BIOFISICOQUMICA

UAM-I

INTRODUCCIN
La cromatografa es una tcnica de separacin e identificacin de sustancias contenidas en una mezcla, a travs de la distribucin de las mismas entre dos fases (mvil y estacionaria) y en consecuencia, de una migracin diferencial de ellas en el medio poroso de la fase estacionaria.
Fue descubierta por el botnico ruso, de origen italiano, Mikhail Tswett en 1906, su uso no se generaliz hasta la dcada de 1930. Tswett separ los pigmentos de las plantas, clorofila, vertiendo extracto de hojas verdes en ter de petrleo sobre una columna de carbonato de calcio en el interior de una probeta. A medida que la solucin va filtrndose por la columna, cada componente de la mezcla precipita a diferente velocidad, quedando la columna marcada con bandas horizontales de colores, denominadas cromatogramas.

Guillermo Lpez Cueto, Universidad de Alicante

PRINCIPIOS
La palabra Cromatografa significa Escribir en Colores, cuando fue desarrollada los componentes separados eran colorantes. Se define como una tcnica o mtodo fsico de separacin basado en las diferentes velocidades con que se mueven los solutos disueltos en un disolvente llamado eluente (fase mvil) a travs de un medio estacionario o fijo.

Los componentes a separar se distribuyen entre la fase estacionaria y la fase mvil o fluido que pasa a travs o a lo largo de la fase estacionaria. La separacin se da por el movimiento de la fase mvil en relacin con la estacionaria y de la distribucin de las sustancias entre las dos fases. Las molculas que "prefieren disolverse" en la fase mvil sern eludas ms rpido que las que son solubles en la fase estacionaria y que tienden a quedar retenidas

http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobi oquimica/libros/celular/cromatografia.htm

Los fenmenos presentes en el proceso de retencin y separacin son la adsorcin y la absorcin.

La adsorcin se refiere a la fijacin o retencin de la sustancia entre la superficie de las dos fases; se relaciona con fuerzas qumicas y fsicas que dependen de la naturaleza de la sustancia absorbida, temperatura, naturaleza del absorbente y concentracin.

La absorcin determina la retencin de una especie qumica por parte de una masa y depende de la tendencia que tiene sta a formar mezclas o reaccionar qumicamente con la misma.

Los compuestos eluidos (que han atravesado la fase estacionaria) son transportados por la fase mvil a un detector que los registra en forma de curvas gausianas (forma de campana). Dichos seales se denominan picos y el conjunto de picos y lnea base registrados se denomina cromatograma.

Los picos dan informacin cualitativa y cuantitativa de la mezcla en cuestin:

(a) Cualitativa: el tiempo de retencin tR es siempre constante bajo condiciones cromatogrficas idnticas. Por tanto un pico puede ser identificado por comparacin de tiempos de retencin.

(b) Cuantitativa: el rea de un pico es proporcional a la cantidad de muestra inyectada.

CLASIFICACIN DE LA CROMATOGRAFA
Segn su fase mvil se clasifica en: Cromatografa de gases, puede ser a travs de dos sistemas, gas- lquido y gas-slido

Cromatografa lquida, el eluente es un lquido y puede ser lquido-liquido, lquido-slido.

Por el mecanismo de retencin-separacin o el tipo de equilibrio implicado en la transferencia de los solutos entre las fases se encuentra: Cromatografa de reparto, Cromatografa de adsorcin, Cromatografa de exclusin.

Segn la forma de contacto entre las fases se tiene:

Cromatografa de columna o superficie plana.

Tambin se puede clasificar teniendo en cuenta la fase estacionaria, la dimensionalidad, escala fsica y gradientes.

CROMATOGRAFA EN CAPA FINA

La cromatografa de capa fina es un procedimiento que se utiliza para separar molculas relativamente pequeas.

Se utiliza frecuentemente para separar azcares simples, lpidos, aminocidos, nucletidos, metabolitos, y cadenas cortas de polipptidos y cidos nucleicos.

La cromatografa en capa fina, consiste de una fase estacionaria y una mvil donde la sustancia de inters se adherir a la fase estacionaria o se mover con la fase mvil, viajando a una distancia que es inversamente proporcional a la afinidad por la fase estacionaria.

La fase estacionaria puede ser variada: papel, celulosa o gel de silicato (vidrio molido fino) unido a una superficie slida, una placa de vidrio, aluminio, plstico o papel.

La fase estacionaria consiste de un solvente que puede ser agua, un solvente orgnico.

CROMATOGRAFA EN COLUMNA
Los elementos bsicos de una cromatografa en columna son la fase estacionaria y la fase mvil. Es una tcnica que se emplea en el fraccionamiento de protenas.
Se aplica una muestra compleja de protenas a una columna en la que se ha situado una matriz slida porosa que est inmersa en un solvente

Se bombea una gran cantidad de solvente a travs de la columna

Las diferentes protenas se van retrasando de manera distinta segn sus diferentes interacciones con la matriz.

La solucin proteica forma una banda dentro de la fase mvil que inicialmente corresponde a la anchura de la banda de protena aplicada sobre la columna.

http://www.unizar.es/departamentos/bioquimica_biologia/docencia/FMBvirtual/PurProt/Croma.htm

Conforme las protenas migran a travs de la columna, su avance se encuentra retardado en diferente grado por las interacciones diferenciales que cada una de ellas pueda ejercer con la fase estacionaria.

http://www.unizar.es/departamentos/bioquimica_biologia/docencia/FMBvirtual/PurProt/Croma.htm

Tipos de cromatografa en columna

Cromatografa de filtracin en gel

Cromatografa de intercambio inico

Cromatografa de afinidad

Filtracin en gel o Exclusin Molecular

Utiliza diferentes tipos de miscelas las que al humectarse se transforman en partculas esferoidales con trama de diferente grado permitindole seleccionar solutos segn su tamao molecular.

http://www.unizar.es/departamentos/bioquimica_biologia/docencia/FMBvirtual/PurProt/Croma.htm

Cuando una solucin de solutos atraviesa el gel filtrante, las molculas de menor tamao al del dimetro de los poros de las esferas penetran dentro de las mismas debiendo recorrer mayor distancia que aquellas que no lo pueden hacer (molculas de mayor tamao) retrasndose con respecto a estas y escurriendo de la columna al final de la elucin.

De todos los geles, el mas usado es el Sephadex que resulta del entrecruzamiento de Dextrano por la accin de la Hepicloridina, el cual viene con poros de distintos tamaos.

http://www.unizar.es/departamentos/bioquimica_biologia/docencia/FMBvirtual/PurProt/Croma.htm

Cromatografa de Intercambio Inico

USOS: Se utiliza cuando se quiere. separar una mezcla cuyos componentes son especies qumicas que, a un pH adecuado, se disocian en iones Permite separar y purificar determinados analitos que, con posterioridad, se cuantifican como por absorcin molecular

En el interior de la columna se sita la fase estacionaria, que es un gel intercambiador de iones, el cual debe de acondicionarse previamente al paso de la fase mvil, que contiene la muestra.

http://www.unizar.es/departamentos/bioquimica_biologia/docencia/FMBvirtual/PurProt/Croma.htm

Tras el paso de dicha muestra, se eluyen los componentes no unidos a la fase estacionaria, y posteriormente se eluyen los componentes unidos (separndose en fracciones, si fuera el caso) que se cuantificaran por otros mtodos ya mencionados.

http://www.unizar.es/departamentos/bioquimica_biologia/docencia/FMBvirtual/PurProt/Croma.htm

http://www.unizar.es/departamentos/bioquimica_biologia/docencia/FMBvirtual/PurProt/Croma.htm

Cromatografa de afinidad

Se trata de un tipo especial de cromatografa de adsorcin slido-lquido en la que la sustancia de naturaleza bioqumica (anticuerpos, cofactores, inhibidores enzimticos y otras molculas) denominadas ligandos de afinidad y enlazados qumicamente en soportes slidos adecuados, retienen a los solutos (analitos), tambin de naturaleza bioqumica, de manera reversible y selectiva.

http://www.unizar.es/departamentos/bioquimica_biologia/docencia/FMBvirtual/PurProt/Croma.htm

http://www.unizar.es/departamentos/bioquimica_biologia/docencia/FMBvirtual/PurProt/Croma.htm

http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/cromatografia.htm

http://www.q1.fcen.uba.ar/materias/ai/hplc1.pdf

HPLC CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN

VENTAJAS Disminuye el tiempo de anlisis, aun incluso en mezclas muy complejas (productos biolgicos). Permite el anlisis de sustancias termolbiles que no podran ser manejadas por vaporizacin en un cromatgrafo de gases (se descomponen al vaporizarse).

En esencia, la fase mvil lquida (constituida por un disolvente adecuado que vehicula a la muestra) se bombea a travs de un sistema de separacin compuesto por un prefiltro y una columna, que contiene la fase estacionaria, a una elevada presin. Por su distinta interaccin entre las dos fases, la muestra es retenida con variable intensidad, eluyendo separada de la columna

La fase mvil puede ser un solvente puro o una mezcla de solventes. Cuando se trata de una mezcla, puede programarse la bomba para que tome solventes de diferentes botellas en una proporcin determinada y realice la mezcla en una cmara de mezclado

La bomba enva al solvente a travs de caos de dimetro pequeo, de acero inoxidable, hacia la vlvula inyectora. Luego de que se produzca la separacin en la columna, los componentes de la mezcla pasan por el detector. Este produce una seal elctrica proporcional a la cantidad de materia y esa seal es enviada al registrador que realiza un grfico de intensidad en funcin del tiempo (cromatograma)

REFERENCIAS
BIOQUMICA, Juan Daz y Marco A. Jurez, Mc Graw-Hill, 1ra Edicin, Mxico, 2007.
BIOQUMICA, Mathews, Van Holde y Ahern, Pearson Educacin, 3ra Edicin, Madrid, 2002. PRINCIPLES AND TECHNIQUES OF PRACTICAL BIOCHEMISTRY, Keith Wilson and John Walker, Cambridge University Press, 4ta Edicin, Inglaterra, 1994. http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/cromatografia.htm http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libro s/celular/cromatografia.htm http://www.cienciahoy.org.ar/hoy33/jugos04.htm http://www.q1.fcen.uba.ar/materias/ai/hplc1.pdf http://www.uprm.edu/biology/profs/velez/cromatografias.htm http://www.unizar.es/departamentos/bioquimica_biologia/docencia/FM Bvirtual/PurProt/Croma.htm http://www2.uah.es/tejedor_bio/bioquimica/cromatograf-lipidos.pdf