Tcnica de biologa molecular.

OBJETIVO:

Obtener un gran nmero de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mnimo

FUNCIN: Amplificar un fragmento

Gel de agarosa teido con bromuro de etilo que muestra varios productos de PCR obtenidos mediante distintos cebadores, con un bajo nivel de especificidad

de ADN, de una forma especfica.

Sus

usos, derivados de la amplificacin, la convierten en una tcnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.

Termociclador: aparato en el que se efecta la PCR convencional.

FUNDAMENTO DE LA TCNICA
Se basa en la propiedad natural de las ADN polimerasas para

replicar hebras de ADN.

Se emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para

separar las hebras de ADN recin formadas entre s tras cada fase de replicacin.
Seguidamente se deja que vuelvan a unirse a polimerasas para que

vuelvan a duplicarlas.
Puesto que las temperaturas del ciclo (95C en las fases de

desnaturalizacin del ADN) suponen la inmediata desnaturalizacin de toda protena, se emplean ADN polimerasas termoestables, extradas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayora de los seres vivos.

ANTECEDENTES
1971: Kleppe et al., describi por primera vez un mtodo que

usaba enzimas para replicar una secuencia pequea de ADN con primers in vitro.
Debido a que las ADN polimerasas utilizadas previas a la PCR no

eran capaces de soportar altas temperaturas, los procedimientos para replicar ADN eran ineficientes, largos y requeran grandes cantidades de ADN polimerasa.
1976: Se descubre la Taq polimerasa, extrada de la bacteria

termfila Thermus aquaticus, (habitad: 50-80C), y elimina los inconvenientes del mtodo de la PCR. Esta ADN polimerasa es estable a altas temperaturas, permaneciendo activa hasta despus de la desnaturalizacin del ADN.

 1986: Kary Mullis, la describe por primera vez. Concibe la idea

una noche mientras iba en su coche e imagina una nueva forma de analizar mutaciones en el ADN cuando se percat de que, en lugar de eso, haba inventado un mtodo para amplificar regiones especficas de ADN mediante ciclos de duplicacin repetidos usando ADN polimerasas. Atribuye esta invencin a los efectos de la droga psicodlica y alucingena LSD. Sin embargo, han aparecido controversias y diferentes versiones sobre las contribuciones intelectuales y prcticas de otros cientficos y sobre si l fue el inventor nico de la PCR. llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reaccin para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reaccin.

1993: Mullis gana el Premio Nobel de Qumica por su invencin.

Hoy, todo el proceso es automatizado mediante un aparato

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ADN molde, que contiene la regin de ADN que se va a amplificar.

Desoxinucletidos trifosfato (sustrato para polimerizar nuevo ADN). Dos cebadores (primers). ADN polimerasa con temperatura ptima alrededor de 70C (Taq polimerasa). Cofactores de la polimerasa (Iones divalentes y monovalentes).

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Solucin tapn para mantener el pH ptimo de la ADN polimerasa.

Termociclador, que mantiene la temperatura necesaria en cada una de las etapas de ciclo.

PRIMER CICLO DE PCR

La temperatura aumenta a 95C para que las

hebras de la molcula de ADN se separen.

Seguidamente la temperatura se baja a 60C. Los Primers se unen a las regiones especficas

que delimitan la zona a amplificar a cada una de las cadenas.

Se eleva la temperatura a 72C y la Taq

polimerasa agrega nucletidos usando como molde a la cadena complementaria.

Solo se copia la regin que se quiere

amplificar.
Al final del ciclo se tiene dos hlices de ADN

nuevas.

SEGUNDO CICLO DE PCR

Se regresa la temperatura a 95C para

separar las cadenas sin que la Taq polimerasa se dae.

La temperatura se baja a 60C. Los primers

se unen de nuevo a las secuencias complementarias.

La Taq polimerasa

vuelve a sintetizar

ADN.
Logrando al bajar a 60C y subir a 72C,

que se sinteticen ahora 4 molculas de ADN al final del segundo ciclo.

El proceso general consiste en una serie de

20 a 35 ciclos.

VIDEO

 ELONGACION FINAL Etapa nica llevada a cabo a una temperatura de 70-74C durante 5-15 min tras el ltimo ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado.

CONSERVACIN: Se lleva a cabo a 4-15C durante un tiempo indefinido para conservar la reaccin a corto plazo.
VERIFICACIN: a) Se emplean tcnicas de electroforesis, separando los fragmentos de ADN generados de acuerdo a su carga. b) Se emplea soporte de agarosa para fragmentos grandes; acrilamida, para los ms pequeos; y, de forma ms rpida y aplicable a la PCR asociada a marcaje fluorescente, la electroforesis capilar. c) Los tamaos de los productos de la PCR vienen determinados por un marcador de peso molecular de ADN, el cual contiene fragmentos de ADN de tamao conocido, y que se corre en el gel junto con los productos de PCR.

Es una tcnica comn y normalmente indispensable en laboratorios de investigacin mdica y biolgica para una gran variedad de aplicaciones
Identificacin de virus y bacterias causantes de enfermedades Clonacin de ADN para la secuenciacin

Deteccin y diagnstico de enfermedades infecciosas

Test de paternidad

PCR

Filogenia basada en ADN

Identificacin de huellas genticas (forense) Diagnstico de trastornos hereditarios

Anlisis funcional de genes