CINETICA ENZIMATICA

Dra. Emma del Rosario Guerrero Hurtado

CINETICA QUIMICA
Cintica Qumica es aquella parte de la Qumica que se encarga de estudiar la velocidad de una Reaccin Qumica y los factores que permiten su control. Se limita a :

a) Reacciones Reversibles

CLASIFICACION DE LA REACCIONES QUIMICAS

Segn

el nmero de molculas: P p P

A+B A+B+C

SEGN EL NMERO DE REACCIN

R. Primer Orden: A V= -d A= K (A) dT P

R. Segundo Orden: A+ B V= -dA = -dB + dP dT dT dT V= K (A) (B) R. Orden cero V= K (A)o..................V=K

Orden con respecto a A

V cero

1 V 20

[A]

[A]

[A]

Orden Cero

1er Orden

2do Orden

.Reaccin de Orden Cero

Orden cero con respecto a A Vx = k (n = o)

CINETICA DE MICHAELIS-MENTEN
En 1913 Michaelis y Menten de Hill propusieron una teria para explicar la velocidad inicial de una reaccin catalizada por una enzima, en funcin a la concentracin del sustrato. La concentracin de sustrato que produce la mitad de la velocidad mxima, llamada valor Km o Constante de Michaelis, se puede determinar experimentalmente graficando v1(velocidad inicial) como funcin de [S]. La expresin de Michaelis-Menten

Vo = Vmax [S] Km + [S]

M.M.en 1913 investigaron el siguiente sistema : Sacarosa

invertasa agua

Glucosa + Fructosa

Midieron la velocidad inicial Vo en condiciones experimentales a)(E) variable y (S) constante b)(E) constante y (S) variable

A) Efecto de la (E) sobre la velocidad Enzimtica

Vo

(E)

B) Efecto de la concentracin del sustrato sobre la velocidad de una reaccin

-------------------------------------------------------

Vo

1/2 Vmax

KM

Sustrato (S)

Se supone: E+ S ES
KM

ES E+P

= Constante de Michaelis -Menten

Constante global que sustituye o engloba las constantes de velocidad de la reaccin de interaccin entre el enzima y el sustrato Vo = Velocidad inicial de reaccin
Vmax = Cuando el enzima se halla saturado

Como se relacionan Vmax, Km y Vo?

Observemos

:*
K3

K1

+S
K2

ES
K4

E+P

Que hay un solo sustrato

Que la velocidad K4 se desprecia * Que la concentracin del E es muy pequea * Que la E puede estar como: E libre y ES * Que el equilibrio alcanzado por K1 es ms rpido que K3, por lo que ste es limitante

POR LO QUE...

LA FORMACION DEL PRODUCTO SERA:

VO = K 3(ES)
LA ECUACION RESULTANTE SERA:

VO =Vmax.(S)
(S) + Km Ecuac. Michaelis Menten

La dependencia de la velocidad inicial de una reaccin catalizada por enzima en [S] y en Km puede aclararse valorando la ecuacin de Michaelis-Menten como sigue:
.-1) Cuando [S] es igual que Km: vo= Vmax*[S] Km + [S] vo = Vmax*[S] = Vmax[S] = Vmax [S]+ [S] 2[S] 2

2)

Km= K2 + K3/ K1

Si K2>> K3
Kes = (E) (S) (ES)

Km =K2/K1
KM = (E) (S) (ES)

SIGNIFICADO E LA VELOCIDAD MAXIMA

Vmax=

K3 (ET)

# de recambio

K3=

nmero de molculas de Sustrato convertidas en producto por unidad de tiempo, cuando la enzima esta saturada

NMERO DE RECAMBIO Carboxipeptidasa Tripsina Cinasas 102 102 a 103 103

Deshidrogenasas
Transaminasas Anhidrasa carbonica Superoxido dismutasa

103
103 106 106

catalasa

107

DETERMINACIN DE KM Y Vmax MEDIANTE UNA ECUACION LINEAL

Se tiene: vo= Vmax*[S] Km + [S]

se invierte 1 = Km + [S] vo Vmax*[S]

Se factoriza 1 = vo
Se simplifica:

Km * 1 + [S] Vmax [S] Vmax[S]

1 = Km * 1 + vo Vmax [S]

1 Vmax

La ecuacin de la recta es: y=a*x+b

La ecuacin de la recta es: y=a*x+b

donde:
y = 1 Vo y x = 1 [S]

El valor de Km puede ser hallado a partir de la grfica de Lineweaver-Burk o del doble reciproco usando la pendiente y la interseccin negativa de x.

Representacin recproca doble (Lineweaver - Burk)

0.04

1/v
0.03

1/Vmax
0.02

-1/Km

0.01

1 Km 1 1 v Vmx s Vmx

0.00 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6

1/s

INHIBICION ENZIMATICA

ENTENDEMOS COMO EL EFECTO DE ALGUNAS SUSTANCIAS SOBRE LA VELOCIDAD CATALITICA DEL ENZIMA

APLICAMOS LA ECUACION DE LINENWEAVER-BURKE EN LA IDENTIFICACION DEL TIPO DE INHIBICION.

INHIIBIDORES
1. Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima libre, con el complejo enzima-substrato o con ambos: E+I EI ESI

ES + I

2. Inhibidor irreversible: modifica qumicamente a la enzima: E+I E

Inhibicin reversible
(a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre, impidiendo la fijacin del substrato: Inhibicin Competitiva

(b) El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo haga o no el substrato; el inhibidor, por tanto, no impide la fijacin del substrato a la enzima, pero s impide la accin cataltica: Inhibicin No Competitiva

Inhibicin Competitiva

S
E I EI
Se define una constante de equilibrio de disociacin del inhibidor:

ES

E+P
[E] [I] Ki = [EI]

Caractersticas: - Las fijaciones de substrato e inhibidor son mutuamente exclusivas - A muy altas concentraciones de substrato desaparece la inhibicin - Por lo general, el inhibidor competitivo es un anlogo qumico del substrato. - El inhibidor es tan especfico como el substrato

Por tanto, en la inhibicin competitiva,

1. El efecto cintico del inhibidor es el aumento aparente de la Km, que aparece multiplicada por el factor (1 + i/Ki) 2. La Vmax no aparece modificada; para concentraciones muy altas del substrato, v = Vmax, igual que en ausencia de inhibidor
3. Cuanto ms pequeo sea el valor de Ki mayor ser la potencia del inhibidor competitivo.

Inhibicin competitiva - Representacin recproca doble

1/v

0.07

0.06

0.05

1/Vmax

0.04

-1/Km

0.03

0.02

0.01

1/s
0.00 -0.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

-1/(Km(1 + i/Ki))

Inhibidores competitivos

Succinato deshidrogenasa
COOCH2 CH2 COOSuccinato SDH FAD FADH2 COOCH CH COOFumarato

COOCH2 COOMalonato

COOC O CH2 COOOxalacetato

COOCH2 CH2 COOSuccinato

COOC O CH2 COOOxalacetato
Inhibidores competitivos como nalogos estructurales del substrato

E
I S I

ES

E+P
Inhibicin No Competitiva

EI

ESI

El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre E y al complejo enzima-substrato ES; ni el complejo EI ni el complejo ESI son productivos

INHIBICION NO COMPETITIVA

E I

+I + ES

EI ESI

Algunas enzimas (no todas) que poseen un grupo -SH esencial, son inhibidas no competitivamente por iones de metales pesados (la enzima requiere esos grupos -SH intactos para su actividad normal).
El agente quelante EDTA se une reversiblemente al Mg2+ y a otros cationes divalentes, e inhibe as de modo no competitivo a algunas enzimas que precisan esos iones para su actividad.

DROGA

USO ENZIMA TERAPEUTICO AFECTADA

TIPO DE INHIBICION

Lovastina Hipercolestero lemia 5fluoroacil cancer

alopurinol gota cumadin captopril anticoagulante hipertensin

HMGCoA reductasa
Dihidrofolato reductasa Xantino oxidasa Glutamilcar boxilasa ECA

Competitiva
competitiva irreversible competitiva competitiva

CONCEPTO DE ANLOGO DE ESTADO DE TRANSICIN (AET)

- El inhibidor no es estrictamente anlogo del substrato, sino del Estado de Transicin de la reaccin.
- La afinidad de las enzimas por los AET es enorme, del orden nM o pM, con lo que la fijacin es tan fuerte que puede considerarse irreversible

Estado de transicin

Substrato

Anlogo de estado de transicin

Inhibicin Irreversible
- Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo qumico de la enzima, modificndola covalentemente - Su accin no se describe por una constante de equilibrio Ki, sino por una constante de velocidad ki:

E+I

- A diferencia de la inhibicin reversible, el efecto de los inhibidores irreversibles depende del tiempo de actuacin del inhibidor. - Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente txicos.

Algunos tipos de inhibidores irreversibles

1. Reactivos de grupos -SH

2. Organofosfricos 3. Ligandos de metales

4. Metales pesados

Reactivos de grupos -SH, (a) Agentes alquilantes Yodoacetato ICH2 COOE SH

IH

E S CH2 COOO E S N CH2 CH3 O

(b) Compuestos insaturados

E SH
O N CH2 CH3

N-Etil maleimida (NEM)

O

Reactivos de grupos -SH, 2

(c) Formadores de mercptidos
HOHg COO-

p-Hidroximercuribenzoato
S Hg COO-

SH

(d) Oxidantes Promueven la oxidacin de dos tioles a un disulfuro

Organofosfricos

Ser CH

CH2
H 3C F

OH

H3C Ser CH CH2 O

CH3 CH P O

CH3 CH P O

CH H3C CH3

DFP: diisopropil fluorofosfato

CH H 3C CH3

- Actan sobre enzimas sernicas - nicamente sobre la Ser activa - Insecticidas: Parathion, Malathion - Inhibidores de la Acetilcolinesterasa

Ligandos de coordinacin de metales

Es el caso del ion cianuro, CNSe fija con gran afinidad a la sexta posicin de coordinacin del Fe hemnico, impidiendo toda modificacin posterior. Por ello acta sobre sistemas de Fe hemnico con la sexta posicin de coordinacin libre, como la citocromo oxidasa, de lo que deriva su elevadsima toxicidad

Substratos Suicidas
(Inhibidores activados enzimticamente) - Se trata de molculas que se unen al centro activo de manera especfica, igual que el substrato o los inhibidores competitivos - Una vez unidos al centro activo, la enzima transforma la molcula en una especie qumica muy reactiva que modifica covalentemente a la enzima, inactivndola

- Tienen por tanto (a) la especificidad del inhibidor competitivo y (b) la potencia de los inhibidores irreversibles

Modo de accin de los inhibidores suicidas

E+I

EI

EI*

E + I*

1. El inhibidor se fija a la enzima igual que el substrato o un inhibidor competitivo convencional 2. La accin cataltica de la enzima convierte al inhibidor I en una especie altamente reactiva I* 3. I* modifica covalentemente a la enzima, inactivndola de forma definitiva al igual que un inhibidor irreversible.

INHIBIDORES SUICIDAS,
- Sistema de la b-lactamasa bacteriana La utilizacin masiva de antibiticos b-lactmicos (penicilinas, sus derivados semisintticos y cefalosporinas) ha conducido a la aparicin de resistencias a los mismos. Los microorganismos resistentes a estos antibiticos lo son por producir una enzima, la b-lactamasa, que inactiva a los antibiticos b-lactmicos.

Penicilina (activa)
R CO NH N O S CH3 CH3 COO-

b-Lactamasa

R CO NH O C HN O-

CH3 CH3

COO-

c.peniciloico (inactivo)

Muy a menudo los preparados de penicilinas o penicilinas semisintticas se formulan aadiendo un inhibidor suicida de la b-lactamasa, el cido clavulnico
O C N O COO
-

CH2OH H

b-Lactamasa

O C OHN

O C

CH2OH H

c.clavulnico

COO-

O C CH CH2 Ser O HN

O C

CH2OH H

Esta molcula reacciona con la serina activa de la b-lactamasa, produciendo su inactivacin

COO-

- SISTEMA DE LA MONOAMINO OXIDASA (MAO) CEREBRAL

Los estados depresivos, en general, estn relacionados con un descenso en la concentracin de neurotransmisores adrenrgicos (dopamina, noradrenalina, etc.) en determinadas regiones del cerebro.
Una de las enzimas encargadas de la degradacin de estos neurotransmisores es la monoamino oxidasa (EC 1.4.3.4).

Por tanto, la inhibicin de la monoamino oxidasa se emplea como teraputica de los estados depresivos. Se han desarrollado muchos inhibidores suicidas de la MAO

Noradrenalina
HO HO CHOH CH2 NH2

O2 + H2O

Monoamino oxidasa
NH3 + H2O2
HO HO CHOH CHO

La MAO es una flavoprotena: tiene un grupo prosttico flavnico (FAD) fundamental para la catlisis. Los inhibidores suicidas de la MAO inactivan al cofactor FAD.

Dihidroxifenilglicol

O H3C E S H2C N N R N NH O

N,N dimetil propargilamina (pargilina)

HC C CH N
+

CH3 CH3

Flavina

H3C

Inhibicin suicida de la MAO mediante Pargilina

N+

CH CH CH N N R NH O NH O

H3C H3C E S H2C

Flavina modificada

CINETICA DE REACCIONES BIMOLECULARES 1 )Reaccion Secuencial o de Desplazamiento Simple

Azahar:
A +E AE+B AE AEB

B+ E
BE + A

BE
BEA

2) ORDENADA

MALATO + NAD
M.D

OXALACETATO + NADH.

E-NAD-MALATO 1 2

2) REACCION DE DOBLE DESPLAZAMIENTO ASPARTATO + OXOGLUTARATO OXALACETATO + GLUTAMATO

1) Aspartato + PLP-E Oxalacetato

2) Oxoglutarato + NH3 Glutamato

NH3- PLP-E +

PLP-E +

ENZIMAS ALOSTERICAS
S

S
CA

C.ALOST.

ENZIMA

ENZIMAS ALOSTERICAS

PRESENTAN

2 LOCALIZACIONES DE

UNION DE LIGANDOS:
1. 2.-

Centro Activo, donde se une el sustrato. Centro Alostrico, donde se unen las denominada efectores o

molculas moduladores.

MODULADORES O EFECTORES ALOSTERICOS

Son molculas que pueden ser activadores (+) o inhibidores (-) de la velocidad cataltica.

No cambian la afinidad del enzima por el sustrato.

Pueden ser el mismo sustrato denominado Homotrpico o es otra sustancia al que se le conoce como Heterotrpico.

CINETICA SIGMOIDEA
La unin cooperativa de la primera molcula de S o ligando a la Enzima incrementa la velocidad de unin de subsecuentes molculas de sustrato a los otros sitios de unin: cooperatividad positiva

ENZIMAS ALOSTERICAS
Enzimas

susceptibles de ser modificadas por molculas pequeas.

Efector +

Efector Vmax/2

Vo Km Km Km

 ESTADO

CONFORMACIONAL

T
Baja afinidad por el sustrato

Alta afinidad por el sustrato

MODELOS DE INTERACCIONES ALOSTERICAS MODELO CONCERTADO:

+S

RR
TT

RR

MODELO SECUENCIAL : TT RT
+S

+S

RR