Como agem as drogas antiinflamatrias no esteroidais?

Maria Jos Figueiredo

Resumo da aula

Histrico eicosanides
Biossntese de prostanides Histrico MAINE

Inibio da COX-1 e COX-2

Evoluo dos MAINE Efeitos colaterais dos inibidores seletivos COX-2

Evidncias de mecanismos adicionais a inibio das

COXs

Histrico - Eicosanides

1930, Kurzrok & Lieb (ginecologistas) fatias do tero

humano ;

1933 - 1935, Goldblatt (Inglaterra) / von Euler (Sucia) musc. lisa lquido seminal e gls reprodutoras

acessrias;

1936, von Euler: substncia ativa - termo Prostaglandina; + de 20 anos (famlia de compostos tpicos)

1962, Samuelsson, Bergstrm & cols: estrutura de PGE, PGF;

Histrico - Eicosanides

1964, Bergstrm / van Dorp & cols: sntese de PGs a

partir do c. Araquidnico vescula seminal de carneiros;

PGs frao dos produtos fisiologicamente ativos

1975, Hamberg e cols.: tromboxanos; 1976, Moncada e cols.: prostaciclinas; 1983, Samuelsson e cols.: leucotrienos.

Fosfolpides de Membrana
Estmulos Estmulo

Fosfolipase A2

cido Araquidnico Prostaglandina G2 Prostaglandina H2 PGI2 Sintase TX Sintase Isomerases Especficas Mastcitos

COX

Biossntese e aes dos prostanides

Endotlio

Plaquetas

PGI2
AES

TXA2
TP
Vasoconstr. agregao plaquetria

PGD2
DP
Vasodilatao agregao plaquetria

PGF2
FP
Contrao uterina e febre

PGE2
EP 1, 2, 3, 4
Vasodilatao controle fluxo sg renal diurese Citoproteo gstrica contrao uterina inflamao e febre

Recep. IP
Vasodilatao (controle fluxo sg renal) agregao plaquetria citoproteo gstrica

Histrico - MAINE
Egpcios: efeito analgsico

das folhas
400 a.C. Hipcrates: folhas e cascas no alvio da dor 1763 Reverendo Edmund Stone: Carta sucesso da casca do salgueiro na cura da sezes (doctrine of signatures)

1829 Leroux: (ingrediente ativo glicosdeo amargo: salicina

Willow = Salgueiro (Spiraea ulmaria)

Histrico - MAINE
1836 Pina: cido saliclico 1859 Kolbe: sintetizou o c. saliclico 1874 produzido industrialmente (febre, febre reumtica

e gota)
Efeitos adversos e gosto desagradvel 1899 Hoffmann (Bayer) c. Acetilsaliclico (1853 -

Gerhardt)
1899 Dreser: aspirina

Inhibition of Prostaglandin Synthesis as a Mechanism of Action for Aspirin-like Drugs

Homogenato de pulmo de cobaias + AA + MAINE

Concentrao de PGF2 Contrao do clon de ratos

VANE, JR. Nat New Biol (1971) 231:232-235

Prmio Nobel em Medicina 1982

Sune K. Bergstrm

Bengt I. Samuelsson

John R. Vane

"for their discoveries concerning prostaglandins and related biologically active substances"

Estmulo

Fosfolipase A2

cido Araquidnico Prostaglandina G2 Prostaglandina H2 PGI2 Sintase TX Sintase Endotlio Plaquetas

COX

MAINE

Isomerases Especficas Mastcitos

PGI2
AES

TXA2
TP
Vasoconstr. agregao plaquetria

PGD2
DP

PGF2
FP

PGE2
EP 1, 2, 3, 4
Vasodilatao controle fluxo sg renal diurese Citoproteo gstrica contrao uterina inflamao e febre

Recep. IP
Vasodilatao (controle fluxo sg renal) agregao plaquetria citoproteo gstrica

COX-1 e COX-2
COX-1

constitutiva maioria das cls normais e tecidos COX-2 induzida processos inflamatrios

Dupla Ao Enzimtica da Ciclooxigenase

ciclooxigenase: insero do oxignio molecular no C11 e no C15 do cido araquidnico PGG2 peroxidase: reduz o grupamento 15-hidroperoxi a 15- hidroxi PGH2

Inibio da COX-1 e COX-2

Sntese de PGs a partir de AA Diferenas entre COX-1 e COX-2

Ponte de hidrognio

Ligao Covalente

MAINE inibem COX-1 e COX-2

Inibidores seletivos COX-2

Hawkey, Lancet, 353: 1999

Inibidores Seletivos da COX-2: ausncia de efeitos colaterais?

Fosfolpides de Membrana Fosfolpides de Membrana cido Araquidnico Endotoxina Citocinas Mitgenos

Inibidores Seletivos COX-2 MAINE Clssicos

Homeostase Processos Inflamatrios

Evoluo dos antiinflamatrios

Rofecoxib
(1999)

Celecoxib
(1999)

Naproxeno
(1973)

Sulindac
(1977)

Diclofenaco
(1979)

Indometacina
(1964)

Ibuprofeno
(1969)

Aspirina
(1899)

Brune et al., Scand J Rheumatol, 2004.

Menor incidncia de lceras durante tratamento com celecoxib

Celecoxib 400 mg (n=3 987)

NSAIDs (n=3 981)

FDA Arthritis Advisory Committee Meeting. February 7, 2001. Maryland

Rofecoxib aumenta a incidncia de problemas cardiovasculares

revisado por Mukherjee et al., JAMA, 286: 2001.

Aumento da Presso Sangunea induzida por Inibidores Seletivos da COX-2

% Pacientes com aumento clinicamente importante

celecoxib rofecoxib

1a. semana

2a. semana

6a. semana

Pacientes acima de 65 anos, com osteoartrite medicao anti-hipertensivs

Whelton et al. Am J Ther, 8, 2001

Envolvimento da COX-1 e COX-2 em processos patofisiolgicos

Parente & Perreti, Biochem Pharmacol (2003) 65: 153-159

Efeitos colaterais dos inibidores seletivos COX-2 sobre o sistema cardiovascular

Vane, Science 296: 2002

Inibidores de COX-2 inibem a produo de PGI2, mas no de TXA2

Doses de aspirina - tratar doenas inflamatrias crnicas maiores que aquelas requeridas para inibir a sntese de PG

(Weismann, G., Science, 264, 1991; Rainsford in Aspirin and salicylates (Butterworths, London, 1984)

Atividade antitumoral dos MAINE (inibio da progresso ciclo celular, induo de apoptose, inibio da angiognese) - altas doses - maiores que as necessrias para inibir a sntese de PGs

(Goldberg et al., Oncogene, 12, 893-901, 1996; Barnes et al., Br.J.Cancer, 77, 573-580, 1998; Jones et al., Nat. Med., 5, 1418-1423, 1999) Vrios estudos tem mostrado que a concentrao de protena e RNAm para COX-2 so up-regulated em tecidos malignos. Deste modo as propriedades antineoplsicas foi primariamente atribuda a sua abilidade de bloquear COX-2

MAINE inibem a formao e crescimento do tumoral em linhagens celulares deficientes em COX.

(Hanif et al., Biochem Pharmacol, 52, 237-245, 1996)

Down-Regulation of PGE2 by Physiologic Levels of Celecoxib is not Sufficient to Induce Apoptosis or Inhibit Cell Proliferation in Human Colon Carcinoma Cell Lines
Shahar Lev-Ari et al., Dig Dis Sci. 2007 Apr;52(4):1128-33

Ensaio imunoenzimtico

Western blot

PCR

HT-29 carcinoma

Down-Regulation of PGE2 by Physiologic Levels of Celecoxib is not Sufficient to Induce Apoptosis or Inhibit Cell Proliferation in Human Colon Carcinoma Cell Lines

Citometria de fluxo

HT-29: expressam altas concentraes de COX-2 SW-480: no expressa COX-2

Efeito da indometacina, celecoxibe e ibuprofeno na febre induzida pelo MIP-1

In vivo: ratos

Soares et al., Brain Research, 2006

Efeito da indometacina, celecoxibe e ibuprofeno na febre induzida pela RANTES

In vivo: ratos

Machado et al., Brain Research 2007

A dose de celecoxibe necessria para promover antipirese maior que a necessria para inibir a sntese de PGs

In vivo: ratos

Fabricio et al., Am.J.Physiol Regul. Integr Comp Physiol, 288: R761-R677, 2005

Nimesulida inibe a liberao de TNF- induzido por LPS

In vivo: ratos

Werner et al., European J.of Pharmacol. 543,183-189, 2006

Salicilato de sdio inibe a ativao do NF-B

Cls pr B- PD31 (mouse) EMSA Koop & Ghosh, Science, 1994

Ativao do fator nuclear NF-kB

Patgenos, stress, citocinas pr-inflamatrias

5 membros: p65 (rel A) Rel B c Rel p50/p105 (NF-B 1) p52/p100 (NF-B 2) Existem nas cls no estimuladas homo ou heterodmeros ligados as protenas da famlia IB

NF-kB

Regula a expresso de:

enzimas pr-inflamatrias citocinas quimiocinas imunorrereceptores molculas de adeso peptdeos antimicrobianos protenas anti-apoptticas

Salicilato de sdio inibe a ativao de NF-B

HUVECs Pr-tratadas por 1 hora Estimuladas por 15 min com TNF- EMSA
Pierce et al., The Journal of Immunology, 1996

Salicilato de sdio bloqueia a expresso transcrita de molculas de adeso induzidas pelo TNF-

HUVEC Pr-tratadas 1h Estimuladas 4h (TNF) RNAm Northern Blot

Pierce et al., The Journal of Immunology, 1996

Salicilatos bloqueiam a expresso de molculas de adeso na superfcie celular induzidas pelo TNF-

Imunoensaio fluorescncia Pierce et al., The Journal of Immunology, 1996

Salicilatos bloqueiam a expresso de molculas de adeso na superfcie celular induzidas pelo TNF-

Imunoensaio fluorescncia

Pierce et al., The Journal of Immunology, 1996

Celecoxibe perde a eficcia antiinflamatria em altas doses atravs da ativao de NF-B

In vivo (rato) : edema de pata - Zimozan

Niederberger et al., The FASEB Journal, 2001

Celecoxibe perde a eficcia antiinflamatria em altas doses atravs da ativao de NF-B

Ensaio imunoenzimtico PCR

Northrn Blot

Western Blot

Cls mesangiais renais (rMES)

Niederberger et al., The FASEB Journal, 2001

Celecoxibe perde a eficcia antiinflamatria em altas doses atravs da ativao de NF-B

Cls mesangiais renais (rMES) Pr-incubadas 30min celec Estimuladas IL-1 30min EMSA Niederberger et al., The FASEB Journal, 2001

Rofecoxibe inibiu de maneira dose dependente a capacidade de ligao de NF-B no DNA, enquanto aumentou a atividade de ligao de AP-1

W.B.

RAW 264.7 (macrfagos) Pr-incubadas 30min rofec. Estimuladas 30min LPS EMSA
Bay 11-7085 inibidor da kinase IkB

Niederberger et al., J. of Pharmac. and Exp. Terap., 2003

Etoricoxibe e Lumiracoxibe no alteraram a expresso nuclear de c-jun e c-fos induzida por LPS
W.B

Elisa

RAW 264.7 (macrfagos) 30 min pr-incubadas com as drogas 30 min estimuladas com LPS Niederberger et al., Biochem.Biophys.Research Communications, 2006

Etoricoxibe e Lumiracoxibe inibiram a ativao do NF-B

W.B

Elisa

RAW 264.7 (macrfagos) 30 min pr-incubadas com as drogas 30 min estimuladas com LPS

Niederberger et al., Biochem.Biophys.Research Communications, 2006

Etoricoxibe reduziu a expresso de protena para COX-2 e iNOS, enquanto o Lumiracoxibe no mostrou efeito sobre as mesmas

RAW 264.7 (macrfagos) Estimuladas 24h com LPS Western Blot mtodo de Griess / Elisa

Niederberger et al., Biochem.Biophys.Res. Communications, 2006

Concluso Parcial
Em modelos in vitro: Salicilato de sdio inibe a ativao de NF-B Celecoxibe inibe (em baixas doses) e estimula (em altas doses) a ativao de NF-B Rofecoxibe inibe a ativao de NF-B e estimula a ativao de AP-1 de maneira dose dependente Etoricoxibe e Lumiracoxibe inibem a ativao de NFB e no apresentam efeito sobre a ativao de AP-1

Maior [ ] de celecoxibe para inibir proliferao celular Efeitos no so revertidos pela adio de PGE2 Rofecoxibe no produz efeitos similares
Grsch et al., J.National Cancer Institute,2006

MAINE inibiram a ativao do NF-B induzido por TNF

Takada et al., Oncogene,2004

KBM-5 cells (leucemia) / pr-tratadas com MAINE (4 ou 8 h) / estimuladas 0.1 nM TNF por 30 min / EMSA

MAINE inibiram a degradao do IB dependente de TNF

Takada et al., Oncogene, 2004

KBM-5 cells (leucemia) / pr-tratadas com MAINE (4 ou 8 h) / estimuladas 0.1 nM TNF por 15 min / Western Blot

MAINE inibiram a expresso de protenas reguladas por NF-B e induzidas por TNF

Takada et al., Oncogene,2004

KBM-5 cells (leucemia) / pr-tratadas com MAINE (4 ou 8 h) / estimuladas 1 nM TNF por 24h / Western Blot

MAINE inibiram a expresso de protenas reguladas por NFB e induzidas por TNF

KBM-5 cells (leucemia) / pr-tratadas com MAINE (4 ou 8 h) / estimuladas 1 nM TNF por 24h / Western Blot/ Elisa

Takada et al., Oncogene,2004

MAINE inibem a proliferao de cls tumorais

H1299 adenocarcinoma KBM-5 leucemia

Takada et al., Oncogene, 2004

Celecoxibe inibiu a ativao de NF-B dependente de TNF

H1299 carcinoma Pr-incubadas com celec (4h) 0,1 nM TNF 30 min EMSA

Shishodia et al., J.Immunol, 2004

Celecoxibe inibiu a ativao de cyclinD1, MMP-9 e COX-2 induzida pelo TNF

H1299 carcinoma Western Blot Shishodia et al., J.Immunol, 2004

Celecoxibe inibiu a ativao das vias p38 MAPK, ERK e JNK

H1299 carcinoma Western Blot Shishodia et al., J.Immunol, 2004

Concluso
Os MAINE atuam:
inibindo a atividade da enzima COX inibindo e/ou estimulando a ativao de fatores de transcrio (altas doses) AP-1, NF-B regulando a expresso de molculas envolvidas na resposta inflamatria e proliferativa inibindo outras vias de sinalizao intracelular (MAP-kinases, ERK, JNK)

Perspectiva

Entendimento do mecanismo pelo qual os diferentes MAINE atuam na sinalizao intracelular ser til para o desenvolvimento de novos MAINE mais especficos e efetivos

A antipirese induzida pela indometacina mediada pela liberao de AVP

Tris Indometacina Paracetamol

Wilkinson et al., Am J.Physiol.,R1133-1138, 1993

Celecoxibe inibiu 1) a fosforilao e a degradao do IkB 2) a fosforilao e a translocao nuclear de p65 induzida po TNF-

Shishodia et al., J.Immunol, 2004

Figure 1. . Activation or induction ( ); inhibition ( ); inhibited by NSAIDs (shaded oval); activated by NSAIDs (oval). Abbreviations: Akt/PKB, protein kinase B; APC adenomatous polyposis coli tumor suppressor gene; AP-1 activator protein 1; Cdk, cyclin-dependent kinase; CREB, cAMP response element binding protein; Erk, extracellular signal-regulated kinase; GSK3, glycogen synthase kinase 3 beta; HSF, heat shock factor; Hsp, heat shock protein; IKK, Ikappa kinase; JNK, Jun NH2-terminal kinase; MAPK, mitogen-activated kinase; MAPKAP, MAPK-activated protein kinase; MEK/MKK, mitogenactivated protein kinase kinase; MLK, mixed lineage kinase; MSK, mitogen- and stress-activated kinase; NIK, nuclear factor kappaB-inducing kinase; NF- B, nuclear factor kappa B; PAK, p21-GTPase-activated kinase; PDK, phosphoinositol-dependent kinase; PI-3K, phosphatidylinositol-3-kinase; PKC, protein kinase C; PPAR, peroxisome proliferator-activated receptor; pRb, retinoblastoma protein; p70-S6K, p70S6 kinase; p90RSK, ribosomal S6 kinase; Tcf, T cell factor; Wnt (syn Wg), wingless

Tegeder et al., FASEB J. 2001 Oct;15(12):2057-72

Tegeder et al., FASEB J. 2001 Oct;15(12):2057-72

Takada

Jun/Fos and Jun/ATF dimers exhibit distinct, complementary functions in oncogenic transformation (van Dam et al., 1998; van Dam and Castellazzi, 2001). (GOOGLE map-kinases)

Risk of Hospitalization for Myocardial Infarction Among Users of Rofecoxib, Celecoxib, and Other NSAIDs A Population-Based CaseControl Study
Sren P. Johnsen, MD, PhD; Heidi Larsson, MSc; Robert E. Tarone, PhD; Joseph K. McLaughlin, PhD; Bente Nrgrd, MD, PhD; Sren Friis, MD; Henrik T. Srensen, DMSc

Arch Intern Med. 2005;165:978984.

????????????????

Fig. 2. A, expression of iNOS and COX-2 mRNA in RAW 264.7 cells stimulated with LPS for 24 h in the absence or presence of rofecoxib or dexamethasone at the indicated concentrations. Top, Northern blot analysis of iNOS and COX-2; 20 g of RNA was separated in a 1% agarose gel, blotted on a nylon membrane, and then hybridized with the radioactively labeled probe. The blots show representative results of four experiments. 18S RNA was assessed as a loading control. Bottom, realtime reverse transcription-PCR. One hundred nanograms of RNA-equivalent was subjected to real-time PCR in an SDS 7700 with Sybr Green staining. Ct values were calculated with 18S RNA as internal standard. The diagram shows the relative amount of mRNA compared with the LPS stimulated control, which was set as 1. B, release of nitrite/nitrate in RAW 264.7 stimulated for 24 h with 10 g/ml LPS in the absence or presence of rofecoxib or 0.5 M dexamethasone (Dex). Nitrite/nitrate concentrations (mean S.E.M.) were measured by the Griess method (*, statistical significance mean difference, p = 0.05). C, effects of rofecoxib on the release of PGE2 (mean S.E.M.) in RAW264.7. Cells were treated as described above. PGE2 concentrations were measured by an enzyme immunoassay (*, statistical significance mean difference, p = 0.05).

Salicilato inibe a angiognese

??????????

Figure 4. Salicylate reduces cell viability and inhibits angiogenesis. Cell viability in the MTT assay is significantly decreased at 2 and 5 mM salicylate after 48 h, but there is no detectable change at 0.5 mM salicylate compared with carrier control (A). Apoptotic cells, detected by TUNEL staining, were significantly increased following 48 h treatment with 2 and 5 mM salicylate, but there was no increase at 0.5 mM salicylate compared with carrier control (B). Salicylate treatment caused a significant decrease in angiogenesis in the 3D collagen assay at 0.5, 2, and 5 mM, mirroring effects of aspirin at equimolar concentrations (C). Data, expressed as mean SE, were analyzed using Students t test. *Statistical significance at P < 0.0001 and #statistical significance at P < 0.02, compared with controls. Each figure represents 3 independent experiments.

Borthwick et al., FASEB J, 2006

Aspirina inibe a proliferao celular endotelial e reduz a viabilidade celular

RT-PCR

HMEC-1: cls eoteliais

Borthwick et al., FASEB J, 2006

Concentraes Teraputicas de Aspirina inibem a angiognese

HMEC-1: cls eoteliais

Borthwick et al., FASEB J, 2006

Inibidores da COX-1 e COX-2 no inibem a angiognese em doses seletivas

Borthwick et al., FASEB J, 2006