HIBRIDACIN GENMICA COMPARADA (CGH)

Diana Abella Natalia Bayona Juan Miguel Lara Luisa Rodrguez Juan David Sierra Natalia Trespalacios Mara Camila Vlez Mara Andrea Zambrano

NDICE
1.

2.
3. 4. 5.

Qu es? Cmo se realiza? Tipos Utilidades Limitaciones

QU ES?
La hibridacin genmica comparada (HGC) es una tcnica de citogentica molecular que permite identificar ganancias y prdidas del genoma mediante la hibridacin competitiva de ADN normal y anormal frente a cromosomas normales.

CMO SE HACE? HIBRIDACIN

1.

2.
3.

4.

Hibridacin de un ADN control o de referencia y otro ADN muestra a estudiar. La hlice de doble cadena (ADN) es separada mediante un proceso fsico (calor) o qumico (con una base fuerte). Esto rompe los puentes de hidrgeno que mantienen unidas las dos hebras del ADN. Las dos hebras complementarias se separan, el ADN se desnaturaliza. Una muestra de cadenas simples (o desnaturalizadas) se mezcla con otra muestra de cadenas simples. La muestra combinada se enfra lentamente, las molculas sencillas se van emparejando por las zonas complementarias (ms estables termodinmicamente) y se va formando una nueva molcula hibridada.

CMO SE HACE?
Hibridacin de un ADN control o de referencia y otro ADN muestra a estudiar. Cada uno de estos se marca con una sonda fluorescente para poder identificar mediante la comparacin de ambos:

Deleciones Duplicaciones genticas

CMO SE HACE?

El marcaje para cada muestra es diferente para poder diferenciarlas o compararlas: ADN-M o muestra: usualmente se marca con una sonda fluorescente, Cy3, que reporta color verde. Su longitud de onda de absorcin es de 532 nm y de excitacin es de 550-600 nm. ADN-C o control: usualmente se marca con una sonda fluorescente, Cy5, que reporta color rojo. Su longitud de onda de absorcin es de 635 nm y de excitacin es de 655-695 nm.

CMO SE HACE?
Se excitan a diferentes longitudes de onda y se comparan los resultados obtenidos para cada fluorocromo. Variaciones se miden bien mediante:

Microscopio de fluorescencia. Software especfico que muestra los resultados en una escala logartmica (para arrays de CGH).

La hibridacin genmica comparativa produce un mapa del nmero de copias de secuencias de ADN como una funcin de la localizacin cromosmica en todo el genoma completo. El ADN muestra y el ADN de referencia, cada uno marcado diferencialmente, se hibridan simultneamente a extensiones de cromosomas normales.
La hibridacin se detecta con dos fluorocromos diferentes. Las regiones de ganancia o prdida de secuencias de ADN, tales como Deleciones, duplicaciones, o amplificaciones, son vistos como los cambios en la relacin de las intensidades de los dos fluorocromos.

HIBRIDACIN GENMICA COMPARADA

CHG en metafase:

Se realiza sobre metafases normales en presencia de un exceso de ADN Cot-1 humano. Previamente, el ADN muestra y el ADN normal han sido marcados con dos fluorocromos diferentes.

HIBRIDACIN GENMICA COMPARADA

Resolucin de 2-20Mb diferenciar pequeas variaciones genticas. 3 muestras de ADN: El ADN de la muestra a estudiar, el cual se marca de verde. El ADN de un control (cariotipo normal), el cual se marca de rojo. Cromosomas en metafase de un cariotipo normal.

 Los

cromosomas en metafase se fijan a un porta y se marcan con DAPI, se vern de color azul bajo el microscopio de fluorescencia. Se mezclan ADN muestra y ADN control en cantidades equimolares. Se hace una hibridacin in situ de esta mezcla a los cromosomas metafsicos previamente fijados y marcados con DAPI: Rojo + verde = Amarillo (normal) Verde (duplicacin) Rojo (delecin)

DAPI
4',6-diamidino-2-phenylindole. Es una cadena fluorescente que se une fuertemente regiones AT en el DNA. Se usa en microscopia fluorescente. pasa intacto por las membranas celulares, se usa en clulas vivas y muertas

2. CGH EN ARRAY (ACGH):

Diferencias: Este tipo de es capaz de detectar variaciones de un menor nmero de kb, con respecto al anterior. No es necesario obtener las muestras en metafase . El procesamiento de los datos obtenidos se realiza por medio de un software.

UTILIDADES

Amplio uso en: Estudios genticos preimplantacionales y prenatales

Estudios del cncer Biotecnologa animal para el estudio de variaciones en el nmero de copias

UTILIDADES

La HGC ha sido la primera tcnica combinada de citogentica e hibridacin in situ fluorescente que ha permitido realizar un anlisis global del genoma. Cncer: hibridacin del ADN del tumor con un ADN normal. (Tumores solidos) Mutaciones desconocidas en retraso mental, autismo y otras. Aplicacin de este mtodo est tendiendo a aumentar sobre FISH y citogentica clsica en diagnostico gentico prenatal y preimplantacionales.

LIMITACIONES

Esta prueba se restringe nicamente a una comparacin cuantitativa. Por lo tanto: Las translocaciones equilibradas e inversiones no se pueden detectar. Solo detecta aneuploidas (duplicaciones o deleciones). No detecta mutaciones puntuales ya que la resolucin no es tan amplia. Para que una prdida o ganancia de material gentico sea detectada, sta debe ser al menos de 5 - 10 Mb de longitud.

Gracias