FERMENTACIN INDUSTRIAL.

Proceso realizado en un fermentador o biorreactor, mediante el cual determinados sustratos que componen el medio de cultivo son transformados por accin microbiana en metabolitos y biomasa. La fermentacin es un proceso de oxidacin incompleto, siendo el producto final un compuesto orgnico. Estos productos finales son los que caracterizan los diversos tipos de fermentaciones.
Fermentacin Aerobia: OXGENO

Fermentacin Anaerobia:

NITRGENO

UPSTREAM
Medios: - M. Sintticos: quimicamente definidos. - M. Complejos: Origen animal o vegetal como peptonas, extracto de levadura, macerado de maz, extracto de soja. Quimicamente indefinidos y de composicin variable. Componentes: - Macronutrientes: Fuentes de C, N, S, P, K y Mg, en g/l. - Micronutrientes: Elementos traza. Sales de Fe, Mn, Ca, Zn, Co, en mg/l. - Factores de Crecimiento:vitaminas, aminocidos, acidos grasos, etc.

Medio de Cultivo:
Conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos.
Diversidad metablica Diversidad de medios

Esterilizacion: autoclave o filtracin (termolbiles)

Constituyentes:
- Agar: Ag solidificante. Polisacrido de algas marinas. Las bacterias no lo degradan. - Azcares: Fuente de C, glucosa, lactosa, sacarosa. - Extractos: Preparados de rganos o tejidos animales o vegetales, extracto de carne, levadura. Preparados con agua y calor - Peptonas:Protenas hidrolizadas, obtenidas por digestion qumica o enzimticas de proteinas animalers o vegetales. - Fluidos: Sangre, plasma o suero. Se aaden a otros medios. - Amortiguadores: Sales para mentener el pH en rangos ptimos. Fosftos de Na y K. - Indicadores de pH: Indicadores acido-base aadidos para detectar el cambiuo de pH. - Agentes Reductores: Sustancias para crear condiciones apropiadas. Cistena, tioglicolato. - Agentes Selectivos: A determinadas concentraciones seleccionan microorganismos. Cristal violeta, sales biliares.

Tipos de medios de cultivo.

Por su consistencia: - Slidos: Contienen agente gelificante (agar). Petri o Slant - Lquidos: Caldos. Se preparan en tubos y matraces.
Por su composicin: - Medios Generales: Desarrollo de gran variedad de MO. - Medios de Enriquecimiento: Favorecen el desarrollo de determinado grupo de MO. - Medios Selectivos: Crecimiento de un tipo de MO e inhiben el desarrollo de los dems. - Medios Diferenciales: nfasis en alguna propiedad que un determinado MO posee.

Diseo del Medio

Elegir los componentes necesarios para lograr el crecimiento y formacin de productos en el proceso. Conocer los proceso y operaciones previos y conocer los mecanismos bioqumicos que regulan la formacin de productos. Requerimientos Nutricionales: Tipo de metabolismo celular: Auttrofos: Algas, bacterias que obtienen C del CO2 Hetertrofos: Requieren compuestos orgnicos como fuente de C. Condiciones de Cultivo: Aerobio: oxigeno como aceptor de electrones Anaerobio: N, SO4, NO3 como aceptor de electrones.

Fuentes de nitrgeno: Inorgnica u Orgnica, sntesis de protenas, cidos nucleicos, pared celular Macronutrientes: P y S en forma de PO4 y SO4, para formar ADN, ARN, , aminocidos azufrados. K y Mg, ligados al RNA. K acta como coenzima y Mg es estabilizador de organelos y es cofactor. Micronutrientes: - Esenciales: Ca, Mn, Fe, Cop, Cu, Zn. - Poco esenciales: Na, Al, Si, Cl, Cr, Ni, Se, Mo Difciles de cuantificar y sus requerimientos aumentan cuando el cultivo se somete a stress. Factores de crecimiento: Aminocidos, tiamina, riboflavina, niacina; la mayora son constituyentes de coenzimas

Disponibilidad de los Componentes: Componentes susceptibles de ser usados por la clula. Concentracin de iones metlicos modificada por quelacin, para controlar el fenmenos se usa agentes quelantes, EDTA. Se debe tener en cuenta la naturaleza de los compuestos orgnicos que pueden actuar como ligandos y sobre todo del ion metlico considerado, es necesario controlar su concentracin. Materias Primas: Se debe considerar costos, disponibilidad y estabilidad en su composicin qumica. Las materias primas fundamentales son las fuentes de C y N.

Formulacin.
Se refiere a los aspectos cuantitativos de los medios. Tener una aproximacin a la composicin de la biomasa del microorganismo. Una composicin elemental en peso seco es: Carbono: Nitrgeno: Fsforo: Azufre: Mg: 46 48% 7-12 13 0.5 1 0.5 1

COMPONENTE

ELEMENTO/FUNCION

MASA. gr

Glucosa NH4Cl KH2PO4

C, energa N P+K

22.7 4.37 1.13

MgSO4.7H2O CaCl2.2H2O FeSO4.7H2O MnS.4H2O ZnSO4.7H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O EDTA Agua destilada

S + Mg Ca Fe Mn Zn Cu Co Quelante

0.232 0.011 0.007 0.002 0.002 0.0004 0.0004 0.394 1 ml

Composicin de medio mnimo para Klebsiella aerogens

CINETICA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

5 4

Log X
2

Microbiologa Industrial

Parte de la Microbiologa que se ocupa de las aplicaciones industriales de los microorganismos.

Tambin son los procesos industriales catalticos basados en el uso de microorganismos.

Generalidades de la Fermentacin.
Fermentacin: Proceso realizado en un fermentador o biorreactor, mediante el cual determinados sustratos que componen el medio de cultivo son transformados por accin microbiana en metabolitos y biomasa.
Microorganismo Medio Aumenta concentracin. Se va modificando

Resultado.. Formacin de de nuevos productos como consecuencia del metabolismo.

Influencia de los Efectores

Comportamiento de microorganismo es el resultado de la interaccin entre el MO y el medio ambiente por los efectores: internos y externos.
Efectores Internos --------- Dotacin gentica Efectores Externos -------- Expresin fenotpica

METABOLITOS PRIMARIOS: molculas de bajo peso

molecular que intervienen, como productos finales o intermediarios, en las distintas rutas metablicas. Los ms importantes desde el punto de vista industrial son los aminocidos, nucletidos, vitaminas, cidos orgnicos y alcoholes.

METABOLITOS SECUNDARIOS: molculas sintetizadas por determinados microorganismos, normalmente en una fase tarda de su ciclo de crecimiento. antibiticos, ciertas toxinas (micotoxinas), alcaloides (cido lisrgico), factores de crecimiento vegetal (giberelinas) y pigmentos.

Efectores Internos
(Dotacin gentica)

Efectores Qumicos (nutrientes)

Expresin

Producto
(metabolitos)

Efectores Fsicos (temperatura, agitacin, viscosidad, etc.)

Seleccin, Mantenimiento y Mejoramiento de MO.

SELECCIN: - Cepa genticamente estable. - Velocidad de crecimiento alta. - Cepa libre de contaminantes - Requerimientos nutricionales bajos. - Fcil conservacin por periodos largos de tiempo - Fermentacin completa en corto tiempo. - Alto rendimiento de producto y de fcil extraccin

AISLAMIENTO:
a) A. Directo: El medio debe permitir una expresin mxima del material gentico. Por ejm. Aislamiento en funcin de halos de inhibicin Enriquecimiento del cultivo: Consiste en incrementar en una poblacin mixta el nmero de organismos de inters. Realizar subcultivos y evaluar la velocidad especfica de crecimiento ()

b)

Porque y para que conservar los cultivos?

El cultivo (cepa microbiana o viral, lnea celular, etc), es el elemento vital de la investigacin o produccin industrial Conservar implica mantener la viabilidad y propiedades genticas del cultivo durante un determinado perodo de tiempo Consecuencias de una adecuada conservacin: estabilidad de las cepas de produccin, pureza, reproductibilidad de la investigacin. Reposicin

Conservacin de cultivos

Espacio fsico e infraestrutura Personal capacitado Recursos econmicos

Inversin

Potencial limitacin de los mtodos para conservar

Dao econmico Prdida del cultivo

Potenciales ventajas del depsito de material biolgico

Patente
Conveniencia centralizado logstica del almacenamiento

Seguridad de abastecimiento del material ante prdidas eventuales

Adecuada informacin de los riesgos ambientales y para la salud Seguridad en la conservacin

Esquema del proceso de conservacin y sus etapas crticas

Aislamiento primario

Microorganismo viable (gentica/fenotpo)

Reactivacin

cultivo

Almacenamiento

Tipo de propgulo Estado fisiolgico

Proceso de conservacin

Mtodos de conservacin de cultivos

1. con crecimiento
transferencia seriada

2. con metabolismo limitado

agua destilada bajo aceite mineral (control por O2)

3. con metabolismo detenido

3.1 Congelamiento (crioconservacin) 3.2 Deshidratacin
L-drying: secado desde la fase lquida,
silicagel, celulosa (papel), suelo, perlas de porcelana

Liofilizacin (freeze-drying)

CRIOCONSERVACIN
Crioconservacin es la conservacin de material biolgico a muy bajas temperaturas Rango -20 C a -196 C (nitrgeno lquido) El nitrgeno lquido es la temperatura prctica mas baja disponible. A la temperatura de equilibrio, la difusin molecular es extremadamente lenta y la probablilidad de que ocurran reacciones qumicas es prcticamente nula

CRIOINJURIA
El proceso de congelamiento y descongelamiento produce cambios en las cluas que pueden resultar letales Los procesos perjudiciales son: formacin de cristales de hielo, exosmsis, aumento de la solubilidad de gases, deshidratacin, aumento de la concentracin de osmolitos,

disminucin del pH, alteraciones de la actividad enzimtica,

acumulacin de metabolitos, incremento del contacto entre molculas, ruptura de puentes de H, distorsin de macromolculas, solidificacin, prdidad de la integridad de membranas, ruptura de emulsiones, etc La formacin de hielo intra o extracelular es quizs el evento mas crtico de la crioinjuria.

INJURIA POR CONGELAMIENTO

Congelamiento lento (efecto soluto) exosmsis
Hielo extracelular

shrinkage (efecto soluto)

Congelamiento rpido ( efecto hielo )

Hielo intracelular

Dao mecnico

CRIOPROTECCIN
Control de la velocidad de enfriamiento
Balance ptimo entre el efecto soluto y la formacin e hielo. En la prctica es aceptable 10 C/min. El descongelamiento debe ser lo mas rpido posible

Incorporacin de crioprotectores (CPs)

CPs que permean la pared y membrana celular

Me2SO ( Tp < 30 min), Glicerol, Metanol

Cps que permean la pared pero no la membrana mono y disacridos, aminocidos, polmeros de bajo PM(PEG 600-1000) Cps no permeantes Polmeros de alto PM: protenas, polisacridos, PVP

El tipo de proteccin que ejerce el CPs depende de su permeabilidad

Todos los CPs son altamente hidroflicos

CPs que permean totalmente ligan agua intracelular y reducen el efecto soluto
CPs semipermeables forman entre la pared y la membrana celular una capa que proteje la clula del dao mecnico CPs no permeables se adsorben en la superficie celular incrementando la viscosidad local lo cual manteniendo el hielo en forma amorfa evitando dao mecnico

Empleo de CPs en criopreservacin

Frecuencia de uso de CPs
Virus: Me2SO, Suero sanguneo, Sacarosa Glicerol Bacterias: Me2SO, Suero sanguneo, Sacarosa, Glicerol, leche descremada Hongos: Me2SO, Glicerol Algas: Me2SO, metanol, Glicerol, PVP Protozoarios: Me2SO, Suero sanguneo, Glicerol, Sangre desfibrinada

Rango de concentraciones de CPs

Me2SO: 1-32 % (media 10 %) Glicerol: 5-50 % Sacarosa: 1-68 % (media 10 %) Metanol: 2-10 % (media 5 %)

Tiempos de contacto CPs-clula:

Glicerol, Metanol, Me2SO : 10-60 min a 0-10C

CONSERVACIN POR DESHIDRATACIN

Este mtodo implica la remocin de agua de las clulas (humedad final tpica: 0.06-5.0 % de agua). La deshidratacin puede llevarse a cabo desde la fase lquida (Ldrying) o por sublimacin desde el estado congelado (liofilizacin) Las prdida de viabilidad durante la deshidratacin es principalmente atribuida a alteraciones de la membrana celular. Las clulas deshidratadas son susceptibles al deterioro causado por oxgeno El deterioro de las clulas durante la deshidratacin puede ser controlado por el agregado de aditivos. Algunos forman una matriz amorfa que dispersa los componentes txicos que la clula puede liberar durante el secado. Otro protectores interactan con las membranas, estabilizando su estructura en el estado anhidro Los aditivos mas comunes son: leche descremada, aminocidos (glutamato) y azcares (sacarosa, trealosa)

Principios de la liofilizacin
muestra + protectores en ampollas
vaco 30-60 militorrs

manifold
-70 C - 5 C

trampa de agua congelamiento etilenglicol + hielo seco (- 40 C) etanol + hielo seco (-70 C)

Bomba de vaco de aceite

La muestra colocada en una ampolla estril con un plug de algodn, se congela entre - 40 C y -70 C. Una vez colocada la muestra en el manifold del equipo se comienza con el vaco y se retira el enfriamiento. La temperatuyra sube hasta -5 C. A esta temperatura y con un vaco entre 30 y 60 militorrs, el secado es rpido. El tiempo es variable y depende del volumen de muestra. Al finalizar el proceso se sella la ampolla al vaco

L-Drying
Muestra
Impregnacin en soporte
perlas de porcelana, papel de filtro, suelo

Secado sobre silicagel

Preservacin en suelo (sand loam) para microorganismos filamentosos

Secar suelo 6 hs a 150 C Tamizar suelo seco mesh 10 y 20. Conservar en recipiente tapados Colocar en tubos Pyrex de 13 x 100 mm suelo seco tamizado hasta una altura de 20 mm y tapar con plug de algodn recubierto de gasa Autoclavar 60 min 3 das consecutivos y secar Incorporar 1 ml de suspensin de esporos en agua ( no emplear caldo de cultivo) Secar a temp ambiente (24 C) un mes Conservar en fro

Consideraciones para la preservacin de cultivos

Debe definirse claramente el medio de cultivo y el tipo de agua (destilada, deionizada, corriente) empleados.

Tener en cuenta el tipo de cultivo (agarizado, lquido, slido), el estado fisiolgico de las clulas al momento de la cosecha (cultivos lquidos cosechados en fase estacionaria suelen ser mas resistentes que los de fase logartmica), si se emplean clulas con medio lavadas. Determinar si el agente protector es txico.
Definir condiciones de proceso: concentracin de clulas, tiempo de secado, agregado de protectores En procesos industriales la viabilidad no es lo nico importante. La cepa debe mantener sus propiedades productivas. Desarrollar un test de produccin o bioensayo Durante la recuperacin de la especie conservada deben determinarse: viabilidad, pureza, morfologa, formacin de producto, rasgos recombinates (plsmidos, resistencia a antibiticos, etc).

Comparacin de algunos mtodos de preservacin

Mtodo Almacenamient o (aos)
0.5-2

Ventajas
Simple, bajo costo, equipamiento requerido bajo bajo costo, equipamiento requerido bajo Equipamiento requerido bajo, buena estabilidad gentica Preparacin rpida, buena estabilidad gentica Bajo riesgo de contaminacin, buena a regular estabilidad gentica Simple , bajo costo, bajo equipamiento requerido Simple , bajo costo, bajo equipamiento requerido

Desventajas
Secado del agar, baja estabilidad gentica, riesgo contaminacin trabajo moderado, baja estabilidad gentica Requiere protectores, Alto costo de freezer (-80C). Clulas pueden ser sensibles al O2 Suministro regular de N lquido Alto costo de equipamiento

Agar

Aceite mineral

2-20

Congelamiento

4-5

N lquido

infinito

Liofilizacin

15-20

Agua L-drying

1-5 3-10

Estabilidad gentica regular estabilidad gentica?

 BIBLIOGRAFIA:

Texto Base:
CRUEGER, Wulf. CRUEGER, Anneliese. Manual de Microbiologa Industrial. Editorial Acribia. Tercera Edicin. Zaragoza, 2000. Textos Complementarios: PRESCOTT, Lansign. HARLEY,John. KLEIN, Donald. Microbiologa. McGraw-Hill. Cuarta Edicin.Madrid, 1999. RHODES,Alan. FLETCHER, Derek. Principios de Microbiologa Industrial. Editorial Acribia. Zaragoza 1994. SCRAGG, Alan. Biotecnologa para Ingenieros. Editorial Limusa. Primera Edicin. Mxico, 1997. www.ncbi.nlm.nih.gov (NCBI Data Base) www.ejbiotechnology.info (Electronic Journal of Biotechnology)

Que es.
Parte de la Microbiologa que se ocupa de las aplicaciones industriales de los microorganismos (bienes y/o servicios). Son aquellos procesos industriales catalticos basados en el uso de microorganismos. Microbiologa industrial Biotecnologa Industrial

AREA
Salud
Alimentos Produccin Vegetal Produccin Animal

MICROORGANISMOS

PRODUCTOS

Clostridium, Vacunas, vitaminas, Penicillium, Bacillus.. penicilina - antibiticos, . Saccharomyces, Lactobacillus, Penicillium Rhizobium, Giberella Candida, Aspergillus, Salmonella. Levadura, yoghurt, vino, cerveza, vinagre. Bioinsecticidas, cido giberlico, inoculantes Protena unicelular, vacunas

Insumos Industriales

Xanthomonas, Saccharomyces, Clostridium

Acidithiobacillus, Pseudomonas.. Aerobios sp, anaerobios sp

Etanol, enzimas, acid. Orgnicos, biopolmeros, acetona.

Biolixiviacin, biooxidacin Biorremediacin de efluentes

Minera Servicios

Libro del Gnesis (9: 20,21): No se dedic a la labranza y plant una via. Bebi del vino, se embriag 6000 a.C.: Los sumerios y babilonios usaban levaduras para fabricar cerveza. 4000 a.C.: Los egipcios descubrieron la manera de fermentar pan con levadura.

Siglo XIV : Destilacin de bebidas alcohlicas. Uso de bacterias de cido actico para fabricar vinagre, de bacterias de cido lctico para conservar la leche (yoghurt, kefir). Siglo XVII: Anthony von Leeuwenhoek (16321723) descubre el mundo microbiano con sus microscopios primitivos. Siglo XIX: El desarrollo tcnico de los microscopios permite demostrar el origen de los microbios y vencer la creencia de la generacin espontnea.

Observaciones y recetas sobre la generacin espontnea...

Ambroise Par (1517-1590), el ms clebre cirujano de su siglo, escribe: Hallndome en una via de mi propiedad, prxima al pueblo de Meudon, hice romper una enorme cantidad de grandes piedras slidas. Dentro de una de ellas se encontr un grueso sapo vivo, sin que hubiera en la piedra la menor apariencia de abertura

Me maravill el hecho de que este animal hubiese podido nacer, crecer y vivir all. Pero el cantero me dijo que no haba por qu asombrarse, pues varias veces haba hallado animales de sta y de otras clases en lo ms recndito de las piedras, sin que existiese el menor indicio de una abertura. Se puede explicar as el nacimiento y la vida de estos animales: son engendrados a partir de alguna sustancia hmeda de las piedras, cuya humedad, al entrar en putrefaccin, produce tales seres.

Van Helmont (1577-1644), el ms grande fisilogo de la poca, sugiere lo siguientes para obtener ratones: un vaso lleno de trigo se cubre con una camisa sucia, preferentemente de mujer. Un fermento originado en la camisa y transformado por el olor de los granos, convierte el trigo mismo en ratones. Esta metamorfosis dura cerca de veintin das, o sea el tiempo de gestacin de ratn y nuestro naturalista se asombre de su notable rapidez

Ello, nos dice, es tanto ms admirable cuanto que los ratones originados por el trigo y la camisa no son pequeos ni lactantes, ni minsculos, ni deformes, sino muy bien formados y pueden Francesco Redi saltar. (1626-1697): Mdico italiano demostr que los gusanos de la carne son larvas de mosca y que no aparecen si la carne se guarda bien Lzaro Spallanzani (1729-1799): Naturalista tapada.
italiano, demostr que los microbios son transportados por el aire; los mismos no invaden los frascos cerrados hermticamente.

Nicolas-Francois Appert (1750-1841): Desarrolla los primeros procedimientos de enlatado.

Louis Pasteur (1822-1895): Sent las bases de la futura industria biotecnolgica al demostrar que todos los procesos de fermentacin eran el resultado de la actividad microbiana. Edward Buchner (1860-1917): Descubre, dentro de las clulas microbianas, las sustancias vitales responsables de todas las transformaciones qumicas: las enzimas.

Hasta la primera guerra mundial, apenas progres la idea de utilizar bacterias y levaduras para fabricar otra cosa que no fuera alcohol.
Sin embargo, las restricciones impuestas durante el conflicto anunciaron lo que puede

Hasta la primera guerra mundial, apenas progres la idea de utilizar bacterias y levaduras para fabricar otra cosa que no fuera alcohol.

Sin embargo, las restricciones impuestas durante el conflicto anunciaron lo que puede llamarse como segunda era biotecnolgica.

La Guerra Mundial (1914-1918) supuso demandas biotecnolgicas: Proceso Neuberg para producir glicerol (para nitroglicerina) mediante la fermentacin dirigida de Saccharomyces cerevisiae. Agregando lcali y bisulfito de sodio al depsito de fermentacin alcohlica se fomentaba la produccin de glicerol. Proceso Weizmann, usando Clostridium acetobutylicum, para la produccin de disolventes como la acetona (fabricacin de cordita).

Los descubrimientos de Pasteur, Robert Koch (1843-1910) y Alexander Fleming (1928) revolucionaron el tratamiento de las enfermedades infecciosas con el descubrimiento de los antibiticos. Durante la Segunda Guerra Mundial comienza la tercera era biotecnolgica, por la necesidad de contar con ciertos medicamentos para que las vctimas no murieran de sepsis bacteriana.

Cuarta era biotecnolgica comienza a principios de la dcada de 1970, con el advenimiento de la Ingeniera Gentica. El descubrimiento de los sistemas de restriccin y modificacin en bacterias y la aplicacin de las endonucleasas. Los trabajos de Milstein y Kohler sobre la formacin de hibridomas con la posterior utilizacin para la produccin de anticuerpos monoclonales (1975).

Un hito ocurri en 1982 cuando la compaa Eli Lilly consigui la aprobacin de la (F.D.A) Food and Drug Administration de los Estados Unidos de Norteamrica para la utilizacin de insulina humana clonada y producida en Escherichia coli. A esto siguieron los interferones, hormonas de crecimiento humana y bovina, el antgeno de superficie del virus de la hepatitis B, etc.

El desarrollo de un proceso de produccin a gran escala (BIOPROCESOS), en forma exitosa, es el resultado de acelerar e intensificar un concepto original, generalmente un procedimiento de laboratorio o a pequea escala.

La Ingeniera Gentica actualmente permite aislar una cierta caracterstica (contenida en uno o varios genes), y transferirla a otro organismo. Esto es lo que se conoce como biotecnologa moderna. La biotecnologa mdica permite el cultivo de tejidos in vitro y su implante en sustitucin de tejidos daados. La biotecnologa industrial permite el mejoramiento de tcnicas de fermentacin para optimizar la produccin de antibiticos, enzimas, cidos orgnicos, alimentos, nuevos materiales. La biotecnologa agrcola permite obtener plantas tolerantes a herbicidas, resistentes a insectos y enfermedades, as como plantas que pueden sobrevivir mejor a suelos difciles (secos o salinos). La biotecnologa ambiental permite adaptar especies microbianas o vegetales a hbitats contaminadas para permitir la degradacin de metales pesados, hidrocarburos, polmeros, recuperacin de metales. La biotecnologa animal y vegetal permite la generacin de micro fbricas de sustancias de inters como productos metablicos, hormonas, enzimas, pigmentos.

El desarrollo Microbiolgico / Biotecnolgico se centra en tres aspectos fundamentales:

Desarrollo de los organismos.

Desarrollo de medios de cultivo.

Ingeniera de la fermentacin.