Pruebas Inmunolgicas

8HM2

Aguilar Medina Cesar Augusto Arteaga Lpez Ma. Elizabeth Olvera Flores Viridiana Prez Mndez Alexis Leopoldo

Mtodos de laboratorio que usan anticuerpos

La exquisita especificidad de los anticuerpos por antgenos particulares convierte a los anticuerpos en reactivos muy valiosos para detectar, purificar y cuantificar antgenos. Pueden utilizarse tcnicas basadas en anticuerpos para estudiar casi cualquier tipo de molcula en solucin o celular.

Cuantificacin del antgeno por inmunoanlisis

Todos los mtodos inmunoqumicos modernos de cuantificacin se basa en disponer de un antgeno o anticuerpo puro cuya cantidad pueda medirse mediante una molcula indicadora (o marca)

RIA

Radioinmunoanlisis

Puede cuantificarse con instrumentos que detecten fenmenos de desintegracin radioactiva.

ELISA

Enzimoinmunoensayo de adsorcin

Se pueden cuantificar antgenos o al anticuerpo cuando se unen de forma covalente a una enzima determinando con un espectrofotmetro la intensidad con la que la enzima convierte un sustrato transparente en un producto coloreado

Identificacin y purificacin de protenas

Los anticuerpos pueden utilizarse para purificar protenas a partir de una solucin o para identificarlas y caracterizarlas La inmunotransferencia: es una tcnica muy difundida para determinar la presencia de una protena en una muestra biolgica y su tamao

Inmunoprecipitacin

Cromatografa por inmunoafinidad

Es un mtodo de purificacin que se apoya en anticuerpos unidos a un soporte insoluble con el fin de purificar antgenos de una solucin

Es una tcnica en la que se usa un anticuerpo especifico frente a un antgeno protenico en una mezcla de protenas para identificar este antgeno especfico

Western blontting
Se utiliza para identificar y determinar la cantidad relativa y la masa molecular de una protena dentro de una mezcla de protenas u otras molculas Habitualmente se utiliza una variacin de la tcnica de inmunotransferencia para detectar la presencia de anticuerpos anti-VIH en el suero del paciente
Mediante SDS-PAGE se separa una mezcla definida de protenas del VIH, que se transfiere a una membrana, y se incuba con diluciones
Se examina el resultado con un 2do anticuerpo marcado vs las Ig humanas, que sirve para detectar la presencia de anticuerpos especficos frente a VIH en el suero y unidos a las protenas del virus

Southern ADN Northern ARN

Western Transferencia de protenas

Cartometra de flujo y clasificacin celular activada por fluorescencia

El citmetro de flujo es un instrumento especializado capaz de detectar la fluorescencia procedente de clulas sueltas en suspensin y determinar as el nm. de ellas que expresan la molcula a la que se encuentra unida la sonda fluorescente.
Sondas fluorescentes, como Anexina V, sirve para determinar cel. en apoptosis

Puede utilizarse para distinguir distintos tipos celulares.

Inmunofluorescencia

El anticuerpo se marcaba con un colorante fluorescente y se le dejaba unirse a una monocapa de clulas o un corte de del tejido congelado se tea y se examina con un microscopio para localizar el anticuerpo

Medida de las interacciones entre el antgeno y el anticuerpo

La utilidad de un anticuerpo monoclonal como reactivo experimental o teraputico depende de este aspecto. La afinidad de un anticuerpo por su antgeno puede medirse directamente en el caso de los antgenos pequeos

SOUTHERN BLOT

 Debido a que la transferencia del ADN del gel a la membrana se produce por capilaridad, con el mismo principio utilizado por aos para limpiar manchas con papel secante, el proceso se conoce en ingls como blotting; Southern propuso utilizar el trmino blot (secado) o blotting para referirse a esta tcnica y actualmente se conoce como Southern blot

Principio

Para llevar a cabo hibridaciones de este tipo, se asla el ADN de un tejido o lnea celular, luego se purifica, y se digiere con enzimas de restriccin especficas.

Los fragmentos generados se separan mediante electroforesis y despus son transferidos a la membrana que sirve de soporte (gel de agarosa).

Este proceso se lleva a cabo colocando el gel de agarosa sobre papel filtro previamente remojado en una solucin llamada de transferencia (solucin salina concentrada).

Se sita la membrana sobre el gel y encima de esta una pila de papel filtro seca

Por capilaridad la solucin de transferencia es atrada a la pila de papel filtro, arrastrando consigo al ADN hacia la membrana

El ADN queda inmovilizado conservando la misma posicin relativa que ocupaba en el gel.

 El ADN puede ser hibridado en la membrana con una sonda marcada La hibridacin se refiere al apareamiento especfico que ocurre entre cadenas de cidos nucleicos con secuencias complementarias

fragmentos cortos de ADN o ARN sintetizados in vitro y que se marcan con sustancias radiactivas fluorescentes o de otro tipo a fin de hacer posible su posterior deteccin y de esta manera la identificacin de la secuencia de ADN de inters

Las sondas no son ms que

Esta tcnica se ha empleado para el diagnstico y caracterizacin de diversas patologas:

Inmunodeficiencias La distrofia muscular de Duchenne La hipoplasia adrenal congnita La deficiencia de glicerol-quinasa La distrofia miotnica severa
En anlisis de mutaciones de genes en clulas B de leucemia linfoblstica crnica

NORTHERN BLOT

Es una tcnica de deteccin de molculas de cido ribonucleico (ARN) de una secuencia dada dentro de una mezcla compleja .

Procedimiento northern blot

PROCEDIMIENTO
El procedimiento general comienza con la extraccin del RNA total de una muestra de tejido homogenizado. Las muestras de ARN son entonces separadas por electroforesis en gel. Dada la fragilidad de los geles y la incapacidad de las sondas para penetrar en la matriz, las muestras de RNA, separadas por tamao tras la electroforesis, sern transferidas a una membrana de Nailon por medio de capilaridad o un sistema de transferencia al vaco. Los sistemas de capilaridad inica se utilizan para transferir el ARN desde un gel de electroforesis a una membrana de Northern blot. Despus del marcaje de la sonda, sta se hibrida con el RNA en la membrana. Finalmente, la membrana debe de lavarse para asegurar que la sonda se ha unido de forma especfica y para evitar ruido de fondo en las seales emitidas por la misma.

Northern blot : transferencia por capilaridad

APLICACIONES
El northern Blot permite observar un patrn particular de expresin gentica entre tejidos, rganos, estadios del desarrollo, niveles de estrs ambiental, infecciones causadas determinar por patgenos y durante EJEMPLO: cantidades el curso de del tratamiento de las relativas ARNm de genes de mismas.

citocinas de una poblacin de LcT cooperadores

Esta tcnica se ha utilizado para mostrar la sobreexpresin de oncogenes y la desregulacin de genes supresores tumorales en clulas cancerosas cuando son comparadas con tejidos normales.

Los patrones de expresin obtenidos nos ayudan a conocer las funciones de los genes. Desde que el RNA se separ por su tamao, las sondas contra el mismo pueden darnos una idea de su tamao, sugerir ayuste alternativo, o motivos repetidos en la secuencia. La variacin en el tamao del producto de un gen puede adems indicarnos delecciones o errores en el proceso de transcripcin. Alterando la sonda podemos conocer la secuencia e incluso determinar que regin del RNA ha sido deleccionada.

REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Tcnica de PCR
Desarrollada por el Dr. Kary Mullis en 1983. Es un mtodo para la amplificacin exponencial selectiva de una regin elegida dentro de una molcula de ADN. Permite el copiado in vitro de ADN

Requerimientos de la prueba

Agua libre de nucleasas. Solucin amortiguadora y sales.

Oligonucletidos (primers).
Catin divalente (MgCl2).

Desoxinucletidos (dNTPs).

Enzima (Taq polimerasa).

Pasos de la tcnica de PCR

Las cadenas de ADN son separadas en dos hebras sencillas.

Los primers se unen por complementariedad a las cadenas molde.

La enzima Taq polimerasa, adiciona los nucletidos correspondientes en las nuevas cadenas sintetizadas por complementariedad de pares de bases.

Desnaturalizacin
Es el primer paso en la tcnica de PCR, en la cul las cadenas complementarias de ADN son separadas por calentamiento. Los puentes de hidrgeno entre las dos hebras de ADN son rotos y estas se separan.

Alineacin

Proceso en el que dos secuencias de ADN (primers y cadena molde) forman puentes de hidrgeno. La alineacin se lleva a cabo por enfriamiento de la mezcla de reaccin, despus del paso de desnaturalizacin segn los primers empleados.

5
3

3
5

Alineacin de los primers

5 3
5
3 3 5

3 5

Elongacin del ADN

La Taq polimerasa se une al templado de ADN y comienza a adicionar los nucletidos que son complementarios a la cadena molde.

La temperatura ptima de accin de la enzima Taq polimerasa son 72C.

Ciclo de replicacin

Alineacin.

Desnaturalizacin.

Elongacin.

Anlisis del producto amplificado por PCR convencional

Despus de la amplificacin al obtener el ADN de inters, este puede ser colocado en un gel de agarosa para realizar el corrimiento electrofortico, teirlo y observarlo con luz ultravioleta (UV).
La electroforesis es el movimiento de partculas cargadas en un campo elctrico.

Los cidos nucleicos estn cargados de forma negativa debido a su esqueleto de grupos fosfato, por lo que migrarn hacia el polo positivo o nodo.

RATONES TRANSGNICOS Y ANULACIN DE GENES DIANA

 Mtodos importantes para estudiar los efectos funcionales

in vivo

Expresan

en exceso un gen determinado en un tejido dado eliminar la funcin del mismo (knock-out)
Maduracin, activacin y tolerancia de LT

Carecen o se anula un gen para

 Para crearlos se introducen secuencias de ADN en el proncleo de vulos ya fecundados y se implantan en los oviductos de hembras pseudogestantes
+ o 25%de ratones nacidos transgnicos

 El mayor valor de la tecnologa transgnica es que puede usarse para expresar genes en tejidos especficos
Un mtodo para obtener modelos animales de un trastorno monognico consiste en la creacin de ratones que lleven genes inactivados mediante su mutacin o prdidas dirigidas de un gen

 Tcnica de recombinacin homologa

Si se introduce gen exgeno en una clula, la integracin en el genoma se hace de forma aleatoria Si se introduce uno homologo se recombinar de forma preferente

 Para seleccionar las clulas recombinadas se usa un a estrategia con frmacos

Fragmento del ADN homlogo

Vector (gen de resistencia a la Neomicina)

Gen de timidina cinasa (tk) vrica

El vector se introduce a la clula Y se cultiva en un ambiente con Neomicina y ganciclovir

El gen tk se pierda cada vez que suceda la recombinacin homologa

El gen de resistencia a la Neomicina se agregue siempre al ADN cromosmico

 Las clulas en las que el gen queda integrado al azar sern resistentes a Neomicina pero no al ganciclovir

Las clulas en las que haya ocurrido una recombinacin homloga sern resistentes a ambos frmacos

 La recombinacin homologa tambin se puede usar para sustituir una secuencia gnica normal por otra
Creando cepas de ratones (knock-out)
Son portadores de un transgn en un lugar determinado no de forma aleatoria

 Se emplea cuando se quiere que la expresin del transgn sea regulada por determinadas secuencias de ADN endgeno

Es un examen que detecta algunas infecciones diferentes presentes en un recin nacido TORCH TORCHeS
En el embarazo presenta una promoinfeccin, una reactivacin, reinfeccin vara de un agente etiolgico

Transmisin va transplacentara, en el parto o por leche materna.

Depende Agente causal y SDG al momento de la infeccin

Primoinfeccin mujer embarazada Primoinfeccin mujer embarazada

Detectar inmunoglobulina

IgM especfica inmunofluorescencia indirecta (IFI)

aparece 3 - 5 das despus de la infeccin

sensibilidad de 25 %

se mantiene positiva semanas o meses

utiliza toxoplasmas muertos, fijados en portaobjetos. Permite detectar diferentes clases de anticuerpos

ELISA con sensibilidad de 75%

Determinar IgGaltos alcanzan los niveles ms

especfica

deteccin de inmunoglobulinas

alcanzan los niveles ms altos

2 meses despus de la infeccin y permanece presente por aos

Diagnostico serolgico, ID la presencia de Ac frente al virus

ELISA: + sensibilidad, especificidad y fcil automatizacin: detecta IgG e IgM.

Tcnicas inhibicin de hemaglutinacion (IH) Fijacin del complemento (FC)

Dx por serologa Px con primo infeccin

deteccin de la IgM especfica cultivo celular de orina, saliva, secrecin nasofaringea, leucocitos

se mantiene + por 2 a 3 meses

La infeccin fetal

muestra de lquido amnitico aislamiento viral en cultivo celular sensibilidad del 80%

 Deteccin del ADN viral en lquido amnitico o sangre fetal (PCR) mtodos invasivos con riesgo fetal

PI 3 - 12 semanas

Aislamiento viral en cultivos celulares o secreciones infectadas

La inmunofluorescencia aplicada a los cultivos celulares

La presencia de clulas multinucleadas

+ rpida y hace la diferenciacin entre el tipo 1 y el 2

Deteccin de antgeno vrico

en cultivos (Shell vial)

Observacin de las partculas vricas por microscopia, electrnica

Actualmente la deteccin del ADN vrico mediante amplificacin por (PCR)

Examen directo Del exudado de la lesin -campo obscuro y/o fluorescencia directa (DFA-TP)sensibilidad de esta prueba es del 75-80%.

Diagnstico indirecto -serolgicoEstos marcadores necesitan, aproximadamente, de unos 14 a 20 das para hacerse reactivos

V.D.R.L. (Venereal Research Disease Laboratory). Puede emplearse con suero; es un antgeno no particulado. La reaccin que se obtiene con la muestra positiva es de floculacin. Lectura microscpica.

E.L.I.S.A. Se emplea con suero. Utiliza en la fase slida antgenos del tipo VDRL.

se basan en antgenos compuestos de soluciones alcohlicas

Miden IgG e IgM frente a estas sustancias que son producidas en los tejidos daados por el treponema Puesto que no miden anticuerpos especficos frente a T. pallidum su positividad no asegura la enfermedad sifiltica.