas Celulares continuas son capaces de crecer indefinidamente presentan un numero alterado de cromosoma ya que son de origen maligno o canceroso.

Tipos bsicos de cultivo celular


Embrionario o adulto Normales o neoplsico Subcultivos Lneas celulares finitas o infinitas

Medios de cultivos celulares


Tienen todos los requerimientos nutricionales necesarios para que los hongos virus y bacterias se multipliquen en grandes cantidades por lo tanto la contaminacin es algo que ocurre con facilidad. Mtodos para la eliminacin de micro plasmas - Antibiticos - Mtodos qumicos y fsicos - Utilizacin de sueros autoinmunes La conservacin de las clulas deben estar a altas temperaturas aproximadamente alcanzar los 25c

Virus del dengue


Diagnostico viral del dengue Aislamiento en animales
Aislamiento en ratones se inocula Aproximadamente 0.02ml de suero problema por va intracelular a ratones recin nacidos los animales deben de ser observados al menos por 21 dias. Aislamiento en cultivos celulares Aislamiento en cultivos celulares: se utilizan clulas de mosquitos Se recomienda la inoculacin de 0.1ml en monocapas de clulas C6-36HT Sembradas en tubos Se observan cada dia y al dia 10 se realiza inmunoflurecencia. VENTAJAS DE USAR CELULAS DE MOSQUITOS Son mas cencibeles Fcil de multiplicar Se pueden mantener a temperatura ambiente Pueden estar hasta 14 dias sin cambiar de medios Clulas de mosquitos mas utilizadas Ap61 C636 TRA284 Y CLA-1

Otras tcnicas que son husadas actualmente


Deteccin de anticuerpos contra determinado agente viral estos estn clasificados en base a la cuantificacin de Antgeno Anticuerpo como por ejemplo
ELISA

Inhibicin de la hemoaglutinacin
Heemadsorcion Neutralizacin por reduccin de placas Radioinmunoensayos Las que evidencia o descubren material gentico especfico viral conservadas y replicables ya sea en un fluido, clula o tejido entre estos estn(Biologa Molecular): Reaccin en cadena del polimerasa ( PCR) Hibridacin

Influenza
Es una enfermedad infecciosa causada por aerosoles y que infecta las vias respiratorias es de la famila orthomyxoviridae de tipo ARN su tiempo de incubacion va de 1 a 4 dias tipos de Influenza Influenza A con 10serotipos(HINI.H2N2,H3N2,H5N5,H7N7,H1N2 ,H9N2,H7N2,H10N1O) Influenza B Influenza c

Diagnostico de Influenza
Los procedimientos de diagnostico del virus influenza se pueden clasificar en: 1. Diagnostico virolgico basados en deteccin del agente viral por: aislamiento en cultivos celulares o huevos embrionados (Posterior se realiza extraccin del liquido amnitico y alantoideo a prueba de hemaglutinina), deteccin de antgeno y amplificacin parcial del genoma viral por RT-PCR. 2. Diagnostico serolgico basados en la deteccin y medida de niveles de anticuerpos en sueros pareados utilizando las tcnicas de inmunodifusin en agar (IDA), ensayo inmunoenzimtico (ELISA) o inhibicin de la hemaglutinacin (IHA). Cultivo celular en MDCK

Agregar 200 ul de cada espcimen en un frasco de clulas dejando adsorber por 30 minutos a 37c y luego incubar a 33c en incubadora de CO2 Cosechar si ECP 3+ 4+ o si no hay ECP en 6-7 y someter a HA e identificar subtipo por IHA o RT-PCR

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